華通膠修飾的聚己內(nèi)酯靜電紡絲人工血管支架的構(gòu)建及性能分析

何芳玲, 蔣廷波

血管移植術(shù)在治療心血管疾病方面應(yīng)用廣泛,包括冠狀動(dòng)脈旁路移植、血液透析以及糖尿病下肢血管病變等[1]。然而,有限性的自體血管供體嚴(yán)重制約了其臨床應(yīng)用,且目前尚無(wú)小口徑人工血管的商業(yè)產(chǎn)品在臨床應(yīng)用,而小口徑人工血管移植的高再狹窄率也是當(dāng)前亟須解決的難題[2-3]。人工血管材料普遍存在血液相容性較差、血管堵塞率高、與自體血管順應(yīng)性不匹配等問(wèn)題[4]。因此,制備綜合性能優(yōu)良的小口徑可降解人工血管成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。臍帶作為一種非病理性可獲取的組織,是組織工程中理想的天然材料之一[5]。華通膠(Wharton′s jelly,WJ)是臍帶血管周?chē)酿ひ航Y(jié)締組織,含有多種類(lèi)型的膠原蛋白和黏多糖,以及由間充質(zhì)干細(xì)胞合成的生長(zhǎng)因子和(或)細(xì)胞因子,因此可視為細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的天然來(lái)源[6]。WJ富含膠原蛋白、透明質(zhì)酸等基質(zhì),具有支架所需的許多獨(dú)特的生化特性,是制備人工血管支架的理想天然材料,但WJ基質(zhì)力學(xué)強(qiáng)度較差,且單獨(dú)應(yīng)用無(wú)法進(jìn)行靜電紡絲。聚己內(nèi)酯(polycaprolactone,PCL)是一種生物降解性聚合物,在生物醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。使用靜電紡絲技術(shù)制備的PCL纖維具有力學(xué)性能、生物相容性、可調(diào)性、可控性良好以及高比表面積等優(yōu)點(diǎn)。本研究采用脫細(xì)胞技術(shù)解離出WJ基質(zhì),經(jīng)與PCL復(fù)合后采用靜電紡絲技術(shù)制備出具有典型納米纖維結(jié)構(gòu)、完好生物力學(xué)特性、理想血液相容性以及能有效抑制血小板沉積的WJ/PCL靜電紡絲人工血管支架,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 新鮮臍帶組織由復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院捐贈(zèng),共10條,來(lái)源于20～30歲健康產(chǎn)婦,捐贈(zèng)者知情同意。研究獲蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)SUDA20210711A06)。胰蛋白酶、六氟異丙醇、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。H&E染色試劑盒、DAPI染色試劑盒、Safranin-O染色試劑盒、Toluidine blue染色試劑盒、Sirius red染色試劑盒、Alcian blue染色試劑盒、DNA定量試劑盒、糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)定量試劑盒、羥脯氨酸定量試劑盒和活性因子酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Yeasen公司(中國(guó)上海)。

1.2脫細(xì)胞WJ基質(zhì)的制備 收集臍帶,于清水下將殘留血跡沖洗干凈,浸泡于75%酒精30 min。超凈臺(tái)紫外線照射30 min,實(shí)驗(yàn)器械提前滅菌。鋪上無(wú)菌巾,用剪刀將臍帶組織沿著血管裁開(kāi),用有齒鑷以適當(dāng)力度緊鉗住血管(兩條動(dòng)脈、一條靜脈)兩側(cè)壁,確保血管剝離干凈,然后多次反復(fù)剝離臍帶外膜組織,直至完全去除干凈。使用無(wú)菌手術(shù)剪將分離的WJ切成0.5 cm的小塊,然后將WJ置于0.025%胰蛋白酶中(WJ與胰蛋白酶的比例為1 g∶5 mL),37 ℃下用磁力攪拌器攪拌消化24 h。將攪拌的懸浮液以16 000 g條件離心10 min,100 μm過(guò)濾器過(guò)濾,收集上清液。加入10% FBS以抑制胰蛋白酶反應(yīng),并將所得的WJ基質(zhì)存貯在PBS中,4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3WJ基質(zhì)脫細(xì)胞前后生化成分檢測(cè) 將脫細(xì)胞前后的WJ基質(zhì)標(biāo)本置于4%的多聚甲醛中固定24 h,行梯度酒精脫水、石蠟包埋,并切成5 μm厚度的組織切片。通過(guò)H&E染色觀察標(biāo)本的膠原纖維以及細(xì)胞核,DAPI染色驗(yàn)證標(biāo)本的細(xì)胞核成分,Safranin-O染色評(píng)價(jià)標(biāo)本的GAG成分,Toluidine blue染色檢測(cè)標(biāo)本的蛋白質(zhì)成分,Sirius red染色評(píng)價(jià)標(biāo)本的纖維成分,Alcian blue染色檢測(cè)標(biāo)本的透明質(zhì)酸成分。將脫細(xì)胞前后的WJ基質(zhì)標(biāo)本置于木瓜蛋白酶溶液中消化12 h,采用DNA定量試劑盒檢測(cè)標(biāo)本中的DNA含量,并應(yīng)用GAG定量試劑盒檢測(cè)標(biāo)本中的GAG含量,采用羥脯氨酸定量試劑盒測(cè)定標(biāo)本中的羥脯氨酸含量。

