水力空化處理對大豆分離蛋白與兒茶素相互作用及結(jié)構(gòu)功能特性的影響

謝歡歡，任仙娥，宋楊鳳，楊 鋒

（廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西高校糖資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西柳州螺螄粉工程技術(shù)研究中心，廣西 柳州 545006）

蛋白質(zhì)是生命的基石，是健康飲食的重要組成部分，隨著世界人口的增加和生活水平的提高，人類對蛋白質(zhì)的需求量越來越大。然而，動物蛋白不僅成本高，大量養(yǎng)殖還會導(dǎo)致水資源進(jìn)一步枯竭、溫室氣體排放、抗生素耐藥性等全球性社會問題的加劇[1]。選擇植物蛋白是未來滿足人類蛋白質(zhì)需求、改善蛋白質(zhì)平衡、減少攝入與動物蛋白相關(guān)的脂肪、促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有效途徑。大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）是一種重要的植物蛋白，具有高營養(yǎng)價值、低生產(chǎn)成本、優(yōu)良的生物相容性和加工特性，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、農(nóng)業(yè)、生物技術(shù)等領(lǐng)域[2]。但天然SPI很難同時滿足不同食品體系對其功能性質(zhì)的需求。為拓寬其市場應(yīng)用，可以通過修飾SPI的結(jié)構(gòu)改善其功能特性。生物小分子物質(zhì)常與蛋白質(zhì)相互作用，影響其結(jié)構(gòu)和功能特性[3]。兒茶素作為一種多酚類小分子物質(zhì)，是膳食中重要的營養(yǎng)成分，可作為食品添加劑改善食品的風(fēng)味和質(zhì)地。兒茶素還具有很強(qiáng)的抗炎、抗菌和抗氧化等生理活性，可以清除自由基、減少炎癥，有助于預(yù)防心血管疾病[4]。

多酚可通過氫鍵、離子鍵、疏水相互作用等非共價的方式與蛋白質(zhì)結(jié)合，還可通過C—N鍵或C—S鍵與蛋白質(zhì)進(jìn)行共價結(jié)合。蛋白質(zhì)和多酚之間的相互作用會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能和營養(yǎng)特性等發(fā)生較大變化[5]。因此，更好地了解蛋白質(zhì)與多酚之間的相互作用，對于它們在食品工業(yè)中的應(yīng)用至關(guān)重要。Rani等[6]發(fā)現(xiàn)，蘆丁和表兒茶素與大豆蛋白結(jié)合后，均能改善大豆蛋白的成膜性能，使膜的抗拉強(qiáng)度增加。Guo Yang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白與單寧酸在堿性條件下（pH 9.0～11.0）能共價結(jié)合，并且隨著單寧酸濃度的增加，大豆蛋白凝膠硬度、彈性、儲能模量和損耗能量也增大，凝膠的微觀結(jié)構(gòu)也變得更加致密。Xue Feng等[8]發(fā)現(xiàn)，花青素-2-半乳糖苷作用于大豆蛋白后，能降低蛋白質(zhì)的表面疏水性和平均粒徑，使其具有更好的溶解性和熱穩(wěn)定性。Jiang Lianzhou等[9]研究發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白與花青素的相互作用能提高蛋白質(zhì)的抗氧化活性。這些結(jié)果表明，利用多酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用不僅可以調(diào)控蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)還能賦予蛋白質(zhì)一些生物活性，具有較好的應(yīng)用前景。

