副干酪乳桿菌FZU103對(duì)小鼠酒精性肝損傷的防控作用

梁梓華，李嘉儀，謝林惠，楊梓翊，尤適澤，吳 超，李文龍，艾連中，倪 莉，呂旭聰,*，陳有挺

（1.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，食品科學(xué)技術(shù)研究所，福建 福州 350108；2.福州大學(xué)先進(jìn)制造學(xué)院，食品營(yíng)養(yǎng)與健康研究中心，福建 晉江 362200；3.福建醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350004；4.上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海 200093；5.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽胰外科，福建 福州 350004）

酒精性肝損傷（alcoholic liver injury，ALI）是指慢性酒精濫用引起的一系列肝臟疾病，包括脂肪肝、肝炎、肝纖維化、肝硬化及肝癌等，這些肝臟疾病對(duì)人體健康產(chǎn)生不利影響[1-2]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展和人民物質(zhì)生活水平的持續(xù)提高，以及中華幾千年來(lái)傳統(tǒng)飲酒文化的影響，ALI在我國(guó)的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)[3]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家每年因酗酒導(dǎo)致的死亡病例約330萬(wàn) 人，近50%肝硬化病例由酗酒引起[4]。目前，ALI患病人數(shù)的不斷增加已成為全球面臨的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。因此，解析ALI的發(fā)病機(jī)理以及預(yù)防其發(fā)生和發(fā)展對(duì)于健康具有重要意義。

ALI的發(fā)病機(jī)制主要涉及肝臟氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝紊亂及膽汁酸循環(huán)失調(diào)等[5]。此外，有研究表明，肝臟代謝與腸道菌群之間存在密切聯(lián)系[6]。其中，腸道菌群對(duì)肝臟代謝功能的調(diào)控作用及維持人體健康至關(guān)重要。過(guò)量飲酒會(huì)導(dǎo)致腸道菌群組成發(fā)生顯著變化，尤其是抑制腸道中有益菌的生長(zhǎng)并促進(jìn)致病菌的過(guò)度繁殖，導(dǎo)致腸道菌群紊亂及腸道屏障功能受損[7]。益生菌可通過(guò)促進(jìn)脂肪酸氧化、下調(diào)炎癥信號(hào)傳導(dǎo)及調(diào)節(jié)腸道菌群預(yù)防或改善ALI[8]。作為主要的益生菌之一，乳酸菌具有抗氧化、緩解內(nèi)毒素積累、維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)等作用。其中，副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei，LP）是一種廣泛存在于人體腸道及奶酪、泡菜等發(fā)酵食品中的乳酸菌[9]。近年來(lái)，關(guān)于LP的益生功效及其應(yīng)用越來(lái)越受到關(guān)注，但有關(guān)LP防控ALI的研究鮮有報(bào)道。胡盼盼[10]研究發(fā)現(xiàn)，副干酪乳桿菌M5L能夠提高ALI小鼠的肝臟抗氧化能力；陳艷艷等[11]研究指出，通過(guò)LP和植物乳植桿菌混菌發(fā)酵的葛根水提液對(duì)ALI小鼠能起到一定的保護(hù)作用。然而，關(guān)于基因?qū)用嬉约盎谀c道菌群的調(diào)節(jié)，有關(guān)LP對(duì)ALI潛在調(diào)控作用的研究較少。

本課題組前期從紅曲酒傳統(tǒng)釀造體系中分離鑒定出一株副干酪乳桿菌FZU103（LP-FZU103），小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)LP-FZU103能夠促進(jìn)肝臟功能基因正常表達(dá)和維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)，對(duì)肝臟脂質(zhì)堆積和非酒精性脂肪肝的形成具有一定的預(yù)防作用[12]。因此，推測(cè)LP-FZU103可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群和肝臟功能基因表達(dá)等途徑防控ALI。據(jù)此，本研究構(gòu)建ALI小鼠模型，從生理生化指標(biāo)、肝功能基因轉(zhuǎn)錄及腸道菌群的角度探究LP-FZU103對(duì)ALI的防控作用機(jī)制，以期為開(kāi)發(fā)功能性乳酸菌發(fā)酵食品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPF級(jí)6 周齡ICR小鼠（雄性，體質(zhì)量25～28 g）吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司；LP-FZU103由福州大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)室提供。

