分子動力學(xué)結(jié)合拉曼光譜評價乳液界面蛋白結(jié)構(gòu)變化

何冬雪，馮紫藍，申鉉日，裴志勝,,3,*

（1.海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 ?？?570228；2.海南熱帶海洋學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 三亞 572022；3.海南熱帶海洋學(xué)院 海南省院士團隊創(chuàng)新中心，海南省海洋食品工程技術(shù)研究中心，海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，海南 三亞 572022）

羅非魚是我國重要的淡水養(yǎng)殖品種魚之一，也是我國主要的養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類，有繁殖速度快、產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富等特點，但其加工形式單一、附加值低，仍具有很大發(fā)展?jié)摿1]。羅非魚肌肉中的主要成分之一是肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP），MP含量占蛋白質(zhì)總量的50%～70%[2]。MP因同時具有親水和親油性，在乳化過程中能夠自發(fā)吸附到油-水界面，降低界面張力并為乳液提供物理及化學(xué)穩(wěn)定性，是良好的乳化劑和穩(wěn)定劑[3]。

乳液是由一種或多種物質(zhì)分散在一種液體中所形成的分散體，通常由分散相和連續(xù)相組成，分散相為油相，連續(xù)相為水相[4]。乳液的穩(wěn)定性取決于吸附在油-水界面上的乳化劑，主要與吸附劑顆粒的物理化學(xué)性質(zhì)和界面層的黏彈性行為有關(guān)[5]。有研究表明，蛋白質(zhì)是食品中的生物大分子物質(zhì)，能夠吸附在油-水界面，形成界面膜穩(wěn)定油滴，在穩(wěn)定乳液中起到重要作用[6]。油-水界面上蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)和結(jié)構(gòu)特征決定了乳液表面活性，同時與產(chǎn)品最終的穩(wěn)定性緊密相關(guān)[7-8]。

目前，越來越多研究人員致力于研究蛋白質(zhì)吸附到油-水界面后結(jié)構(gòu)變化與乳液穩(wěn)定性之間的聯(lián)系。離心、懸滴分析、蛋白質(zhì)光譜分析等方法已經(jīng)被應(yīng)用于界面吸附蛋白質(zhì)濃度和結(jié)構(gòu)變化的研究[9]。每種方法都有其對應(yīng)特點，但都不能適用于所有樣品體系。為此，研究人員不斷探索新型技術(shù)，以更深入、全面地了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展，科學(xué)家們開始借助計算機科學(xué)技術(shù)對蛋白質(zhì)構(gòu)象進行更深層次的動態(tài)模擬分析。分子動力學(xué)（molecular dynamics，MD）模擬是使用計算機模擬并觀察蛋白質(zhì)大分子或小分子及其體系相互作用的一種方法。MD模擬不僅可以從分子水平上對蛋白質(zhì)進行整體結(jié)構(gòu)觀察，還可以揭示蛋白質(zhì)分子在時間尺度上的動態(tài)變化[10]。蛋白質(zhì)MD模擬突出了分子在體系中的變化，可以用來識別蛋白質(zhì)分子在乳液形成過程中空間構(gòu)象變化[11]。

在最近一項研究中，肌球蛋白模型被用于計算機MD模擬，以探究油的極性對乳液界面MP構(gòu)象和乳液穩(wěn)定性的影響，得到的結(jié)果與實驗結(jié)果一致[12]。Ferrari等[13]提出油-水界面系統(tǒng)的分子模型，并對油-水界面上的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化進行探究，結(jié)果表明，MD模擬能夠正確描述蛋白質(zhì)在油-水界面的行為。此外，Wang Haitang[14]、Wu Zhicheng[15]、Dong Ming[16]等均使用肌球蛋白模型進行了MD模擬，探究MP在不同條件和不同體系中的結(jié)構(gòu)變化，說明在MD模擬中，肌球蛋白模型可以用來研究MP結(jié)構(gòu)。這些研究中雖研究體系不統(tǒng)一，但方法和結(jié)果也適用于食品乳液體系。