1.4WJ基質(zhì)脫細(xì)胞前后生物活性因子含量測(cè)定 將WJ基質(zhì)脫細(xì)胞前后的標(biāo)本置于木瓜蛋白酶溶液中消化12 h后收集提取物,應(yīng)用ELISA法測(cè)定血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF-2)。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.5PCL和WJ/PCL靜電紡絲人工血管支架制備

將PCL和WJ/PCL(重量比為50∶50)混合物溶解于六氟異丙醇中,調(diào)節(jié)溶液濃度為12%(質(zhì)量/體積比),磁力攪拌器恒定攪拌24 h,使之完全溶解,得到PCL和WJ/PCL紡絲液。應(yīng)用21G醫(yī)用金屬注射器作為噴絲器,將注射器的針頭擰緊后將體部夾于精確注射器泵上。調(diào)節(jié)設(shè)置靜電紡絲儀的參數(shù),高壓電源設(shè)置為15 kV,注射泵層流速度設(shè)置為1.0 mL/h,室溫調(diào)為25 ℃,環(huán)境濕度為40%～50%,紡絲時(shí)間為3～6 h。使用鋁箔(150 mm×150 mm)接地接收,調(diào)整接收距離為12 cm,啟動(dòng)設(shè)備開(kāi)始靜電紡絲過(guò)程。靜電紡絲完成后將樣本小心地取下,放置于真空室中進(jìn)行通風(fēng)48 h,揮發(fā)去除有機(jī)溶劑殘留,并在50 mL PBS中加入48 mL碳化二亞胺鹽酸鹽(carbodiimide hydrochloride,EDC)溶液和6 mL N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)(pH=5.5)處理;在-4 ℃條件下放置24 h達(dá)到充分交聯(lián)。然后在去離子水中沖洗納米電紡支架,去除未反應(yīng)的EDC和NHS,并置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干以備后續(xù)使用。

1.6PCL和WJ/PCL靜電紡絲人工血管支架的理化性能表征 首先采用單反相機(jī)進(jìn)行拍攝。隨后其納米纖維的表面形態(tài)和尺寸可直接在掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)下觀察,并通過(guò)Image J軟件分析其纖維直徑分布。另外,通過(guò)傅立葉紅外光譜(Fourier-transform infrared spectroscopy,FTIR)檢測(cè)PCL、WJ和WJ/PCL樣本的化學(xué)成分構(gòu)成。

1.7力學(xué)性能檢測(cè) 通過(guò)對(duì)PCL和WJ/PCL靜電紡絲人工血管支架施加壓縮載荷來(lái)評(píng)估其單軸機(jī)械性能。將PCL和WJ/PCL靜電紡絲人工血管支架切割成統(tǒng)一大小(4 cm×1 cm,n=4),夾子固定支架的兩端,使用材料測(cè)試機(jī)(HY-940FS,恒宇儀器有限公司,中國(guó)上海)以10 mm/min的壓縮速度進(jìn)行機(jī)械性能測(cè)試,從而測(cè)定壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線、極限拉伸應(yīng)力和斷裂拉伸率。

1.8溶血實(shí)驗(yàn) 將從兔頸動(dòng)脈提取的動(dòng)脈血與PCL和WJ/PCL靜電紡絲人工血管支架共混進(jìn)行直接溶血實(shí)驗(yàn)。分為PCL組和WJ/PCL組、陽(yáng)性對(duì)照組(水)和陰性對(duì)照組(PBS)四組,每組重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。其中PCL組為4 mL血液+10 mL PBS+PCL支架共混;WJ/PCL組為4 mL血液+10 mL PBS+WJ/PCL支架共混;陽(yáng)性對(duì)照組為4 mL血液+10 mL水共混;陰性對(duì)照組為4 mL血液+10 mL PBS共混。應(yīng)用分光光度計(jì)在545 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。

