美拉德反應(yīng)影響甲殼類水產(chǎn)品致敏原致敏性的研究進(jìn)展

劉 萌，姚有容，張建華，李 穎，孫兆敏，卓澤晟，桓 霏，劉慶梅，劉光明,*

（1.廈門海洋職業(yè)技術(shù)學(xué)院海洋生物學(xué)院，福建 廈門 361100；2.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；3.廈門市智慧漁業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361100；4.澳門大學(xué)社會(huì)科學(xué)學(xué)院，澳門 999078；5.廈門蓮花醫(yī)院，福建 廈門 361009）

得益于沿海環(huán)境和豐富的水產(chǎn)品供應(yīng)量，亞洲地區(qū)的魚類、甲殼類、貝類和藻類等水產(chǎn)品人均消費(fèi)量遠(yuǎn)高于全球平均水平[1]。其中，甲殼類水產(chǎn)品因其味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富而廣受國(guó)人青睞，其年養(yǎng)殖量也穩(wěn)步提升（圖1）[2]。甲殼類水產(chǎn)品與魚、牛奶、雞蛋等食物被世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織認(rèn)定為最易過敏的八大類食物，其引起的食物過敏反應(yīng)屬于免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)，涉及到皮膚、胃腸、呼吸和心血管系統(tǒng)的一系列癥狀[3]。與雞蛋、牛奶等食物引起的“可自愈型”過敏反應(yīng)相比，由甲殼類水產(chǎn)品引起的食物過敏好發(fā)于成年人，且通常伴隨終生，嚴(yán)重影響過敏人群的生活質(zhì)量[4-5]。菲律賓和新加坡的青少年甲殼類水產(chǎn)品過敏比例分別達(dá)到5.12%和5.23%[6]；我國(guó)上海地區(qū)的食物過敏流行病學(xué)調(diào)查顯示，蝦類和蟹類的過敏比例達(dá)到過敏人群的19.92%[7]；而在內(nèi)陸地區(qū)江西省，蝦類水產(chǎn)品也已成為最常見的過敏食物[8]。較高的過敏發(fā)生率及交叉反應(yīng)帶來的甲殼類水產(chǎn)食品安全問題[9]也已經(jīng)成為制約水產(chǎn)品進(jìn)一步發(fā)展的因素之一。

圖1 甲殼類年養(yǎng)殖量及與水產(chǎn)品年總養(yǎng)殖量占比[2]Fig.1 Annual production of crustaceans and its proportion in the total amount of aquatic products[2]

食品在加工過程中經(jīng)歷的加熱、剪切等物理作用，以及組分之間內(nèi)源性的化學(xué)作用，均會(huì)影響食物的致敏性[10-11]。因此，低致敏性食品加工方式已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[12-13]。低致敏性加工方式主要是借助物理、化學(xué)或生物的方式改變食物致敏原的結(jié)構(gòu)或影響其抗原表位，進(jìn)而影響其致敏性，常見的加工方式可分為熱處理和非熱處理2 種[14]。甲殼類水產(chǎn)品中含有大量?jī)?yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，氨基酸的游離氨基或氨基酸殘基和還原糖的羰基在食品加工或長(zhǎng)期貯藏時(shí)形成共價(jià)鍵，為美拉德反應(yīng)（Maillard reaction，MR）的發(fā)生提供了前提[15]（圖2）。MR又稱羰胺反應(yīng)，是指發(fā)生在羰基化合物和氨基化合物之間的非酶褐變反應(yīng)，廣泛應(yīng)用于改善食品色澤和風(fēng)味相關(guān)的食品加工行業(yè)中[16]；研究表明其可影響甲殼類水產(chǎn)品的致敏性[10]，但因其反應(yīng)的復(fù)雜性、晚期產(chǎn)物中可能存在有害產(chǎn)物等因素[17]，也制約了其在水產(chǎn)食品工業(yè)中的應(yīng)用。

圖2 MR示意圖[15]Fig.2 Schematic of MR[15]

本文首先對(duì)MR方法進(jìn)行系統(tǒng)介紹，同時(shí)，從結(jié)構(gòu)和抗原表位的角度闡述甲殼類水產(chǎn)品致敏原的研究進(jìn)展；在此基礎(chǔ)上，著重對(duì)甲殼類水產(chǎn)品致敏原經(jīng)MR處理后致敏性變化及其作用機(jī)理進(jìn)行綜述。旨在為MR用于甲殼類水產(chǎn)品致敏原致敏性控制與消減提供參考。