目前，已有吸附到油-水界面后蛋白質(zhì)分布、結(jié)構(gòu)相關(guān)研究，但使用MD模擬對油-水界面蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的相關(guān)研究仍然有限。本課題前期研究結(jié)果顯示，水相中MP質(zhì)量分數(shù)為1.5%時，當(dāng)油相體積分數(shù)為68%時，能夠有效包裹油滴，并抑制油滴的聚結(jié)和破裂，形成穩(wěn)定的水包油乳液，具有良好的界面穩(wěn)定性；當(dāng)油相體積分數(shù)大于70%時，乳液界面平衡接近臨界點，觀察到明顯油水分離，此時蛋白質(zhì)膜幾乎無法保持完整[17]。在此基礎(chǔ)上，本研究使用羅非魚MP和玉米油制備乳液，以界面蛋白質(zhì)作為研究對象，探究其結(jié)構(gòu)變化與乳液界面層穩(wěn)定性的關(guān)系。首先使用同源建模獲得肌球蛋白模型，然后利用MD模擬乳液形成過程中表面肌球蛋白從初始到最終3D結(jié)構(gòu)構(gòu)象的變化。最后結(jié)合拉曼光譜分析MP二級結(jié)構(gòu)及其側(cè)鏈微環(huán)境變化，獲得更準確的乳化過程油-水界面MP結(jié)構(gòu)與乳液界面層穩(wěn)定性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍羅非魚片（（150±10）g）海南翔泰漁業(yè)有限公司；金龍魚玉米胚芽油（不飽和脂肪酸質(zhì)量分數(shù)為80%～85%）益海嘉里（武漢）糧油工業(yè)有限公司；氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純）上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XHF-DY高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；DXR2拉曼光譜儀 美國Thermo Fisher公司；B302光學(xué)顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司；T6紫外-可見分光光度計 北京普析通用公司。

1.3 方法

1.3.1 MP提取

使用本實驗室提供的方法提取羅非魚MP[17]。將羅非魚片解凍后切成小塊，打碎至無顆粒狀，加入等質(zhì)量低鹽磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L NaCl、3.38 mmol/L NaH2PO4·2H2O、15.5 mmol/L Na2HPO4·12H2O、pH 7.5），在4 000 r/min、4 ℃、10 min條件下離心，去除上清液，以上步驟重復(fù)3 次，去除血水等雜質(zhì)。然后與3 倍質(zhì)量高鹽磷酸鹽緩沖液（0.6 mol/L NaCl、3.38 mmol/L NaH2PO4·2H2O、15.5 mmol/L Na2HPO4·12H2O、pH 7.5）混合均勻，置于4 ℃條件下反應(yīng)過夜。最后加入5 倍魚肉質(zhì)量的清水，在10 000 r/min、4 ℃條件下離心25 min，去除大部分水分和水溶性雜質(zhì)后得到MP濕樣品。使用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量[18]，確保得到的蛋白質(zhì)量分數(shù)為10%～11%。樣品應(yīng)于24 h內(nèi)使用完畢。

1.3.2 乳液制備

將MP溶解在5 g超純水中，混合均勻，制備MP質(zhì)量分數(shù)1.5%的溶液。然后將不同質(zhì)量的玉米油加入MP溶液，于7 000 r/min均質(zhì)2 min，得到油相體積分數(shù)為0%、10%、68%、70%的乳液。根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果[17]，對乳液體系界面蛋白結(jié)構(gòu)變化進行研究。