1.9血小板黏附實(shí)驗(yàn) 采集兔新鮮的血液樣品,離心分離血小板,獲取血小板懸液。將1 mL的血小板懸液分配到96孔微孔板中,并置于恒溫、恒濕的培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育,允許血小板分別直接與PCL和WJ/PCL支架進(jìn)行黏附。借助顯微鏡進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)。通過(guò)計(jì)數(shù)器或格點(diǎn)計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)樣本中的血小板數(shù)目,即可得到每平方毫米面積的血小板數(shù)量。血小板黏附量=視野中血小板數(shù)量×視野面積/樣品總面積。

2 結(jié)果

2.1WJ脫細(xì)胞處理有效性驗(yàn)證 WJ基質(zhì)經(jīng)過(guò)脫細(xì)胞處理后略有溶脹(見(jiàn)圖1a1、b1)。H&E染色顯示,脫細(xì)胞后的WJ基質(zhì)基本無(wú)細(xì)胞核成分(見(jiàn)圖1a2、b2)。DAPI染色也顯示脫細(xì)胞后的WJ基質(zhì)基本無(wú)藍(lán)色深染的細(xì)胞核成分(見(jiàn)圖1a3、b3)。DNA定量檢測(cè)結(jié)果表明脫細(xì)胞處理后WJ基質(zhì)DNA含量顯著降低[(0.94±0.39)ng/mg vs(14.42±1.09)ng/mg;t=23.320,P=0.001],見(jiàn)圖1c。

a1、b1.WJ基質(zhì)脫細(xì)胞處理前后的大體照片;a2、b2.WJ基質(zhì)脫細(xì)胞處理前后的H&E染色照片;a3、b3.WJ基質(zhì)脫細(xì)胞處理前后的DAPI染色照片;c.WJ基質(zhì)脫細(xì)胞處理前后的DNA含量比較,*P<0.05

a1、b1.WJ基質(zhì)脫細(xì)胞處理前后的Safranin-O染色照片;a2、b2.WJ基質(zhì)脫細(xì)胞處理前后的Toluidine blue染色照片;a3、b3.WJ基質(zhì)脫細(xì)胞處理前后的Sirius red染色照片;a4、b4.WJ基質(zhì)脫細(xì)胞處理前后的Alcian blue染色照片;c.WJ基質(zhì)脫細(xì)胞處理前后的GAG水平比較;d.WJ脫細(xì)胞處理前后的羥脯氨酸水平比較,*P<0.05

2.2WJ脫細(xì)胞處理前后的生化成分變化分析結(jié)果

Safranin-O染色結(jié)果顯示,WJ基質(zhì)脫細(xì)胞前后均有大量紅色陽(yáng)性深染的GAG成分(見(jiàn)圖2a1、b1)。Toluidine blue染色結(jié)果顯示,WJ基質(zhì)脫細(xì)胞前后均有大量藍(lán)色陽(yáng)性深染的蛋白質(zhì)成分(見(jiàn)圖2a2、b2)。Sirius red染色結(jié)果顯示,WJ基質(zhì)脫細(xì)胞前后均有大量橙紅色陽(yáng)性深染的纖維成分(見(jiàn)圖2a3、b3)。Alcian blue染色結(jié)果顯示,WJ基質(zhì)脫細(xì)胞前后均有大量陽(yáng)性淺藍(lán)色的透明質(zhì)酸成分(見(jiàn)圖2a4、b4)。WJ基質(zhì)在脫細(xì)胞處理后GAG[(8.49±0.88)μg/mg vs (11.47±0.90)μg/mg;t=4.754,P=0.001]和羥脯氨酸[(48.53±4.59)μg/mg vs (58.23±5.83)μg/mg;t=2.614,P=0.031]含量顯著降低,見(jiàn)圖2c、d。

2.3WJ脫細(xì)胞處理前后的活性因子變化分析結(jié)果

WJ基質(zhì)脫細(xì)胞處理前后VEGF水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖3?。WJ基質(zhì)脫細(xì)胞處理后PDGF、TGF-β1、FGF-2水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖3?～?。