總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL-6）及干擾素γ（interferon γ，IFN-γ）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所；TRIzol試劑盒、PrimeScriptTMRT反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Tli RNaseH Plus試劑盒 Takara生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司；糞便基因組DNA提取試劑盒 美國(guó)MoBio公司；其他化學(xué)試劑均為分析純 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BL 150 電子分析天平 德國(guó)賽多利斯公司；10～1 000 μL移液槍 法國(guó)Gilson公司；數(shù)碼顯微攝像機(jī) 日本尼康公司；Step One Plus實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time quantitative polymerase chain reaction，real-time PCR）儀 美國(guó)應(yīng)用生物公司；CF16RXII高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；HR-6B高速勻漿機(jī) 上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；Multiskan SkyHigh酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fishers公司。

1.3 方法

1.3.1 LP-FZU103菌懸液的制備

將凍存在-80 ℃超低溫冰箱中的LP-FZU103菌種接入到MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃厭氧條件下活化培養(yǎng)24 h，連續(xù)傳代培養(yǎng)3 次后，將菌液離心后棄上清取菌體沉淀，用無(wú)菌生理鹽水沖洗2 遍，加入生理鹽水配制2.5×109CFU/mL菌液，搖勻后4 ℃冷藏備用。

1.3.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案按照《國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保健研究所護(hù)理和使用指南》進(jìn)行，并經(jīng)福州大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物倫理許可號(hào)：FZU-FST-2021-003。將36 只6 周齡ICR小鼠在溫度（25±1）℃、相對(duì)濕度（60±5）%、12 h光照循環(huán)的環(huán)境下飼養(yǎng)。用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)小鼠3 d，實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)周期為6 周，每周2 次定期更換飼料和飲用水，并及時(shí)更換墊料。小鼠經(jīng)過(guò)3 d適應(yīng)期后，將其隨機(jī)分為空白組、模型組和實(shí)驗(yàn)組，每組各12 只。實(shí)驗(yàn)組小鼠每天上午灌胃500 μL LP-FZU103菌液（活菌數(shù)2×109CFU/mL），空白組和模型組灌胃等劑量的生理鹽水；4 h后空白組小鼠灌胃生理鹽水（7.5 mL/kgmb），模型組和實(shí)驗(yàn)組灌胃等劑量的體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液。

1.3.3 血清和肝臟樣本采集

實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)結(jié)束時(shí)，禁食12 h后從麻醉小鼠心臟取血，置于1.5 mL離心管中室溫保存1 h，之后于3 000 r/min、4 ℃的條件下離心10 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱保存。處死小鼠后取出肝臟，立即測(cè)定肝臟質(zhì)量，在液氮中快速冷凍30 s，并保存在-80 ℃冰箱。

1.3.4 體質(zhì)量及臟器系數(shù)測(cè)定

體質(zhì)量測(cè)定：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，每周規(guī)定時(shí)間稱量小鼠體質(zhì)量。

臟器系數(shù)測(cè)定：將采集的肝臟、腎臟和脾臟用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液洗滌，用濾紙吸干水分，稱質(zhì)量，臟器系數(shù)按下式計(jì)算：

1.3.5 血清生化指標(biāo)測(cè)定

利用高速勻漿機(jī)將生理鹽水與小鼠血液樣本均質(zhì)后，于1 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清液，用商業(yè)生化試劑盒測(cè)定血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C濃度以及AST和ALT的活力[12]。

1.3.6 肝臟生化指標(biāo)測(cè)定

稱取100 mg左右肝組織，加入0.9 mL無(wú)菌生理鹽水，置于冰水中，用高速勻漿機(jī)勻漿3～5 次，每次持續(xù)10 s；3 500 r/min、4 ℃條件下離心10 min，收集上清，制成肝勻漿。按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定肝臟中MDA、TNF-α、IL-6、IFN-γ和GSH水平，以及肝臟CAT、SOD活力。

1.3.7 肝臟切片組織病理學(xué)分析

采集的肝臟樣品用生理鹽水沖洗后，將其在體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液中固定過(guò)夜，次日再用體積分?jǐn)?shù)70%～100%的乙醇梯度脫水，石蠟包埋，冷卻后制成5 μm厚切片。制作的肝切片用蘇木精-伊紅染色后，用光學(xué)顯微鏡（×400）掃描觀察[13]。

1.3.8 肝臟RNA提取及real-time PCR檢測(cè)