1.3.3 微觀結(jié)構(gòu)觀察

將乳液滴于載玻片上，用蓋玻片壓住樣品，排出多余氣泡，置于光學(xué)顯微鏡的載物臺上，用40 倍物鏡對樣品進行觀察和拍照。

1.3.4 MD模擬

蛋白質(zhì)建模：從UniProt數(shù)據(jù)庫中獲取羅非魚肌球蛋白序列，工具檢索目標結(jié)構(gòu)模板使用NCBI PSI-BLAST算法[19]。根據(jù)物種、序列覆蓋率/概率、E值和序列同一性百分比等質(zhì)量參數(shù)的計算結(jié)果，獲得最佳模板（PDB ID：2BKI）。肌球蛋白的3D模型使用AllHModel模式進行100 次建模，重復(fù)10 次循環(huán)直到molpdf＞1×106。每個模型都先經(jīng)過優(yōu)化，然后分別使用MD和模擬退火算法進行細化[20]。最后再使用算法對最優(yōu)模型進行精修，使用MD模擬程序在373.15 K和1.0 bar條件下進行100 ns模擬，得到肌球蛋白乳液蛋白模型。

油水混合的羅非魚肌球蛋白體系搭建和MD模擬：從PubChem數(shù)據(jù)庫下載玉米油中主要不飽和脂肪酸（亞油酸和油酸）的3D結(jié)構(gòu)。為保證模型的準確性，使用Avogadro程序?qū)τ拖喾肿拥?D結(jié)構(gòu)進行幾何優(yōu)化。然后使用Packmol程序構(gòu)建油水混合的羅非魚肌球蛋白體系模型（油相體積分數(shù)分別為10%、68%、70%），得到對應(yīng)的模型用于后續(xù)MD模擬。

使用GROMACS 21.3軟件分析MD模擬過程蛋白分子二級結(jié)構(gòu)的變化。首先使能量最小化（1 000.0 kJ/（mol·nm），然后采用共軛梯度優(yōu)化（100.0 kJ/（mol·nm））進行第2次能量最小化。隨后，使用正則系綜（1 ns）和等溫等壓系綜（1 ss）相繼對系統(tǒng)進行預(yù)平衡。所有系統(tǒng)均采用100 ns MD模擬。時間步長為2 fs，每1.0 ps收集一次快照。MD模擬后，使用GROMACS 19.6分析軌跡變化。最后，選取80～100 ns的結(jié)果對肌球蛋白二級結(jié)構(gòu)變化進行計算和分析，使用DSSP程序和VMD程序?qū)∏虻鞍走M行構(gòu)象變化和可視化分析。

1.3.5 拉曼光譜測定

參考王正雯等[21]的方法，稍作修改。將乳液樣品置于載玻片上，蓋上蓋玻片進行測定。使用20 倍聚焦鏡頭，在激光器波長532 nm、激發(fā)功率10 mW、狹縫孔徑50 μm、曝光時間10 s和掃描范圍400～3 500 cm-1條件下對樣品進行測定，每個樣品取3 個不同位點掃描。使用配套軟件對拉曼光譜進行基線校正和內(nèi)標（苯丙氨基酸殘基（1 004±2）cm-1）歸一化處理。最后使用Peakfit 4.12軟件計算樣品拉曼光譜峰面積，以確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均進行3 次平行測定，結(jié)果以平均值±標準差表示。使用Origin 2018軟件繪圖，使用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，P＜0.05表示樣品間具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 MD模擬結(jié)果分析