加工技術(shù)可對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，同時也可促進(jìn)蛋白質(zhì)與多酚的相互作用，改善蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)，以滿足不同食品體系的需求。Liu Jiayuan等[10]研究發(fā)現(xiàn)，超聲的空化和剪切作用可以破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)分子展開，暴露出更多的結(jié)合位點(diǎn)；同時，超聲的空化效應(yīng)作用于H2O分子，產(chǎn)生氫自由基、氧自由基和羥自由基，促進(jìn)蛋白質(zhì)與多酚的結(jié)合。嵇威等[11]也發(fā)現(xiàn)，動態(tài)高壓微射流通過高速撞擊、高頻剪切等一系列高強(qiáng)度作用使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，促進(jìn)蛋白質(zhì)與多酚結(jié)合。水力空化技術(shù)作為一種新興的加工技術(shù)，是流體流經(jīng)孔板、文丘里管、葉輪或轉(zhuǎn)子時，由于流速的突然變化引起壓力波動，產(chǎn)生空化泡，當(dāng)空化泡潰滅時產(chǎn)生與超聲類似的空化效應(yīng)，如剪切力、沖擊波、極端高溫和高壓、自由基等，這些效應(yīng)能誘導(dǎo)或加速物質(zhì)的物理或化學(xué)變化[12]。Niveditha等[13]研究發(fā)現(xiàn)，水力空化能破壞蛋清蛋白分子間的氫鍵和疏水相互作用，降低蛋白的黏度，改善其起泡性、乳化性和凝膠性，提高體外消化率。Gregersen等[14]研究發(fā)現(xiàn)，乳清濃縮蛋白經(jīng)水力空化處理后，大的聚集體解聚，粒徑減小，黏度大幅度降低，貯藏穩(wěn)定性增強(qiáng)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，水力空化可引起大豆蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，進(jìn)而改善其功能性質(zhì)[15-16]?；诖?，本研究進(jìn)一步利用水力空化技術(shù)調(diào)控SPI與兒茶素的相互作用，開發(fā)制備功能性大豆蛋白的新技術(shù)，并從兒茶素與SPI相互作用模式和所形成復(fù)合物的結(jié)構(gòu)變化揭示水力空化調(diào)控多酚-大豆蛋白互作制備功能性植物蛋白的作用機(jī)制，為開發(fā)功能性大豆蛋白制備新技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI（蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90%）山東禹王生態(tài)食品有限公司；兒茶素（純度≥98%）西安天廣源生物科技有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）（分析純）上海源葉生物科技有限公司；5,5′二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5′-dithio bis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）（分析純）合肥巴斯夫生物科技有限公司；鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）（分析純）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（純度≥96%）、2,2′-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）（純度≥98%）上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AE2204電子分析天平 湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；JXN-26冷凍高速離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特股份有限公司；DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器 河南予華儀器有限公司；Zetasizer Nano納米粒度及Zeta電位分析儀 英國Malvern公司；Chirascan圓二色光譜儀 英國Applied Photophysis公司；UV-2600紫外分光光度計(jì) 島津儀器（蘇州）有限公司；G9800A熒光分光光度計(jì) 美國安捷倫科技有限公司。

水力空化實(shí)驗(yàn)裝置由實(shí)驗(yàn)室自制，其結(jié)構(gòu)示意圖見圖1，由離心泵（功率550 W）、儲液罐、恒溫水箱、孔板（孔徑3 mm、厚度20 mm）、壓力表、閥門和管路（直徑18 mm）組成。當(dāng)流體流經(jīng)孔板時，流速突然增大，壓力降低，當(dāng)壓力低于該流體的飽和蒸汽壓時，流體汽化，同時溶解在流體中的氣體釋放產(chǎn)生大量空化泡，當(dāng)空化泡隨流體進(jìn)入下游壓力恢復(fù)區(qū)時，空化泡潰滅，從而產(chǎn)生空化效應(yīng)。

圖1 水力空化結(jié)構(gòu)裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of hydrodynamic cavitation device

1.3 方法

1.3.1 SPI-兒茶素復(fù)合物的制備

先將SPI和兒茶素分別充分溶解，然后將SPI分散液和兒茶素溶液混合，控制SPI質(zhì)量濃度為10 mg/mL，兒茶素質(zhì)量濃度分別為0.0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL，并調(diào)節(jié)pH值至7.0?；旌弦涸谑覝叵鲁掷m(xù)攪拌30 min后用上述水力空化裝置處理30 min。以繼續(xù)磁力攪拌30 min、不進(jìn)行水力空化處理的樣品作為實(shí)驗(yàn)對照組。處理后，5 000 r/min離心15 min，將上清液用截留分子質(zhì)量為8 000 Da的透析袋在純水條件下透析24 h，去除游離兒茶素，得到SPI-兒茶素復(fù)合物液體樣品，置于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.3.2 兒茶素與SPI結(jié)合量測定