采用TRIzol試劑從肝組織中提取總RNA，并利用PrimeScriptTMRT反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以小鼠18S rDNA作為內(nèi)參基因，在Step One Plus real-time PCR系統(tǒng)與Tli RNaseH Plus試劑盒操作要求下進(jìn)行PCR，采用2-ΔΔCt法分析肝臟膽汁酸及脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平，每個(gè)基因設(shè)置6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)及3 個(gè)技術(shù)重復(fù)，本研究中使用的引物序列見(jiàn)表1。

表1 real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for real-time PCR analysis

1.3.9 腸道菌群高通量測(cè)序

切取小鼠盲腸段并擠出內(nèi)容物，置于2 mL無(wú)菌凍存管中，-80 ℃凍存?zhèn)溆?，組內(nèi)設(shè)置12 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司檢測(cè)腸道菌群。具體方法如下：準(zhǔn)確稱取1.00 g盲腸內(nèi)容物，加入9 mL無(wú)菌生理鹽水，混勻，1 000 r/min離心5 min，收集上清液；再將上清液12 000 r/min離心5 min，收集沉淀即盲腸菌體。采用糞便基因組DNA提取試劑盒提取盲腸菌體樣本總DNA，基于Illumina MiSeq PE300測(cè)序平臺(tái)對(duì)腸道菌群16S rDNA的V3～V4區(qū)擴(kuò)增測(cè)序，使用QIIME軟件獲得高通量序列，通過(guò)UCLUST算法將序列分為97%識(shí)別閾值的操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Excel 2021和SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，并利用GraphPad Prism 9.5軟件繪圖，P＜0.05表示具有顯著差異；利用STAMP 2.1.3軟件分析及可視化不同組之間屬水平上的腸道菌群差異；利用R軟件（3.3.3版）的psych、pheatmap和reshape2包作相關(guān)性熱圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LP-FZU103對(duì)ALI小鼠體質(zhì)量及臟器系數(shù)的影響

體質(zhì)量變化是機(jī)體最直觀的健康指標(biāo)，由圖1A可知，與空白組小鼠相比，ALI會(huì)明顯影響小鼠體質(zhì)量的正常增長(zhǎng)，特別是在第6周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體質(zhì)量差異最為明顯。ALI小鼠同時(shí)給予LP-FZU103預(yù)防性干預(yù)后，乙醇對(duì)機(jī)體代謝功能的損傷得到一定程度改善，體質(zhì)量有所恢復(fù)。由圖1B、C可知，模型組小鼠的肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)顯著高于空白組（P＜0.05），表明小鼠在長(zhǎng)期乙醇誘導(dǎo)下肝臟及腎臟發(fā)生異常腫脹。LP-FZU103干預(yù)可顯著降低ALI小鼠的肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)（P＜0.05），且與空白組的正常小鼠無(wú)顯著差異，表明LP-FZU103干預(yù)能夠緩解ALI小鼠肝臟及腎臟損傷。此外，由圖1D可知，與空白組相比，模型組小鼠脾臟系數(shù)極顯著下降（P＜0.01），而實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟系數(shù)與空白組較接近，表明LP-FZU103干預(yù)能緩解ALI導(dǎo)致的小鼠脾臟萎縮。

圖1 LP-FZU103對(duì)ALI小鼠體質(zhì)量及臟器系數(shù)的影響Fig.1 Effect of LP-FZU103 on body mass and organ coefficients in mice with ALI

2.2 LP-FZU103對(duì)ALI小鼠血清生化指標(biāo)的影響

ALI的最主要表現(xiàn)之一是機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂，乙醇的過(guò)量攝入可促進(jìn)肝臟TC和TG的合成，而LDL-C主要負(fù)責(zé)將TC和TG運(yùn)輸?shù)窖褐校餉LI的進(jìn)一步惡化，HDL-C負(fù)責(zé)將血液中的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟中進(jìn)行處理，能有效防止ALI的發(fā)生及發(fā)展[14-15]。由圖2可知，過(guò)量的乙醇干預(yù)6 周后，模型組小鼠血清中的TC、TG和LDL-C濃度顯著高于空白組（P＜0.05），而HDL-C濃度極顯著低于空白組（P＜0.01），表明模型組小鼠已出現(xiàn)明顯的血脂異?，F(xiàn)象。LP-FZU103干預(yù)可顯著降低ALI小鼠血清中的TC、TG和LDL-C濃度，而血清HDL-C濃度顯著高于模型組（P＜0.05）且與空白組小鼠接近。因此，本研究推測(cè)LP-FZU103降低血清TC和TG濃度可能是通過(guò)增加血清HDL-C和降低血清LDL-C濃度實(shí)現(xiàn)[16]。此外，血清ALT和AST活力也是評(píng)估肝臟損傷程度的重要指標(biāo)。ALT和AST主要分布在肝細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，二者活力的異常增加分別反映了肝細(xì)胞膜和肝細(xì)胞器的損傷程度[17]。在本研究中，實(shí)驗(yàn)組小鼠ALT和AST活力顯著低于模型組（P＜0.05），且與空白組接近，以上結(jié)果表明LP-FZU103可以有效抑制ALI小鼠的肝細(xì)胞壞死，減輕肝細(xì)胞損傷程度。