2.1.1 模型質(zhì)量評估結(jié)果

建模獲得的肌球蛋白乳液蛋白模型可以使用拉氏圖和Verify 3D評價結(jié)果來評估其準確性和合理性[22]。羅非魚肌球蛋白氨基酸序列與建模獲得的肌球蛋白乳液蛋白模型的氨基酸序列對比如圖1A所示，對模型進行評估得到的拉氏圖如圖1B所示，有666 個（89.0%）氨基酸殘基處于紅色區(qū)域，71 個（9.5%）氨基酸殘基處于黃色區(qū)域，9 個（1.2%）氨基酸殘基處于淺黃色區(qū)域，處于白色區(qū)域的氨基酸殘基只有2 個，占全部氨基酸殘基的0.3%。通常認為允許區(qū)（包括紅色核心最適區(qū)、黃色最大允許區(qū)和淺黃色一般允許區(qū)）內(nèi)的氨基酸殘基含量大于90%即可認為該氨基酸具有良好的構(gòu)象。可見，該肌球蛋白的空間構(gòu)象模型具有一定準確性且合理。有研究者對PSE（pale,soft and exudative）雞肉MP的肌球蛋白進行同源建模，模型中97.8%的氨基酸殘基位于允許區(qū)，與本研究結(jié)果相近，說明本研究中同源建模結(jié)果具有準確性[23]。此外，Verify 3D檢驗要求至少80%氨基酸殘基的平均3D-1D分值不小于0.2[24]，圖1C顯示，肌球蛋白模型中有88.59%氨基酸殘基平均3D-1D值≥0.2，Verify 3D檢驗通過。綜上所述，肌球蛋白建模的拉氏圖和Verify 3D指標評價合理，因此，可以認為該肌球蛋白模型結(jié)構(gòu)合理，可以進行分子對接。

圖1 肌球蛋白模型的質(zhì)量評估結(jié)果Fig.1 Quality evaluation results of myosin model

2.1.2 MD乳液蛋白空間構(gòu)象變化分析

通過可視化得到肌球蛋白3D結(jié)構(gòu)圖像，由圖2、3可知，α-螺旋構(gòu)象貫穿整個蛋白質(zhì)分子，起主干作用，是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要組成部分，有利于蛋白質(zhì)保水性和凝膠性。β-折疊穿插于主干中間部分，其他結(jié)構(gòu)則無規(guī)則、不定量隨機分布在整個蛋白質(zhì)分子內(nèi)部及周圍。不同油相體積分數(shù)乳液界面肌球蛋白在0～100 ns模擬期間不停運動，蛋白質(zhì)大分子構(gòu)象轉(zhuǎn)變和空間結(jié)構(gòu)變化發(fā)生了明顯活動軌跡。蛋白質(zhì)分子在不同構(gòu)象之間轉(zhuǎn)化較少，但是在空間位置上有比較明顯的變化。肌球蛋白從初始構(gòu)象到最終構(gòu)象變化的位置大致相同，主要分布在蛋白質(zhì)分子頂端、右端和連接尾部位置。主要變化位置觀察到大部分是由β-折疊、β-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)卷曲，顯示出較少α-螺旋結(jié)構(gòu)變化，說明界面蛋白質(zhì)具有穩(wěn)定的主鏈結(jié)構(gòu)。有研究表明，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)數(shù)量增多對蛋白質(zhì)吸附于油-水界面起到積極作用[9]，說明MD模擬的肌球蛋白結(jié)構(gòu)變化與乳液形成過程蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)傾向變化相符。

圖2 不同油相體積分數(shù)乳液體系的微觀結(jié)構(gòu)及其對應(yīng)的肌球蛋白3D結(jié)構(gòu)Fig.2 Microstructure of emulsion systems with different proportions of oil phase and 3D structure of myosin in them

圖3 不同油相體積分數(shù)乳液體系中肌球蛋白最終構(gòu)象與起始構(gòu)象疊合和局部放大圖Fig.3 Superposition and local zoom-in of final and initial conformation of myosin in emulsion systems with different proportions of oil phase