?WJ基質(zhì)脫細(xì)胞處理前后VEGF水平比較:(1.14±0.09)ng/μg vs (0.97±0.14)ng/μg;t=2.068,P=0.072。?WJ基質(zhì)脫細(xì)胞處理前后PDGF水平比較:(0.70±0.08)ng/μg vs (0.56±0.07)ng/μg;t=2.752,P=0.025。?WJ基質(zhì)脫細(xì)胞處理前后TGF-β1水平比較:(0.18±0.03)ng/μg vs (0.12±0.02)ng/μg;t=3.313,P=0.011。?WJ基質(zhì)脫細(xì)胞處理前后FGF-2水平比較:(0.19±0.04)ng/μg vs (0.13±0.03)ng/μg;t=2.952,P=0.018。*P<0.05,ns為P>0.05

2.4WJ/PCL靜電紡絲人工血管支架的制備結(jié)果

PCL(見(jiàn)圖4a1、a2)和WJ/PCL(見(jiàn)圖4b1、b2)靜電紡絲人工血管支架均具有典型的管狀結(jié)構(gòu),外觀呈白色纖維樣,與天然血管的大體觀類(lèi)似。SEM顯微照片顯示,PCL和WJ/PCL靜電紡絲人工血管支架均具有明顯的納米纖維結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖4a3、b3)。PCL和WJ/PCL靜電紡絲人工血管具有相似的纖維直徑分布,集中在0.1～1.0 μm(見(jiàn)圖4c、d)。FTIR檢測(cè)結(jié)果顯示,PCL的特征峰出現(xiàn)在1 738 cm-1和2 973 cm-1,WJ的特征峰出現(xiàn)在1 432 cm-1和1 489 cm-1,而WJ/PCL同時(shí)出現(xiàn)了PCL和WJ的特征峰,說(shuō)明在WJ/PCL靜電紡絲人工血管支架中同時(shí)存在WJ和PCL成分,見(jiàn)圖4e。

a1、a2.PCL靜電紡絲人工血管支架的大體照片,其中a1為俯視圖,a2為側(cè)視圖;b1、b2.WJ/PCL靜電紡絲人工血管支架的大體照片,其中b1為俯視圖,b2為側(cè)視圖;a3.PCL靜電紡絲人工血管支架的SEM照片;b3.WJ/PCL靜電紡絲人工血管支架的SEM照片;c.PCL靜電紡絲人工血管支架的纖維直徑分布;d.WJ/PCL靜電紡絲人工血管支架的纖維直徑分布;e.WJ/PCL、WJ和PCL的FTIR分析圖譜,其中紅色箭頭指示PCL的特征峰,黑色箭頭指示W(wǎng)J的特征峰

2.5WJ/PCL靜電紡絲人工血管支架的生物力學(xué)分析結(jié)果 隨著壓縮應(yīng)變的增加,PCL和WJ/PCL靜電紡絲人工血管支架的壓縮應(yīng)力均顯著上升,但是PCL組上升趨勢(shì)明顯高于WJ/PCL組(見(jiàn)圖5?)。極限拉伸應(yīng)力定量分析結(jié)果顯示,PCL組極限拉伸應(yīng)力高于WJ/PCL組[(7.22±0.53)MPa vs (6.20±0.32)MPa;t=3.285,P=0.011],見(jiàn)圖5?。PCL組斷裂拉伸率低于WJ/PCL組[(71.22±5.11)% vs (86.40±2.19)%;t=5.461,P=0.001],見(jiàn)圖5?。

?PCL和WJ/PCL靜電紡絲人工血管支架的壓縮力學(xué)曲線圖;?PCL和WJ/PCL靜電紡絲人工血管支架的極限拉伸應(yīng)力比較;?PCL和WJ/PCL靜電紡絲人工血管支架的斷裂拉伸率比較。*P<0.05

2.6WJ/PCL靜電紡絲人工血管支架的溶血性分析結(jié)果 將血液分別與水、PCL靜電紡絲人工血管支架、WJ/PCL靜電紡絲人工血管支架和PBS共孵育30 min,結(jié)果顯示水和PCL靜電紡絲人工血管支架均出現(xiàn)溶血現(xiàn)象,而WJ/PCL靜電紡絲人工血管支架和PBS均未出現(xiàn)溶血現(xiàn)象,見(jiàn)圖6?。定量分析結(jié)果表明,陽(yáng)性對(duì)照組和PCL組的545 nm處的吸光度值顯著高于WJ/PCL組和陰性對(duì)照組,見(jiàn)圖6?。