1 MR方法

MR主要有干熱法和濕熱法2 種[18]。早期的MR均為干法，其特點(diǎn)在于蛋白質(zhì)和還原糖先經(jīng)凍干處理，低溫（50～60 ℃）下混合即可發(fā)生MR。此方法操作簡(jiǎn)單，但存在明顯的缺點(diǎn)，蛋白質(zhì)和還原糖需要分別冷凍干燥，明顯延長(zhǎng)了整個(gè)MR的時(shí)間；反應(yīng)需嚴(yán)格控制反應(yīng)容器的濕度，也進(jìn)一步增加了MR的工業(yè)化應(yīng)用成本；此外，反應(yīng)過程中沒有額外溶劑的存在，反應(yīng)物蛋白質(zhì)和還原糖可能接觸不充分，進(jìn)而影響MR的效果；產(chǎn)物混合后數(shù)天至數(shù)周的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)一步消耗了反應(yīng)物中的游離氨基酸，增加了MR產(chǎn)物的復(fù)雜性，不利于食品營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。因此，干法短時(shí)和濕法MR逐漸受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的青睞[19-20]。干法短時(shí)是將干法MR反應(yīng)時(shí)間控制在數(shù)小時(shí)之內(nèi)，F(xiàn)u Linglin等[19]發(fā)現(xiàn)，殼寡糖的干法短時(shí)MR可顯著降低食品過敏原致敏性。濕法MR在一定pH值的緩沖液中進(jìn)行，增加了反應(yīng)物的接觸，有助于反應(yīng)溫度的提高，因此所需的反應(yīng)時(shí)間大大縮短；但液體狀態(tài)下的反應(yīng)產(chǎn)物在工業(yè)生產(chǎn)中的運(yùn)輸存在一定限制，也影響了其在工業(yè)上的大規(guī)模應(yīng)用[18]。

此外，超聲波[21]、輻照[22]、脈沖電場(chǎng)[23]等非熱加工方式輔助MR的相關(guān)研究也越來越多，表1詳細(xì)總結(jié)了不同類型MR方法的優(yōu)劣。超聲波處理產(chǎn)生的空化效應(yīng)所形成的能量及高溫有助于提高M(jìn)R中晚期的速率，并且具有改善產(chǎn)物溶解性和乳化性的潛力[24]，Hu Hao等[25]認(rèn)為這也有助于改變蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象或修飾其抗原表位，Zhang Ziye等[26]報(bào)道了高強(qiáng)度超聲（100～800 W、15 min）可破壞過敏原的空間結(jié)構(gòu)，引起關(guān)鍵氨基酸的自由基氧化，進(jìn)而降低其致敏性；雖然超聲輔助MR可有效改善食品的性質(zhì)，但過高的超聲功率可能會(huì)產(chǎn)生一些有害成分，如丙烯酰胺和5-羥甲基糠醛，因此，實(shí)際使用時(shí)，需先依據(jù)具體的反應(yīng)物質(zhì)探究其適宜的反應(yīng)條件[18]。微波處理時(shí)的偶極極化和離子傳導(dǎo)產(chǎn)生大量熱量，引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及二硫鍵、氫鍵等非共價(jià)鍵的破壞，此外，微波處理還可以通過解開碳鏈以促進(jìn)多糖分子的重排和相互作用，進(jìn)而影響MR的發(fā)生[18]；Nasrollahzadeh等[22]發(fā)現(xiàn)，牛血清白蛋白和麥芽糊精經(jīng)微波加熱輔助MR短時(shí)處理（90 ℃、450 W）即可有效降低反應(yīng)物中的游離氨基酸含量，并進(jìn)一步改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、自由基清除活性及乳化性等性質(zhì)。脈沖電場(chǎng)處理也是一種新興的非熱食品加工技術(shù)，其在改變生物大分子微觀結(jié)構(gòu)和相互作用方面具有較大的潛能[27]，MR反應(yīng)物經(jīng)脈沖電場(chǎng)處理后，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)部分展開，暴露出一些隱藏的疏水基團(tuán)、巰基等；同時(shí)多糖鏈發(fā)生解聚，分子間反應(yīng)概率增加，有助于MR的進(jìn)行[28]。Wang Zhonghe等[29]報(bào)道，葡萄糖和甘氨酸可在pH 9.0、10～50 kV/cm經(jīng)脈沖電場(chǎng)處理0.8～4.0 ms時(shí)發(fā)生MR，此時(shí)MR并未到達(dá)晚期階段，產(chǎn)物發(fā)生顏色變化且抗氧化活性較好。雖然超聲波等新型MR輔助方法在甲殼類水產(chǎn)品加工工業(yè)應(yīng)用中還存在一定的局限性，但它們具有反應(yīng)效率高、反應(yīng)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。因此在了解其作用機(jī)制的前提下，如何控制MR反應(yīng)條件以改善蛋白質(zhì)性質(zhì)仍然值得進(jìn)一步探究。