值得注意的是，在不同油相體系中，蛋白質(zhì)在連接尾部位置表現(xiàn)出明顯的不同構(gòu)象變化。在油相體積分數(shù)為68%的乳液體系中，會發(fā)生α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲之間的相互轉(zhuǎn)變。從微觀結(jié)構(gòu)可以看出，蛋白吸附到油-水界面可以形成蛋白質(zhì)膜將液滴包裹，此時乳液體系的液滴粒徑較均勻（圖2B）。MD模擬顯示該蛋白質(zhì)含有較多的色氨酸（tryptophan，Trp）和酪氨酸（tyrosine，Tyr）殘基，乳液體系也相對穩(wěn)定。在油相體積分數(shù)70%乳液體系中，蛋白結(jié)構(gòu)中只有少量α-螺旋結(jié)構(gòu)和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)換。此時觀察到乳液為破乳狀態(tài)，這是由于蛋白質(zhì)界面遭到破壞，油脂溢出形成大油滴、乳液結(jié)構(gòu)被破壞。油-水界面完全被破壞，油滴大量聚集，乳液失去穩(wěn)定性，可能由該部位氨基酸殘基變化引起的蛋白質(zhì)構(gòu)象變化導(dǎo)致。由圖4可知，油相體積分數(shù)為70%乳液中，界面蛋白氨基酸殘基的均方根波動（root mean square fluctuation，RMSF）變化最大，且位于395～410位的氨基酸殘基RMSF變化最大，說明蛋白質(zhì)柔性不穩(wěn)定[25]。此外，乳化劑能夠乳化的油脂有限，當(dāng)油相體積分數(shù)較高時，可能會導(dǎo)致油滴增大，進一步導(dǎo)致界面膜解吸和塌陷，降低乳液穩(wěn)定性，也會產(chǎn)生破乳現(xiàn)象[17,26]。Wu Longkun等[27]研究結(jié)果顯示，油滴粒徑增大、蛋白質(zhì)膜被破壞，會導(dǎo)致液滴聚集。

圖4 不同油相體積分數(shù)乳液體系中肌球蛋白氨基酸殘基的RMSFFig.4 Root mean square fluctuation values of amino acid residues of myosin in emulsion systems with different proportions of oil phase

2.1.3 MD乳液蛋白二級結(jié)構(gòu)含量變化分析

圖5反映了0～100 ns時間內(nèi)肌球蛋白二級結(jié)構(gòu)隨模擬時間的變化。分子模型預(yù)測的肌球蛋白在80～100 ns內(nèi)的二級結(jié)構(gòu)含量如表1所示。MD模型中80～100 ns期間，在不同油相體積分數(shù)乳液中羅非魚肌球蛋白α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲相對含量存在一定差異，這可能會導(dǎo)致不同油相體積分數(shù)乳液體系中存在不同數(shù)量的化學(xué)鍵和作用力。

表1 基于分子模型預(yù)測的80～100 ns肌球蛋白二級結(jié)構(gòu)相對含量Table 1 Relative contents of secondary structures in myosin during 80–100 ns based on molecular model prediction %

圖5 MD模擬0～100 ns肌球蛋白結(jié)構(gòu)分布Fig.5 MD simulation of the distribution of myosin conformation in 0–100 ns

MD模擬顯示，每個體系在80～100 ns的軌跡變化中，α-螺旋結(jié)構(gòu)在油相體積分數(shù)為68%時相對含量最低（P＜0.05），在70%時又有所回升；相反地，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)在油相體積分數(shù)為68%時相對含量最高（P＜0.05）。β-折疊、β-轉(zhuǎn)角的含量變化可能是由蛋白結(jié)構(gòu)中的共價鍵和氫鍵變化導(dǎo)致[28]。油相體積分數(shù)變化導(dǎo)致乳液體系中β-折疊/轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)相對含量稍微上升或下降，但變化范圍不大，氫鍵數(shù)量隨模擬時間的變化（圖6A）也印證了這一結(jié)果。β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)相對含量變化說明在乳液體系中蛋白結(jié)構(gòu)處于比較松散的狀態(tài)。研究表明，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)與蛋白的聚集狀態(tài)有關(guān)，其比例越高，代表蛋白聚集度越高，反之則說明結(jié)構(gòu)越松散[29]。研究顯示，適度松散的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可以促進疏水基團暴露，對蛋白質(zhì)油脂乳化具有積極作用[30]。同時，分子模型模擬軌跡預(yù)測結(jié)果顯示，油相體積分數(shù)為68%時，肌球蛋白α-螺旋存在結(jié)構(gòu)解離，使疏水性氨基酸殘基暴露，疏水性增加，這與溶劑可及表面積（solvent accessible surface area，SASA）的結(jié)果一致（圖6B）。