?血液分別與水、PCL靜電紡絲人工血管支架、WJ/PCL靜電紡絲人工血管支架和PBS共孵育30 min的大體照片;?四組共孵育30 min后545 nm處的吸光度值比較,*P<0.05,ns為P>0.05

2.7WJ/PCL靜電紡絲人工血管支架的血小板沉積性能分析結(jié)果 PCL組的血小板沉積量高于WJ/PCL組[(35 684±1 360)血小板/mm2vs (5 726±753)血小板/mm2;t=38.530,P<0.001],見(jiàn)圖7。

圖7 PCL和WJ/PCL靜電紡絲人工血管支架的血小板沉積水平比較圖(*P<0.05)

3 討論

3.1在臨床中,理想的血管修復(fù)重建方法應(yīng)能及時(shí)修復(fù)血管、恢復(fù)血運(yùn),并在體內(nèi)形成自體血管,從而保持長(zhǎng)期通暢。組織工程技術(shù)提供了實(shí)現(xiàn)小血管修復(fù)的理想途徑[7]。如何制備綜合性能優(yōu)良的小口徑可降解人工血管是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和亟須解決的難題。近年來(lái),聯(lián)合使用天然材料和合成材料制備血管支架是一種全新、切實(shí)可行的思路[8]。

3.2ECM是血管組織中的主要成分,含有大量直徑在幾十到幾百納米之間的納米纖維[9]。近年來(lái),天然來(lái)源的ECM得到了廣泛的研究[10-12]。作為一種新型的、從健康人類(lèi)WJ提取的完整ECM,WJ基質(zhì)含有大量有利于血管再生的生化成分和生物活性因子[13]。WJ富含膠原蛋白、透明質(zhì)酸等基質(zhì),具有支架所需的許多獨(dú)特的生化特性。此外,WJ是肽類(lèi)生長(zhǎng)因子的豐富來(lái)源,尤其是VEGF、PDGF、TGF-β1和FGF-2,都與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、合成和ECM重塑有關(guān)[14]。因此,WJ基質(zhì)是制備人工血管支架的理想天然材料。

3.3本研究提出使用WJ基質(zhì)制備可仿生天然ECM微環(huán)境的人工血管支架。然而從人體組織中提取的ECM在恢復(fù)其所有功能成分方面可能具有挑戰(zhàn)性。通常采用機(jī)械、化學(xué)和酶法來(lái)分離ECM。本研究選擇使用酶法分離完整的ECM,以簡(jiǎn)化分離過(guò)程,更重要的是,可使ECM含有組織保持在相對(duì)生理狀態(tài)。結(jié)果顯示,基于胰蛋白酶對(duì)WJ進(jìn)行脫細(xì)胞處理,可在充分去除細(xì)胞核成分的同時(shí)有效保留天然WJ基質(zhì)的生物活性分子,包括VEGF、PDGF、TGF-β1、FGF-2等,在維持血管功能中具有重要意義[15]。這些生物活性因子載入WJ/PCL靜電紡絲納米纖維后會(huì)緩慢釋放,未來(lái)研究將進(jìn)一步探索其緩釋曲線,并在體內(nèi)應(yīng)用于修復(fù)血管組織,以驗(yàn)證其維持血管功能的實(shí)際功效。

3.4在眾多合成材料中,PCL具有化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣、生物相容性好、降解可控、易加工、力學(xué)可調(diào)等優(yōu)越特性[16]。通過(guò)3D打印、共軛紡紗、熔噴紡絲、雙螺桿擠出、發(fā)泡成型等技術(shù),可以加工成各種形狀[17]。此外,PCL纖維還具有合理的孔徑和孔隙率,其仿生ECM的三維結(jié)構(gòu)能增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞在支架上的黏附、延伸和擴(kuò)散,加速內(nèi)皮化過(guò)程。有研究表明,PCL可以通過(guò)靜電紡絲技術(shù)制備成規(guī)整的納米纖維[18]。因此,PCL納米纖維是構(gòu)建人工血管的理想材料來(lái)源。