參考金花等[17]的實(shí)驗(yàn)方法，樣品（0.5 mL，SPI質(zhì)量濃度0.1 mg/mL）與福林-酚試劑（2.5 mL，0.2 mol/L）避光反應(yīng)5 min后，加入2 mL 81.08 mg/mL Na2CO3溶液，繼續(xù)避光反應(yīng)2 h，測定760 nm波長處吸光度。以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品，兒茶素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，紫外吸收強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（y＝11.636x-0.008，R2＝0.999 4），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算復(fù)合物中兒茶素的質(zhì)量。兒茶素與SPI結(jié)合量用每克SPI結(jié)合兒茶素的質(zhì)量表示，按式（1）計(jì)算。

1.3.3 紫外吸收光譜分析

將SPI-兒茶素復(fù)合物用去離子水稀釋至SPI質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL，利用紫外分光光度計(jì)在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，掃描速率為中速，得到光譜曲線。

1.3.4 熒光光譜分析

將SPI-兒茶素復(fù)合物用磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.0）稀釋至SPI質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL，然后使用熒光光譜儀在室溫下進(jìn)行熒光測定。參數(shù)設(shè)置如下：激發(fā)波長290 nm，發(fā)射波長300～400 nm，狹縫寬度5 nm。

1.3.5 游離巰基含量測定

參考李菊名[18]的實(shí)驗(yàn)方法，將DTNB用Tris-Gly緩沖液（含0.09 mol/L Gly、0.086 mol/L Tris、4 mmol/L Na2EDTA、8 mol/L尿素，pH 8.0）配制成4 mg/mL的Ellman試劑，使用Tris-Gly緩沖液將SPI-兒茶素復(fù)合物稀釋至SPI質(zhì)量濃度為3 mg/mL，然后將稀釋樣品（5 mL）與Ellman試劑（50 μL）室溫下避光反應(yīng)1 h，測定412 nm波長處吸光度（A1）。用Tris-Gly緩沖液（50 μL）代替Ellman試劑（50 μL）作為對照組，測定412 nm波長處吸光度（A2），游離巰基含量按式（2）計(jì)算。

式中：13.6×104為摩爾吸光系數(shù)/（L/（mol·cm））；D為稀釋倍數(shù)；ρ為SPI質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.6 游離氨基含量測定

參考賈士芳[19]的方法，采用OPA方法測定SPI-兒茶素復(fù)合物游離氨基含量。首先配制OPA試劑：取4 mL 40 mg/mL OPA溶液（溶劑為甲醇），加入100 mL 0.1 mol/L硼砂溶液、400 μL巰基乙醇和10 mL 250 mg/mL十二烷基硫酸鈉溶液，定容至200 mL，然后進(jìn)行樣品測定。樣品溶液（400 μL，用去離子水調(diào)節(jié)SPI質(zhì)量濃度至2 mg/mL）與OPA試劑（3 mL）于35 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)3 min，測定340 nm波長處吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)品L-亮氨酸濃度為橫坐標(biāo)，紫外吸收強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（y＝0.789x+0.021，R2＝0.999 3），代入曲線方程計(jì)算得到游離氨基含量。

1.3.7 表面疏水性測定

參考劉紫薇等[20]的方法，用ANS作為熒光測定SPI-兒茶素復(fù)合物的表面疏水性。將SPI-兒茶素復(fù)合物用磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.0）稀釋至SPI質(zhì)量濃度為0.05～2.00 mg/mL。然后將稀釋樣品溶液（4 mL）與ANS溶液（20 μL，8 mmol/L）反應(yīng)，測定其熒光強(qiáng)度。參數(shù)設(shè)置如下：激發(fā)波長390 nm，發(fā)射波長470 nm，狹縫寬度5 nm。

1.3.8 平均粒徑和Zeta電位測定

將SPI-兒茶素復(fù)合物用去離子水稀釋至SPI質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，用0.45 μm濾膜過濾，然后用納米粒度及Zeta電位分析儀測定樣品的平均粒徑和Zeta電位。

1.3.9 圓二色光譜分析

將SPI-兒茶素復(fù)合物用去離子水稀釋至SPI質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL，然后在190～260 nm波長范圍掃描光譜曲線。掃描得到的光譜圖使用Pro-Data Chirascan軟件進(jìn)行后續(xù)處理，并使用CDNN軟件對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行擬合。