圖2 LP-FZU103對(duì)ALI小鼠血清生化指標(biāo)的影響Fig.2 Effect of LP-FZU103 on serum biochemical indexes of mice with ALI

2.3 LP-FZU103對(duì)ALI小鼠肝臟氧化應(yīng)激生化指標(biāo)的影響

作為肝臟氧化應(yīng)激的重要標(biāo)志物，MDA含量越高表明肝臟細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化程度越嚴(yán)重[18]。由圖3A可知，攝入過(guò)量乙醇的小鼠肝臟中MDA含量極顯著上升（P＜0.01），而LP-FZU103的干預(yù)極顯著降低肝臟中MDA含量（P＜0.01），且與空白組無(wú)顯著差異。此外，肝細(xì)胞中存在由GSH、SOD及CAT共同組成的抗氧化防御系統(tǒng)，其中GSH中的活性巰基可使活性氧（reactive oxygen species，ROS）還原成酸性物質(zhì)，加速ROS的清除[19]；SOD可使超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，生成H2O2和氧，并通過(guò)CAT使之進(jìn)一步裂解為H2O，同時(shí)減少高活性羥自由基的產(chǎn)生，以阻止超生理水平的ROS積累，從而抑制體內(nèi)的氧化應(yīng)激，使肝細(xì)胞膜穩(wěn)定性增加、轉(zhuǎn)氨酶含量降低[20]。由圖3B～D可知，與空白組相比，模型組小鼠肝臟中CAT和SOD活力及GSH含量顯著下降（P＜0.05），而LP-FZU103的攝入顯著提高了肝臟CAT和SOD活力以及GSH含量（P＜0.05），表明LP-FZU103能夠提高乙醇代謝相關(guān)酶的活性以減輕肝臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)。Tian Fengwei等[21]利用植物乳植桿菌CCFM1112干預(yù)ALI小鼠，結(jié)果顯示，其對(duì)小鼠肝臟MDA、SOD及GSH水平的調(diào)控效果并不明顯，表明LP-FZU103在調(diào)控肝臟氧化應(yīng)激方面更具優(yōu)勢(shì)。研究得出，LP-FZU103在預(yù)防肝臟氧化應(yīng)激方面的潛在作用可能通過(guò)減少自由基的產(chǎn)生或增加自由基的清除活性實(shí)現(xiàn)，從而減輕小鼠ALI癥狀。

圖3 LP-FZU103對(duì)ALI小鼠肝臟氧化應(yīng)激生化指標(biāo)的影響Fig.3 Effect of LP-FZU103 on biochemical indices of oxidative stress in liver of mice with ALI

2.4 LP-FZU103對(duì)ALI小鼠肝臟炎癥因子指標(biāo)的影響

長(zhǎng)期大量飲酒還能刺激肝臟巨噬細(xì)胞的活化，產(chǎn)生TNF-α，其作為一種多功能促炎因子參與許多疾病，且因其位于促炎細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)的開(kāi)端，故常作為炎癥反應(yīng)激活劑發(fā)揮作用[22]。例如，分泌的TNF-α能激活漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，加速IFN-γ、IL-6等其他炎癥因子的釋放，增加細(xì)胞的凋亡并損害正常的生理功能，加劇體內(nèi)炎癥反應(yīng)[23]。由圖4可知，與空白組相比，模型組中除IL-6水平增加不顯著外，TNF-α和IFN-γ水平顯著增加（P＜0.05）；而LP-FZU103干預(yù)后，除TNF-α水平降低不顯著外，IFN-γ和IL-6水平相較于模型組均顯著降低（P＜0.05），且與空白組無(wú)顯著差異。以上結(jié)果表明，LP-FZU103通過(guò)抑制炎癥因子的產(chǎn)生降低ALI小鼠中肝臟的炎癥反應(yīng)。