表1 不同類型MR方法的比較Table 1 Comparison of different types of MR

當(dāng)前甲殼類水產(chǎn)品致敏性的相關(guān)研究多集中在干法MR對(duì)其致敏原致敏性的影響，也有部分報(bào)道表明濕法MR可有效降低甲殼類水產(chǎn)品致敏原致敏性[30]，其作用機(jī)理主要包括對(duì)致敏原結(jié)構(gòu)和抗原表位的影響。對(duì)于甲殼類水產(chǎn)品致敏原種類、結(jié)構(gòu)和抗原表位的研究，有助于低致敏性MR加工方式的探究及其在工業(yè)上的推廣和應(yīng)用。

2 甲殼類水產(chǎn)品致敏原結(jié)構(gòu)及抗原表位

甲殼類水產(chǎn)品屬于節(jié)肢動(dòng)物門，常見的可食用種類包括蝦、蟹、龍蝦等[3]。致敏原的存在是引起甲殼類水產(chǎn)品過敏的主要原因，目前已經(jīng)被鑒定的甲殼類水產(chǎn)品致敏原主要來自EF手型的鈣離子結(jié)合蛋白家族、肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白家族和磷酸原激酶家族[31]，且多集中于肌肉等可食部分[1]。從種類來看主要有包括原肌球蛋白（tropomyosin，TM）、精氨酸激酶（arginine kinase，AK）、肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）、肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白（sarcoplasmic calcium binding protein，SCP）和磷酸丙糖異構(gòu)酶（triosephosphate isomerase，TIM）等在內(nèi)的47 種致敏原被WHO/國(guó)際免疫學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)（International Union of Immunological Societies，IUIS）數(shù)據(jù)庫(kù)收錄并命名（表2）。

表2 WHO/IUIS數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的甲殼類水產(chǎn)品致敏原Table 2 Crustacean allergens registered in WHO/IUIS database

2.1 致敏原結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)結(jié)晶法是較為常用且準(zhǔn)確的解析致敏原結(jié)構(gòu)的方法[34]。表3總結(jié)了目前已報(bào)道的甲殼類水產(chǎn)品致敏原晶體結(jié)構(gòu)的相關(guān)信息。

表3 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（protein data bank，PDB）收錄的甲殼類水產(chǎn)品致敏原晶體結(jié)構(gòu)Table 3 Crystal structure of crustacean allergens registered in the protein data bank (PDB)

TM屬于肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白家族，是與肌動(dòng)蛋白結(jié)合并調(diào)節(jié)肌鈣蛋白和肌凝蛋白相互作用的螺旋狀蛋白質(zhì)，2 條α-螺旋相互纏繞而成的空間結(jié)構(gòu)增加了其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，使其經(jīng)高溫、高壓等加工處理后仍能保持較強(qiáng)的致敏性[35]。但囿于TM線狀結(jié)構(gòu)，無法長(zhǎng)成適合X射線衍射的晶體形狀，甲殼類TM的相關(guān)晶體結(jié)構(gòu)報(bào)道較少。

AK是可催化磷酸基從ATP可逆轉(zhuǎn)移到精氨酸的激酶，其空間結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，甲殼類中僅有Lit v 2（PDB：4AM1）[36]和Scy p 2（PDB：5ZHQ）的晶體結(jié)構(gòu)被報(bào)道[37]。AK的N端含有多個(gè)α-螺旋組成的α-螺旋結(jié)構(gòu)域，C端的α-β結(jié)構(gòu)域含有多個(gè)不同的α-螺旋和β-折疊，其致敏性變化與空間結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)較大[37]。

MLC屬于EF手型家族，在機(jī)體內(nèi)可調(diào)節(jié)平滑肌的收縮，其空間結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主[10]，具有較好的耐熱、耐消化特性[38]，其晶體結(jié)構(gòu)報(bào)道較少。

SCP是典型的EF手型鈣離子結(jié)合蛋白，具有較好的耐熱、耐消化特性[39]，甲殼類中僅有Scy p 4（PDB：7WBO）的晶體結(jié)構(gòu)被報(bào)道；Scy p 4的晶體結(jié)構(gòu)證實(shí)了它是一個(gè)球狀分子，該結(jié)構(gòu)包括9 個(gè)α-螺旋，約占結(jié)構(gòu)的61%。2 個(gè)相鄰的α-螺旋和連接環(huán)構(gòu)成了螺旋-環(huán)狀-螺旋的EF手型基序[40]。