1.3.10 抗氧化性測定

1.3.10.1 DPPH自由基清除率測定

參考Dai Shicheng等[4]的實(shí)驗(yàn)方法，樣品（1 mL，SPI質(zhì)量濃度0.1 mg/mL）與DPPH-乙醇（2 mL，0.175 mol/L DPPH，吸光度0.70以下）避光反應(yīng)1 h，測定517 nm波長處吸光度A1。樣品與乙醇溶液（不添加DPPH）吸光度為A2，乙醇（不添加樣品）與DPPH-乙醇吸光度為A0。DPPH自由基清除率按式（3）計(jì)算。

1.3.10.2 ABTS陽離子自由基清除率測定

參考Jiang Lianzhou等[9]的方法，樣品（0.5 mL，SPI質(zhì)量濃度0.1 mg/mL）與ABTS溶液（7 mmol/LABTS、2.45 mmol/LK2S2O8，pH 7.4，吸光度0.70±0.02）室溫反應(yīng)18 min，測定734 nm波長處吸光度A1。樣品與磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）（不添加ABTS）吸光度為A2，磷酸鹽緩沖液（不添加樣品）與ABTS溶液吸光度為A0。ABTS陽離子自由基清除率按式（4）計(jì)算。

1.3.10.3 鐵離子還原能力測定

參考顧璐萍[21]的方法，充分混合樣品（0.3 mL，SPI質(zhì)量濃度10 mg/mL）、磷酸鹽緩沖液（3.0 mL，0.2 mol/L，pH 6.6）和K3[Fe(CN)6]溶液（3.0 mL，10.1 mg/mL），于50 ℃水浴反應(yīng)30 min，冷卻至室溫，加入三氯乙酸溶液（3.0 mL，111.11 mg/mL），混勻后靜置30 min，5 000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，與去離子水（3.0 mL）、FeCl3溶液（0.5 mL，1.00 mg/mL）室溫下反應(yīng)10 min，測定700 nm波長處吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)中圖表所示的數(shù)據(jù)均為3 次以上重復(fù)平行實(shí)驗(yàn)取得，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用方差分析中的鄧肯檢驗(yàn)及配對樣品t檢驗(yàn)計(jì)算數(shù)據(jù)間的差異顯著性，P＜0.05表示差異顯著，并使用Origin 2021軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 兒茶素與SPI結(jié)合量

由圖2 可知，未經(jīng)水力空化處理時，隨著兒茶素質(zhì)量濃度的增加，SPI與兒茶素的結(jié)合量顯著增加（P＜0.05），這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)上的結(jié)合位點(diǎn)遠(yuǎn)多于兒茶素分子的數(shù)量，所以兒茶素與SPI的結(jié)合量一直增加。當(dāng)兒茶素質(zhì)量濃度超過1.5 mg/mL，SPI與兒茶素的結(jié)合量不再發(fā)生顯著變化（P＞0.05），原因是此時蛋白質(zhì)上的結(jié)合位點(diǎn)趨于飽和，SPI無法結(jié)合更多的兒茶素。Dai Shicheng等[4]研究也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)兒茶素分子數(shù)量低于SPI上的結(jié)合位點(diǎn)時，兒茶素與SPI的結(jié)合量增加；當(dāng)兒茶素分子數(shù)量高于SPI上的結(jié)合位點(diǎn)時，兒茶素與SPI的結(jié)合量無明顯變化。

圖2 水力空化處理對兒茶素與SPI結(jié)合量的影響Fig.2 Effect of hydrodynamic cavitation treatment on the amount of catechin bound to SPI

在相同兒茶素質(zhì)量濃度下，經(jīng)水力空化處理后SPI與兒茶素的結(jié)合量較未處理組顯著增加（P＜0.05）。當(dāng)兒茶素質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時，水力空化處理能將兒茶素與SPI的結(jié)合量由處理前的（21.82±0.18）mg/g提高至（62.55±0.36）mg/g。原因是水力空化產(chǎn)生的剪切力等空化效應(yīng)使SPI的結(jié)構(gòu)展開，暴露出更多的活性基團(tuán)，促進(jìn)兒茶素與蛋白質(zhì)的結(jié)合，從而提高兒茶素與SPI結(jié)合量。此外，水力空化能夠產(chǎn)生羥自由基，這些自由基一方面能使兒茶素氧化成醌，醌再與蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈中的氨基或巰基反應(yīng)形成C—N或C—S鍵，促進(jìn)蛋白質(zhì)與兒茶素的共價結(jié)合；另一方面，這些自由基也能使蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的氨基酸殘基被氧化，然后蛋白質(zhì)分子上的自由基通過C—N或C—S鍵與兒茶素反應(yīng)，形成SPI-兒茶素共價結(jié)合物[22]。