圖4 LP-FZU103對(duì)ALI小鼠肝臟炎癥因子指標(biāo)的影響Fig.4 Effect of LP-FZU103 on inflammatory cytokine levels in liver of mice with ALI

2.5 LP-FZU103對(duì)ALI小鼠肝臟組織病理學(xué)的影響

由圖5可知，空白組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)完整，輪廓清晰，肝細(xì)胞呈放射狀排列，出現(xiàn)較少空泡脂滴，而模型組小鼠肝臟組織內(nèi)可見(jiàn)肝細(xì)胞間發(fā)生嚴(yán)重脂肪病變，并伴有部分氣球樣變及點(diǎn)狀壞死，出現(xiàn)較大空泡脂滴。相比于模型組，實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)LP-FZU103干預(yù)后，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯趨于正常，肝細(xì)胞間中、大泡性脂肪病變減少，空泡脂滴減少。以上研究結(jié)果表明，LP-FZU103能夠減輕ALI小鼠的肝臟病變，對(duì)ALI具有一定的防控作用。

圖5 LP-FZU103對(duì)ALI小鼠肝臟組織形態(tài)的影響（×400）Fig.5 Effect of LP-FZU103 on liver morphology in mice with ALI (× 400)

2.6 LP-FZU103對(duì)ALI小鼠肝臟膽汁酸及脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

肝臟是參與膽汁酸轉(zhuǎn)化及代謝、脂肪酸代謝的重要器官。為闡明LP-FZU103干預(yù)ALI作用機(jī)制，本研究采用real-time PCR檢測(cè)與肝臟膽固醇代謝和膽汁酸穩(wěn)態(tài)相關(guān)的關(guān)鍵基因表達(dá)水平。其中，Cyp7a1是一種參與膽汁酸轉(zhuǎn)化及代謝的限速酶基因，其過(guò)表達(dá)可使膽汁酸水平和組成以及腸道膽固醇吸收正?；?，從而導(dǎo)致膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)增加[24]。由圖6A可知，乙醇干預(yù)顯著降低了肝臟Cyp7a1表達(dá)水平（P＜0.05），打破了膽固醇穩(wěn)態(tài)，從而證實(shí)膽汁酸轉(zhuǎn)化途徑存在異常。LP-FZU103干預(yù)后，Cyp7a1表達(dá)水平升高，表明LP-FZU103對(duì)膽汁酸的轉(zhuǎn)化及代謝起到一定調(diào)節(jié)作用。

圖6 LP-FZU103對(duì)ALI小鼠肝功能相關(guān)基因表達(dá)水平的影響Fig.6 Effect of LP-FZU103 on the expression of liver function-related genes in mice with ALI

由圖6B～H可知，與空白組相比，模型組Ldlr、Cpt1及Acox1基因水平顯著下調(diào)（P＜0.05），而除Acc1和Srebp-1c基因水平上調(diào)不顯著外，Cd36和Hmgcr基因水平顯著上調(diào)（P＜0.05）。提前灌胃LP-FZU103使上述基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)有所逆轉(zhuǎn)。脂肪酸β氧化是調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝紊亂的關(guān)鍵途徑，而Cpt-1和Acox1是指導(dǎo)該途徑限速酶的關(guān)鍵基因[25-26]。Cd36基因調(diào)節(jié)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中，從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)TG的形成和積累[27]。先前研究表明，Srebp-1c是一類核轉(zhuǎn)錄因子，參與TG和膽固醇代謝基因的轉(zhuǎn)錄激活，而Acc1是其作用靶基因，膳食補(bǔ)充益生菌可以顯著降低肝臟Srebp-1c基因的mRNA水平，從而改善脂質(zhì)代謝[28]。此外，Hmgcr是降低膽固醇的治療靶點(diǎn)，上調(diào)Hmgcr可抑制膽固醇的合成；Ldlr的存在可以去除多余的LDL-C[29-30]，與圖2C中的結(jié)果相對(duì)應(yīng)。以上結(jié)果表明，LP-FZU103可能通過(guò)調(diào)節(jié)肝臟膽汁酸及脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)有效改善小鼠ALI。