圖6 模擬時間80～100 ns的氫鍵數(shù)量（A）和SASA（B）變化Fig.6 Changes of hydrogen bond (A) and SASA (B) for 80–100 ns simulation

在油-水界面，不同大小的蛋白質(zhì)聚集體的形成會使表面疏水性、巰基、氫鍵含量等發(fā)生不同的變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[31]。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致其乳化性質(zhì)變化，進一步影響乳液的形成和穩(wěn)定。由圖6B可知，在乳液體系中，SASA均顯著高于純蛋白質(zhì)（P＜0.05）。當(dāng)油相體積分數(shù)為68%時，蛋白質(zhì)SASA達到最高，氫鍵數(shù)量沒有明顯下降。說明在適當(dāng)?shù)乃嗪陀拖喹h(huán)境中，埋藏的疏水性殘基暴露在極性溶劑表面，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生正向變化，這對肌球蛋白乳液體系的穩(wěn)定性具有促進作用。在相似研究中，SASA被用來分析豬肉MP的疏水性，結(jié)果表明，SASA越大，對應(yīng)MP的疏水性越強[14]。

2.2 拉曼光譜分析

2.2.1 乳液體系中蛋白質(zhì)主鏈特征結(jié)構(gòu)的拉曼光譜分析

拉曼光譜不僅可以提供蛋白質(zhì)主鏈二級結(jié)構(gòu)的信息，還可以探索有關(guān)蛋白質(zhì)側(cè)鏈微環(huán)境和化學(xué)變化的相關(guān)信息[32]。由圖7可知，不同乳液體系中，界面MP在1 600～1 700 cm-1區(qū)域具有很強烈的酰胺I帶吸收峰，這一區(qū)域的譜帶能夠提供豐富的關(guān)于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的信息。其中1 600～1 640 cm-1表示β-折疊，1 640～1 650 cm-1表示無規(guī)卷曲、1 650～1 660 cm-1表示α-螺旋，1 660～1 700 cm-1表示β-轉(zhuǎn)角。通過拉曼光譜酰胺I帶高斯曲線擬合以及定量計算特征峰的峰面積得到蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分布結(jié)果如圖7B所示。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是指多肽主鏈的局部折疊模式，主要通過N—H和C＝O基團之間的氫鍵維持穩(wěn)定[33]。研究表明，蛋白質(zhì)從水溶液中吸附到油-水界面時，結(jié)構(gòu)可能更傾向于向α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變[34]。蛋白質(zhì)高斯擬合圖（圖7C～E）顯示，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)占據(jù)較大比例。圖7B顯示了相同的結(jié)果，這與MD模擬結(jié)果（表1和圖2）一致。不同的是，油相體積分數(shù)為68%時，乳液界面MP結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)的比例最大，可能是由于MP中還存在少量的肌動蛋白、原肌球蛋白和肌原蛋白。

圖7 不同油相體積分數(shù)乳液體系中界面MP的拉曼光譜圖（A）、二級結(jié)構(gòu)相對含量（B）及乳液界面蛋白質(zhì)的高斯擬合圖（C～E）Fig.7 Raman spectra (A),secondary structure composition (B),and Gaussian fitting (C–E) of MP adsorbed at the interface of emulsion systems with different proportions of oil phase