2.2 SPI-兒茶素復(fù)合物紫外吸收光譜

紫外吸收光譜可以反映蛋白質(zhì)與兒茶素相互作用后的結(jié)構(gòu)變化，由于蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的發(fā)色團(tuán)如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等對紫外光有一定的吸收能力，而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的空間構(gòu)象發(fā)生變化時，發(fā)色團(tuán)的微環(huán)境會發(fā)生一定程度的改變，從而影響紫外吸收峰[19]。

由圖3可知，添加兒茶素后，SPI-兒茶素復(fù)合物的紫外吸收強(qiáng)度增加，且隨著兒茶素質(zhì)量濃度的增加，紫外吸收強(qiáng)度也明顯增加，這是因?yàn)閮翰杷嘏cSPI中的色氨酸和酪氨酸殘基間形成共軛體系，同時使π-π電子對能級發(fā)生躍遷，從而增強(qiáng)了紫外吸收強(qiáng)度。陳騏等[23]研究發(fā)現(xiàn)，黑米花青素作用于大豆7S/11S蛋白，使其紫外吸收強(qiáng)度增加。

圖3 水力空化處理對SPI-兒茶素復(fù)合物紫外吸收光譜的影響Fig.3 Effect of hydrodynamic cavitation treatment on the UV spectrum of SPI-catechin conjugates

同時，在相同兒茶素質(zhì)量濃度下，水力空化處理后的SPI-兒茶素復(fù)合物的紫外吸收強(qiáng)度高于未處理組，原因是水力空化使SPI的結(jié)構(gòu)展開，埋藏在蛋白分子內(nèi)部的酪氨酸和色氨酸等發(fā)色基團(tuán)暴露；同時，水力空化促進(jìn)了蛋白質(zhì)與兒茶素之間的結(jié)合，使二者間的作用力增強(qiáng)，SPI的構(gòu)象發(fā)生變化，從而引起紫外吸收強(qiáng)度的變化。

2.3 SPI-兒茶素復(fù)合物熒光光譜

在激發(fā)波長290 nm下，色氨酸殘基可在300～400 nm的發(fā)射波長中產(chǎn)生熒光。色氨酸殘基熒光強(qiáng)度的變化反映蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，因此可以表征蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化[24]。由圖4可知，添加兒茶素后，SPI-兒茶素復(fù)合物的熒光強(qiáng)度降低，且隨著兒茶素質(zhì)量濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸降低。發(fā)生這一現(xiàn)象的原因是蛋白質(zhì)與兒茶素相互作用后，改變了蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，使色氨酸殘基的包埋程度增加，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的熒光猝滅[25]。同時，添加兒茶素后，蛋白質(zhì)的最大吸收峰發(fā)生紅移，這是因?yàn)閮翰杷厥且环N極性很強(qiáng)的分子，使色氨酸殘基周圍的微環(huán)境發(fā)生改變，變得更加親水，從而表現(xiàn)出明顯的紅移現(xiàn)象[26]。另外，經(jīng)水力空化處理后，復(fù)合物的峰強(qiáng)度降低和紅移現(xiàn)象較未處理組更加明顯。這是因?yàn)樗栈幚泶龠M(jìn)了SPI與兒茶素的相互作用，使SPI結(jié)合了更多的兒茶素，導(dǎo)致熒光光譜的變化更明顯。

圖4 水力空化處理對SPI-兒茶素復(fù)合物熒光光譜的影響Fig.4 Effect of hydrodynamic cavitation treatment on the fluorescence spectrum of SPI-catechin conjugates