2.7 LP-FZU103對(duì)ALI小鼠腸道菌群組成的影響

越來(lái)越多的研究表明，過(guò)量攝入乙醇引起的腸道菌群紊亂對(duì)ALI的病理進(jìn)展起重要作用[31]。因此，本研究利用16S rDNA測(cè)序技術(shù)在屬水平上揭示ALI對(duì)小鼠腸道菌群組成的影響，由圖7A可知，過(guò)量攝入乙醇的小鼠腸道中g(shù)_norank_f_Muribaculaceae（OTU229）、g_Lachnospiraceae_NK4A136_group（OTU375、OTU632、OTU374、OTU326）、g_unclassified_f_Lachnospiraceae（OTU361）等菌屬相對(duì)豐度明顯升高，而norank_o_Clostridia UCG-014（OTU160、OTU611）、g_norank_f_Mollicutes_RF39（OTU92、OTU191、OTU201）、g_unclassified_f_Ruminococcaceae（OTU783）、g_Lactococcus（OTU115）、g_Lachnoclostridium（OTU720）等菌屬相對(duì)豐度顯著降低。研究表明，過(guò)量攝入乙醇導(dǎo)致小鼠腸道中g(shù)_unclassified_f_Lachnospiraceae相對(duì)豐度升高，盡管所報(bào)道的大部分Lachnospiraceae因能參與碳水化合物代謝而常被認(rèn)為是一種潛在的有益菌，但也有研究指出其相對(duì)豐度與血清TC和TG濃度呈正相關(guān)，并在促進(jìn)腸相關(guān)的肝臟代謝疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[32]。Muribaculaceae廣泛存在于動(dòng)物腸道中，并以導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體腹瀉而被人熟知[33]。此外，過(guò)量攝入乙醇能夠顯著降低小鼠腸道中乳球菌、瘤胃菌等益生菌的相對(duì)豐度。

圖7 LP-FZU103對(duì)ALI小鼠腸道菌群相對(duì)豐度影響的差異性分析Fig.7 Differential analysis of relative abundance of intestinal flora in mice with ALI subjected to LP-FZU103 intervention

口服LP-FZU103可明顯改變ALI小鼠的腸道微生物構(gòu)成，由圖7B可知，LP-FZU103干預(yù)顯著提高了腸道中s_Lactobacillus johnsonii（OTU202）、g_unclassified_p_Firmicutes（OTU681、OTU440）、s_Alistipessp._cv1（OTU724）、g_Lactobacillus（OTU85）、s_Lactobacillus paracasei（OTU448）、s_Lactobacillus_reuteri（OTU730）等細(xì)菌的相對(duì)豐度，并顯著降低g_norank_f_Muribaculaceae（OTU229、OTU232、OTU863等）、s_Staphylococcus sciuri（OTU829）、g_norank_f_Desulfovibrionaceae（OTU709）等有害菌的相對(duì)豐度。王麗華等[33]研究認(rèn)為，Lactobacillus johnsonii能調(diào)節(jié)腸道菌群并觸發(fā)黏蛋白分泌，同時(shí)改善腸上皮穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，通過(guò)“腸-肝”軸起到保肝作用。Firmicutes的主要作用是促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在人體的消化吸收，利于維持血脂正常水平[34]。Alistipes與肝臟乙醇脫氫酶呈正相關(guān)從而促進(jìn)乙醇代謝，對(duì)肝纖維化和結(jié)腸炎有一定的防控作用[35]。據(jù)報(bào)道，Lactobacillus_reuteri作為一種重要的腸道益生菌，能逆轉(zhuǎn)乙醇誘導(dǎo)的肝臟炎癥和脂肪酸代謝紊亂[36]。與之相反的是，腸道菌群中的葡萄球菌屬可導(dǎo)致肝功能異常和加速破壞性肝動(dòng)脈血栓形成[37]；脫硫弧菌能夠改變肝組織中硫化氫的水平，一定程度促進(jìn)肝臟的纖維化[38]。由此推斷，LP-FZU103干預(yù)可顯著上調(diào)腸道中有益菌的豐度，并顯著下調(diào)有害菌的豐度，進(jìn)而改善ALI導(dǎo)致的腸道菌群紊亂，有利于預(yù)防ALI的形成。