此外，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角在MP的二級結(jié)構(gòu)中也占據(jù)了較大比例，大約為40%，略高于MD模擬結(jié)果。導(dǎo)致該現(xiàn)象發(fā)生最有可能的原因有2 個：一是計算機和儀器存在不可避免的系統(tǒng)誤差；二是油-水界面上蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不完全同一，不同部位的界面蛋白可能存在不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。由圖7B可知，在油相體積分數(shù)為68%和70%的乳液體系中，α-螺旋構(gòu)象相對含量有所上升，同時也導(dǎo)致β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)相對含量下降。這一結(jié)果表明，乳液體系中油相體積分數(shù)增大，促進了蛋白質(zhì)解折疊，形成螺旋結(jié)構(gòu)。這一結(jié)果與分子模型預(yù)測的SASA（圖6B）結(jié)果相對應(yīng)。通常情況下，β-折疊和α-螺旋通過蛋白質(zhì)分子肽鏈之間的氫鍵維持穩(wěn)定，蛋白質(zhì)聚集改善了疏水環(huán)境，促進MP解折疊[35]。但在高油相體積分數(shù)的MP乳液體系中，蛋白質(zhì)發(fā)生解折疊的數(shù)量差異不大，說明高油相體積分數(shù)乳液體系中不同的疏水環(huán)境對MP發(fā)生解折疊沒有起到顯著作用。

2.2.2 乳液體系中蛋白質(zhì)側(cè)鏈特征結(jié)構(gòu)的拉曼光譜分析

在乳液系統(tǒng)中，蛋白質(zhì)是很好的乳化劑和穩(wěn)定劑。這是由于蛋白質(zhì)具有優(yōu)良的表面性質(zhì)，如親油性、親水性、高表面活性和疏水性氨基酸[36]。Trp和Tyr是2 種芳香族疏水氨基酸，主要參與水分子膜界面蛋白質(zhì)的折疊過程[37]。Trp殘基是其他氨基酸殘基中最大的側(cè)鏈，分析其在蛋白質(zhì)拉曼光譜中的強帶對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)解析具有重要意義[33]。Trp殘基的微環(huán)境變化可在拉曼光譜中760、1 340 cm-1處的特征峰觀察到。由圖8A可知，在油相體積分數(shù)為68%時，760、1 340 cm-1處具有較高的特征峰強度，說明Trp殘基環(huán)的伸縮振動，離開極性水溶液，被暴露在疏水環(huán)境中[38]。Trp殘基從極性環(huán)境中的包埋狀態(tài)向疏水環(huán)境中的暴露狀態(tài)轉(zhuǎn)變，疏水性增大。在黃油、豬油和大豆油與MP制備的乳液中觀察到形成了具有更穩(wěn)定乳化層的大豆油乳液[39]。此外，這一結(jié)果與分子模型在80～100 ns模擬過程中的SASA（圖6B）變化相對應(yīng)。

圖8 Trp和Tyr殘基的特征峰強度（A）和200～600 cm-1的拉曼光譜圖（B）Fig.8 Characteristic peak intensities (A) and Raman spectra in the range of 200–600 cm-1 (B) of Trp and Tyr residues

Trp和Tyr殘基特征峰強度變化均體現(xiàn)了乳液體系中蛋白質(zhì)側(cè)鏈的微環(huán)境變化。蛋白分子表面的Tyr殘基通常呈暴露狀態(tài)或包埋狀態(tài)，處于暴露狀態(tài)時可以與H2O結(jié)合，這與疏水微環(huán)境有關(guān)。拉曼光譜850、830 cm-1附近的特征峰強度變化體現(xiàn)了Tyr的費米共振，其變化是由于蛋白質(zhì)側(cè)鏈微環(huán)境發(fā)生改變。當(dāng)I850/I830≥1時，表示Tyr殘基在疏水環(huán)境中處于暴露狀態(tài)；當(dāng)I850/I830＜1時，表示Tyr殘基在疏水環(huán)境中處于包埋狀態(tài)。圖8A結(jié)果顯示，所有乳液體系中，I850/I830均大于1，說明MP的Tyr殘基在疏水環(huán)境中為暴露狀態(tài)。此時Tyr殘基可作為氫鍵的供體或受體與水結(jié)合，從而改善疏水環(huán)境。