2.4 SPI-兒茶素復(fù)合物游離巰基和游離氨基含量

巰基和氨基對維持蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性至關(guān)重要，還可能影響蛋白質(zhì)的功能特性[27]。由表1可知，隨著兒茶素質(zhì)量濃度的增加，SPI-兒茶素復(fù)合物的游離巰基和游離氨基含量顯著降低（P＜0.05）。由于在測定游離氨基和巰基時使用了可以破壞非共價鍵的變性劑，如尿素和十二烷基硫酸鈉，因此游離巰基和游離氨基含量的降低主要?dú)w因于兒茶素與SPI在空氣中有氧的條件下通過C—N鍵和C—S鍵的共價結(jié)合。

表1 水力空化處理對SPI-兒茶素復(fù)合物游離巰基和游離氨基含量的影響Table 1 Effect of hydrodynamic cavitation treatment on free sulfhydryl and amino group contents of SPI-catechin conjugates

在相同兒茶素質(zhì)量濃度下，與未處理的SPI-兒茶素復(fù)合物相比，經(jīng)水力空化處理的復(fù)合物游離巰基和游離氨基含量更低，其原因可能是由于水力空化能促進(jìn)羥自由基的產(chǎn)生，因此，SPI中更多的游離巰基和氨基會被羥自由基氧化，使SPI成為活性蛋白，通過C—N鍵和C—S鍵與更多的兒茶素共價結(jié)合，導(dǎo)致游離巰基和游離氨基含量降低更多。

2.5 SPI-兒茶素復(fù)合物表面疏水性

蛋白質(zhì)表面疏水性可以反映疏水性氨基酸殘基在蛋白質(zhì)表面的分布，也可間接反映蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，是影響蛋白質(zhì)功能特性的一個重要因素[28]。由圖5可知，隨著兒茶素質(zhì)量濃度的增加，表面疏水性顯著降低（P＜0.05），這是由于添加兒茶素后，兒茶素與蛋白質(zhì)的疏水性氨基酸殘基相互作用，占用ANS探針與SPI表面疏水基團(tuán)的結(jié)合位點(diǎn)。這一結(jié)果與Xue Feng等[8]研究結(jié)果相似，該研究發(fā)現(xiàn)黑米花青素與SPI相互作用，能降低SPI的表面疏水性。Parolia等[29]研究也發(fā)現(xiàn)，槲皮素、蘆丁和鞣花酸均降低扁豆蛋白的表面疏水性。純SPI經(jīng)水力空化處理后表面疏水性顯著增加（P＜0.05），這是由于水力空化產(chǎn)生強(qiáng)烈的剪切力，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，疏水性氨基酸殘基暴露至蛋白質(zhì)表面。但是，在相同兒茶素質(zhì)量濃度下，水力空化處理后的SPI-兒茶素復(fù)合物的表面疏水性顯著低于未經(jīng)水力空化處理的復(fù)合物，這是因?yàn)樗栈龠M(jìn)了蛋白質(zhì)與更多兒茶素之間的結(jié)合，引入大量親水基團(tuán)，從而使復(fù)合物的表面疏水性降低。

圖5 水力空化處理對SPI-兒茶素復(fù)合物表面疏水性的影響Fig.5 Effect of hydrodynamic cavitation treatment on the surface hydrophobicity of SPI-catechin conjugates

2.6 SPI-兒茶素復(fù)合物平均粒徑

由圖6可知，添加兒茶素后，未經(jīng)水力空化處理的SPI-兒茶素復(fù)合物的平均粒徑顯著減?。≒＜0.05），且隨著兒茶素質(zhì)量濃度的增加，復(fù)合物的平均粒徑顯著減?。≒＜0.05），這是由于未經(jīng)水力空化處理的兒茶素與SPI間的相互作用增強(qiáng)，兒茶素與SPI主要以靜電相互作用、疏水相互作用、氫鍵等非共價的方式結(jié)合，形成了比較緊密的結(jié)構(gòu)，從而使平均粒徑減小。這與Dai Shicheng等[4]的研究結(jié)果一致，蛋白質(zhì)與兒茶素結(jié)合，復(fù)合物的平均粒徑減小。純SPI經(jīng)水力空化處理后平均粒徑顯著減小（P＜0.05），原因是水力空化產(chǎn)生的剪切力或沖擊波等空化效應(yīng)能破壞蛋白質(zhì)分子間的相互作用，使大聚集體解聚，粒徑減小。但是在添加兒茶素后，隨著兒茶素質(zhì)量濃度的增加，復(fù)合物平均粒徑顯著增加（P＜0.05），發(fā)生這一現(xiàn)象的原因是水力空化產(chǎn)生羥自由基，使SPI與兒茶素反應(yīng)形成共價復(fù)合物，形成大聚集體，復(fù)合物的平均粒徑增大。