2.8 LP-FZU103調(diào)控的腸道關(guān)鍵微生物與生化指標(biāo)的相關(guān)性

腸道微生物及其代謝產(chǎn)物參與調(diào)控宿主的系列生理活動(dòng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)已成為共識(shí)[39]。因此，本研究進(jìn)一步通過(guò)Spearman相關(guān)性分析，探究腸道微生物與血清、肝臟生化指標(biāo)之間的相關(guān)性。由圖8可知，g_norank_f_Oscillospiraceae（OTU753）、g_norank_f_Desulfovibrionaceae（OTU709、OTU837）、g_norank_f_Muribaculaceae（OTU863）等腸道細(xì)菌的豐度與肝臟MDA含量呈顯著正相關(guān)，而與肝臟GSH含量呈顯著負(fù)相關(guān)。此外，g_Lachnospiraceae_GCA-900066575（OTU158）、s_Clostridium_sp._Jar-13（OTU316）、g_norank_f_Muribaculaceae（OTU232）等腸道細(xì)菌的豐度與血清TC濃度呈顯著正相關(guān)，而與肝臟GSH含量呈顯著負(fù)相關(guān)。有研究[10]指出，利用副干酪乳桿菌M5L干預(yù)ALI小鼠，能夠顯著降低小鼠肝臟MDA含量并增加SOD活力和GSH含量，以提高肝臟抗氧化能力，與本研究結(jié)果一致，但其并未從更深層次的腸道菌群調(diào)節(jié)角度進(jìn)行解析，具有一定的局限性。根據(jù)前人研究，Oscillospiraceae可通過(guò)增強(qiáng)氧化應(yīng)激水平和炎癥反應(yīng)消耗體內(nèi)的GSH，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體的抗氧化能力下降，而g_Lachnospiraceae_GCA-900066575與血清生化及肥胖表型呈顯著正相關(guān)[40-41]，與本研究結(jié)果相一致。

圖8 LP-FZU103調(diào)控的腸道關(guān)鍵微生物與血清和肝臟生化指標(biāo)之間的相關(guān)性分析Fig.8 Correlation analysis between key intestinal microorganisms regulated by LP-FZU103 and biochemical indices in serum and liver of mice

腸道關(guān)鍵微生物與生化指標(biāo)之間的相關(guān)性分析結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，g_norank_f_Lachnospiraceae（OTU133）的豐度與肝臟C AT 活力呈顯著正相關(guān)，而與血清ALT、AST活力呈顯著負(fù)相關(guān)；此外，s_Lactobacillus_rhamnosus（OTU244）、g_Lactobacillus（OTU85）、s_Lactobacillus paracasei（OTU448）、s_Lactobacillus_reuteri（OTU730）、s_Lactobacillus johnsonii（OTU202）等腸道細(xì)菌的豐度與肝臟GSH含量呈顯著正相關(guān)。LP-FZU103可能通過(guò)促進(jìn)以上腸道有益菌的生長(zhǎng)代謝增強(qiáng)肝臟解毒功能、抗氧化能力及免疫反應(yīng)，促進(jìn)機(jī)體肝功能的正常運(yùn)行。

3 結(jié)論

目前，藥物治療被認(rèn)為是改善ALI的主要方法，而大多數(shù)治療藥物仍具有潛在的副作用。因此，從食物資源中開(kāi)發(fā)具有較強(qiáng)保肝護(hù)肝作用的功能性食品是干預(yù)ALI病理發(fā)展的重要策略之一。據(jù)此，本研究通過(guò)構(gòu)建ALI小鼠模型，證明LP-FZU103對(duì)ALI具有一定的防控作用，其通過(guò)提高機(jī)體乙醇代謝相關(guān)酶活性，減少肝臟自由基的產(chǎn)生或積累，抑制肝臟促炎細(xì)胞因子的釋放，調(diào)控肝臟膽汁酸、脂肪酸的轉(zhuǎn)化，以及肝臟代謝相關(guān)功能基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)腸道微生物組成，尤其是提升小鼠腸道中約氏乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、副干酪乳桿菌等有益細(xì)菌的相對(duì)豐度，以促進(jìn)腸道菌群穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而有效預(yù)防ALI的發(fā)生與發(fā)展。本研究可為開(kāi)發(fā)功能性乳酸菌發(fā)酵食品以預(yù)防過(guò)量飲酒引起的ALI提供科學(xué)依據(jù)。在未來(lái)研究中，LP-FZU103對(duì)ALI的防控作用及機(jī)制還需要進(jìn)一步通過(guò)多維組學(xué)技術(shù)結(jié)合臨床人群試驗(yàn)驗(yàn)證。