3.5靜電紡絲技術(shù)具有特殊的性能,在利用高壓靜電場(chǎng)的驅(qū)動(dòng)下,能夠?qū)⒎夏繕?biāo)組織生物、物理和化學(xué)需求的聚合物溶液瞬間拉成纖維,并使纖維固化沉積到纖維收集器上,從而制作納米級(jí)的組織工程復(fù)合型支架[19]。通過(guò)靜電紡絲制備的組織工程支架形態(tài)結(jié)構(gòu)與天然ECM結(jié)構(gòu)相似,納米纖維表面積與體積比高,孔徑分布廣泛,孔隙率適宜,形象具有可控性,力學(xué)性能可調(diào),從而更好地模擬天然ECM[20]。這些物理特性將促進(jìn)種植細(xì)胞產(chǎn)生良好的生物反應(yīng),包括增強(qiáng)細(xì)胞黏附、增殖和分化,有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的滲透和運(yùn)輸,促進(jìn)細(xì)胞間交流和有效的細(xì)胞應(yīng)答等[21]。此外,靜電紡絲技術(shù)具有工藝簡(jiǎn)單、設(shè)備易得、制造成本較低、適用的材料種類(lèi)多、工藝技術(shù)可控性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),已成為制備納米纖維的主要方法之一[22]。綜上,靜電紡絲技術(shù)有望在血管組織工程中發(fā)揮重要作用。

3.6人工血管支架在血管再生中扮演著重要的生物力學(xué)、血液相容性和抑制血小板沉積角色。人工血管支架的生物力學(xué)對(duì)于血管再生的意義包括:(1)支撐和穩(wěn)定性。(2)優(yōu)化血流動(dòng)力學(xué)。(3)促進(jìn)內(nèi)皮化和血管再生。優(yōu)秀的生物力學(xué)性能對(duì)于人工血管的設(shè)計(jì)和制備至關(guān)重要,可直接影響人工血管在體內(nèi)的功能和耐用性,從而提高手術(shù)成功率并改善患者生活質(zhì)量[23]。此外,人工血管支架的溶血性對(duì)于血管重建意義重大[24],選擇溶血性較低的支架材料有助于避免溶血反應(yīng),維持良好的血流,提高細(xì)胞相容性,并降低并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn),從而促進(jìn)血管重建的成功。血小板是血液中的一種細(xì)胞,其主要功能是參與止血和血栓形成。在人工血管中,抑制血小板沉積的能力對(duì)于防止血栓形成、減少血管堵塞和保持血流暢通具有重要意義[25]。PCL靜電紡絲具有足夠的力學(xué)強(qiáng)度,適用于人工血管支架。本研究中WJ/PCL靜電紡絲人工血管支架的力學(xué)性能較單純PCL略低,可用于人工血管重建。此外,在溶血性評(píng)估試驗(yàn)中,相較于水和PCL,WJ/PCL靜電紡絲人工血管支架具有與PBS同等的吸光度數(shù)值,表明其有良好的血液相容性。定量分析結(jié)果也顯示,相較于PCL,WJ/PCL靜電紡絲人工血管支架的血小板沉積數(shù)量極低,證明其可有效抑制血小板黏附。這些良好的特質(zhì)為其后續(xù)用于血管重建提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

3.7WJ/PCL靜電紡絲人工血管抑制溶血性的機(jī)制主要有以下幾個(gè)方面:(1)WJ具有良好的細(xì)胞相容性,能夠與周?chē)纳锝M織相容,減少異物反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。在支架材料與患者的血液和細(xì)胞相互作用時(shí),減少細(xì)胞破裂和溶血現(xiàn)象的發(fā)生。(2)WJ在體內(nèi)不易被免疫系統(tǒng)識(shí)別為異物,不會(huì)引發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng),進(jìn)而降低了溶血反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。(3)WJ/PCL靜電紡絲人工血管穩(wěn)定且致密的物理結(jié)構(gòu)減少了血管內(nèi)紅細(xì)胞破裂和血紅蛋白釋放,從而降低了溶血性。(4)WJ含有一些生物活性物質(zhì),有助于促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和修復(fù),從而減少細(xì)胞破裂和溶血現(xiàn)象[26]。

綜上所述,本研究采用胰蛋白酶法對(duì)WJ基質(zhì)進(jìn)行脫細(xì)胞處理后可以有效去除WJ的細(xì)胞核成分,并保留WJ基質(zhì)的絕大部分生化成分以及生物活性因子。通過(guò)靜電紡絲技術(shù)成功制備具有典型納米纖維結(jié)構(gòu)的WJ/PCL靜電紡絲人工血管支架,具有良好的生物力學(xué)特性、血液相容性和抑制血小板黏附能力,為血管重建提供了一種極具應(yīng)用前景的人工血管支架選擇。