圖6 水力空化處理對SPI-兒茶素復(fù)合物平均粒徑的影響Fig.6 Effect of hydrodynamic cavitation treatment on the average particle size of SPI-catechin conjugates

2.7 SPI-兒茶素復(fù)合物Zeta電位

Zeta電位與蛋白質(zhì)表面的電荷強(qiáng)度有關(guān)，反映靜電排斥或靜電吸引的強(qiáng)度[4]。由圖7可知，所有樣品都帶有負(fù)電荷，這是因?yàn)镾PI帶有大量負(fù)電荷。純SPI經(jīng)水力空化處理后Zeta電位絕對值顯著降低（P＜0.05），這說明水力空化處理使得蛋白質(zhì)分子發(fā)生破碎，改變了蛋白質(zhì)分子的電荷分布，蛋白質(zhì)內(nèi)帶正電荷的氨基酸（如賴氨酸、精氨酸）暴露，中和了蛋白質(zhì)表面的負(fù)電荷[30]。隨著兒茶素質(zhì)量濃度的增加，復(fù)合物的Zeta電位絕對值顯著增加（P＜0.05），其原因是兒茶素可以通過氫鍵和疏水相互作用等非共價鍵與SPI結(jié)合，也可以通過C—N鍵或C—S鍵等共價鍵與SPI結(jié)合，而兒茶素本身帶有負(fù)電荷，所以添加兒茶素增加了復(fù)合物所帶的負(fù)電荷。

圖7 水力空化處理對SPI-兒茶素復(fù)合物Zeta電位的影響Fig.7 Effect of hydrodynamic cavitation treatment on the zeta potential of SPI-catechin conjugates

2.8 SPI-兒茶素復(fù)合物圓二色光譜

圓二色光譜可以用于評價蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)依賴于氨基酸局部序列和分子不同部分之間的相互作用以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露程度[31]。由圖8可知，在190～260 nm波長范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的圓二色性發(fā)生改變，表明兒茶素復(fù)合物會導(dǎo)致SPI構(gòu)象轉(zhuǎn)變。蛋白質(zhì)分子中的二級結(jié)構(gòu)（α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲）相對含量的變化可以反映蛋白質(zhì)分子整體結(jié)構(gòu)的變化[32]。

圖8 水力空化處理對SPI-兒茶素復(fù)合物圓二色光譜的影響Fig.8 Effect of hydrodynamic cavitation treatment on the circular dichroism spectrum of SPI-catechin conjugates

由表2可知，添加兒茶素使SPI-兒茶素復(fù)合物的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角相對含量增加，β-折疊相對含量減小，無規(guī)卷曲無明顯變化。這說明SPI與兒茶素相互作用后在一定程度上改變了蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)多肽鏈二級結(jié)構(gòu)單元間氫鍵發(fā)生重排，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松動。這一結(jié)果與Zhou Siduo等[30]研究結(jié)果相似，該研究發(fā)現(xiàn)表沒食子兒茶素沒食子酸酯作用于SPI，使α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲相對含量增加，β-折疊相對含量減小。但是，金花等[17]研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸作用于黑豆蛋白導(dǎo)致α-螺旋相對含量減小、無規(guī)卷曲相對含量增加。二級結(jié)構(gòu)變化不一致主要是由于蛋白質(zhì)和多酚的結(jié)構(gòu)和種類不同，相互作用位點(diǎn)和模式也不同所導(dǎo)致的。

同時，在相同兒茶素質(zhì)量濃度下，與未處理組相比，水力空化處理后SPI-兒茶素復(fù)合物α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲相對含量增加，β-折疊相對含量減小。這一結(jié)果是因?yàn)榭栈?yīng)使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，蛋白質(zhì)與兒茶素之間的結(jié)合強(qiáng)度高于未經(jīng)水力空化處理的強(qiáng)度，因此對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響更加顯著[33]。