油相體積分數(shù)70%的乳液體系中，Tyr殘基同樣暴露于疏水環(huán)境中，但體系不穩(wěn)定。疏水性氨基酸殘基的變化反映了先前MD模擬分析的結(jié)果，存在氫鍵的斷裂和生成，表明蛋白質(zhì)內(nèi)部暴露的疏水基團促進了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開。但疏水性和親水性之間的相互作用可能會導(dǎo)致I850/I830的顯著變化，因此還需要通過其他形式輔助才能更準確地分析蛋白質(zhì)分子表面Tyr殘基變化情況[40]。

500～550 cm-1的拉曼光譜歸屬于二硫鍵（S—S）。在此范圍內(nèi)的構(gòu)象有：500～510 cm-1處為gauche gauche-gauche（g-g-g）構(gòu)象的S—S 拉伸帶，515～525 cm-1處為gauche-gauche-trans（g-g-t）構(gòu)象的S—S拉伸帶，535～545 cm-1處為trans-gauche-trans（t-g-t）構(gòu)象的S—S拉伸帶。g-g-g構(gòu)象的譜帶表明MP中的一些二硫鍵處于較低勢能構(gòu)象，t-g-t構(gòu)象的譜帶是由于存在胱氨酸殘基構(gòu)象轉(zhuǎn)變或者Trp脂肪族側(cè)鏈的C—H彎曲振動。由圖8B可知，在拉曼光譜中，無法觀察到明顯屬于S—S的特征譜帶，這可能是由于水分子存在，放寬譜帶掩蓋了S—S和C—H鍵產(chǎn)生的譜帶[32]。

3 結(jié)論

為更準確研究不同油脂體積分數(shù)乳液體系中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，使用MD模擬結(jié)合拉曼光譜對乳液體系表面MP的構(gòu)象變化進行分析。結(jié)果顯示：α-螺旋結(jié)構(gòu)（相對含量48%左右）是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的重要組成部分，β-轉(zhuǎn)角、β-折疊和無規(guī)卷曲相對含量均為10%～26%；肌球蛋白3D空間結(jié)構(gòu)顯示，最終蛋白構(gòu)象與初始構(gòu)象相比，主要體現(xiàn)在空間位置發(fā)生變化；此外，不同油脂體積分數(shù)體系的蛋白質(zhì)在相似位置也發(fā)生了不同構(gòu)象變化，差距較大的是界面蛋白在連接尾部位置觀察到更多二級結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象變化，當(dāng)油相體積分數(shù)增大，β-轉(zhuǎn)角和β-折疊數(shù)量下降，促進了乳液體系中蛋白質(zhì)解折疊并向α-螺旋轉(zhuǎn)變。

疏水性氨基酸殘基的變化說明蛋白質(zhì)存在離子鍵和氫鍵的合成與斷裂，進一步說明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開情況以及內(nèi)部疏水基團的暴露情況。較穩(wěn)定的乳液體系中，肌球蛋白SASA較大，Trp和Tyr殘基暴露程度也大于其他體系，說明MP的Tyr殘基暴露于疏水環(huán)境，Trp殘基從包埋狀態(tài)轉(zhuǎn)變成暴露狀態(tài)，疏水相互作用增強，氫鍵數(shù)量增多。但是拉曼光譜中S—S特征峰沒有明顯譜帶，可能是由于蛋白質(zhì)中含有微量的胱氨酸殘基和C—H彎曲振動及水分子的存在?？偟膩碚f，MP乳液體系油-水界面蛋白質(zhì)主要通過改變結(jié)構(gòu)構(gòu)象和SASA促進Trp和Tyr附近微環(huán)境變化，改善內(nèi)部分子之間的氫鍵和疏水相互作用，從而提高乳液的穩(wěn)定性。該研究闡明了MP在乳液界面的結(jié)構(gòu)變化，為使用羅非魚MP制備穩(wěn)定乳液及其應(yīng)用提供了有價值的信息。