2.9 SPI-兒茶素復(fù)合物抗氧化性

DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除率和鐵離子還原能力是評價樣品抗氧化活性的常用方法[34]。由圖9可知，隨著兒茶素質(zhì)量濃度的增加，復(fù)合物的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率以及鐵離子還原能力均顯著增加（P＜0.05）。這是因?yàn)閮翰杷鼐哂谢钚苑恿u基，能作為H+與電子供體終止自由基鏈反應(yīng)，與SPI結(jié)合后能賦予其自由基清除能力。另外，兒茶素也是一種具有強(qiáng)還原性的物質(zhì)，其活性酚羥基可與鐵離子發(fā)生絡(luò)合作用，將Fe3+還原為Fe2+[35]，故復(fù)合物鐵離子還原能力也隨著兒茶素質(zhì)量濃度的增加而增加。但是當(dāng)兒茶素質(zhì)量濃度超過1.5 mg/mL時繼續(xù)增加兒茶素用量，未經(jīng)水力空化處理的SPI-兒茶素復(fù)合物的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率無顯著變化（P＞0.05）。這與兒茶素和SPI的結(jié)合量有關(guān)，圖2結(jié)果已表明，在兒茶素添加量為1.5 mg/mL時，二者的結(jié)合位點(diǎn)趨于飽和，因此，復(fù)合物的自由基清除率也趨于穩(wěn)定。

圖9 水力空化處理對SPI-兒茶素復(fù)合物抗氧化活性的影響Fig.9 Effect of hydrodynamic cavitation on the antioxidant activity of SPI-catechin conjugates

此外，在相同兒茶素質(zhì)量濃度下，水力空化處理后的SPI-兒茶素復(fù)合物的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率以及鐵離子還原能力顯著高于未處理組（P＜0.05），當(dāng)兒茶素添加量為2.0 mg/mL時，DPPH自由基清除率由處理前的（48.64±1.24）%上升至（84.72±0.12）%，ABTS陽離子自由基清除率由（35.60±1.21）%上升至（75.51±0.79）%，鐵離子還原能力由0.81±0.02上升至1.52±0.05。這是因?yàn)榻?jīng)水力空化處理的復(fù)合物具有更高的兒茶素結(jié)合量，引入了更多的酚羥基，發(fā)揮出更強(qiáng)的抗氧化活性。

3 結(jié)論

水力空化產(chǎn)生的剪切作用能使SPI的分子結(jié)構(gòu)展開，暴露出更多的結(jié)合位點(diǎn)，同時水力空化能夠產(chǎn)生羥自由基，這些自由基能使兒茶素氧化成醌，也能使蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的氨基酸殘基被氧化，促進(jìn)兒茶素與SPI之間的共價相互作用，從而使更多的兒茶素與SPI結(jié)合。通過紫外吸收光譜、熒光光譜和圓二色光譜分析，證實(shí)水力空化處理能促進(jìn)SPI-兒茶素復(fù)合物的形成，并使復(fù)合物的二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲相對含量增加，β-折疊相對含量減小。同時，由于更多兒茶素的引入，經(jīng)水力空化處理后的SPI-兒茶素復(fù)合物表現(xiàn)出更低的表面疏水性和游離氨基、巰基含量以及更高的抗氧化活性?？梢?，水力空化可作為一項(xiàng)有效的技術(shù)用于功能性食品蛋白質(zhì)的開發(fā)。所制備的SPI-兒茶素復(fù)合物可用于構(gòu)建抗氧化型乳液，實(shí)現(xiàn)食品中脂溶性易氧化營養(yǎng)與功能成分的有效載運(yùn)與可控釋放。

另外，本研究雖然通過紫外光譜、熒光光譜和圓二色光譜等技術(shù)對SPI-兒茶素復(fù)合物的二級和三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，但是這些技術(shù)尚不能確定SPI與兒茶素之間具體的結(jié)合位點(diǎn)，下一步研究將通過分子模擬與對接技術(shù)來確定二者的結(jié)合位點(diǎn)，以更好地揭示它們之間的相互作用。