TIM是糖酵解中的關(guān)鍵酶，在機(jī)體的代謝中發(fā)揮了重要作用，其一級(jí)、二級(jí)結(jié)構(gòu)保守性較高，甲殼類中僅有P.vannamei中的TIM（PDB：5EYW）[41]和Scy p 8（PDB：6JOX）[42]的晶體結(jié)構(gòu)被報(bào)道。其結(jié)構(gòu)中主要包括由多個(gè)中心β-鏈和多個(gè)環(huán)連接的α-螺旋組成的(β/α)8桶狀結(jié)構(gòu)，活性位點(diǎn)通常位于β-鏈，位于具有βα環(huán)的桶狀結(jié)構(gòu)的C端。

此外，甲殼類水產(chǎn)品致敏原中90 kDa的細(xì)絲蛋白C（Scy p 9，PDB：7VZO）的晶體結(jié)構(gòu)也已經(jīng)被報(bào)道[34]，其屬于絲蛋白家族，三級(jí)結(jié)構(gòu)為具有免疫球蛋白樣褶皺的二聚體，單體為由16 個(gè)β-鏈和2 個(gè)α-螺旋組成的桶狀結(jié)構(gòu)；結(jié)構(gòu)域之間含有保守區(qū)域。

CT(Computed Tomography)，即電子計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)在醫(yī)學(xué)病情診斷等領(lǐng)域具有重要地位。然而CT技術(shù)的應(yīng)用對(duì)其系統(tǒng)精度具有較高的要求，少許誤差即可能造成診斷失誤。[1-2]但實(shí)際CT系統(tǒng)成像往往存在一定的機(jī)械誤差，使得其成像效果與理想設(shè)計(jì)值之間偏差較大。且CT系統(tǒng)射線源、轉(zhuǎn)臺(tái)和探測(cè)器間的相對(duì)位置關(guān)系，以及標(biāo)定模板信息的離散性均會(huì)影響重建圖像是否存在偽影。此外，運(yùn)動(dòng)偽影也是造成CT系統(tǒng)誤差的一個(gè)重要因素，[3-5]研究運(yùn)動(dòng)偽影的消除技術(shù)對(duì)研究如何提高成像質(zhì)量具有重要意義。

結(jié)構(gòu)解析是明確其致敏性差異的基礎(chǔ)，但蛋白質(zhì)本身是否能結(jié)晶、結(jié)晶條件的摸索和優(yōu)化不易、晶體結(jié)構(gòu)解析難度大等因素，使得甲殼類水產(chǎn)品致敏原晶體結(jié)構(gòu)解析進(jìn)展緩慢。甲殼類不同物種間的致敏原序列同源性較高[43]，SWISS-MODEL、AlphaFold2等生物信息學(xué)軟件可基于已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，借助同源建模方法或氨基酸序列同源性分析等預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)[44-45]，為甲殼類水產(chǎn)品致敏原的結(jié)構(gòu)研究提供了新的思路[46]。

2.2 致敏原抗原表位

食物致敏原的實(shí)質(zhì)是具有多個(gè)IgE結(jié)合表位的蛋白質(zhì)，致敏原的致敏性主要取決于其IgE結(jié)合表位[47]，IgE結(jié)合表位按其空間結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可分為線性表位和構(gòu)象表位[48]。線性表位是指一級(jí)序列上連續(xù)的氨基酸，具有較強(qiáng)的耐加工、耐消化特性。構(gòu)象表位是蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)上鄰近的氨基酸，這部分表位對(duì)其空間結(jié)構(gòu)依賴性較強(qiáng)，易受加工熱處理和胃腸道消化的影響而不穩(wěn)定，因此國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)甲殼類水產(chǎn)品致敏原抗原表位的研究普遍集中在線性表位上。已具有IUIS系統(tǒng)命名的龍蝦致敏原抗原表位主要集中在小龍蝦（P.clarkii）中，AK的6 個(gè)線性表位、MLC的4 個(gè)線性表位和5 個(gè)構(gòu)象表位區(qū)域、TIM的5 個(gè)線性表位已經(jīng)先后被鑒定（表4）。蟹類食物致敏原的抗原表位主要集中在青蟹（S.paramamosain）中，Liu Guangyu等[49]以TM多克隆抗體為靶庫(kù)結(jié)合噬菌體展示技術(shù)確定青蟹的8 個(gè)線性表位和7 個(gè)構(gòu)象表位區(qū)域；Li Mengsi等[39]基于一珠一化合物（one bead and one compound，OBOC）和噬菌體展示技術(shù)確定青蟹的10 個(gè)線性表位和3 個(gè)表位區(qū)域；Liu Meng等[38]采用模擬胃腸液連續(xù)消化模型結(jié)合質(zhì)譜分析確定青蟹TM的7 個(gè)耐熱、耐消化的線性表位。此外，青蟹AK、MLC、SCP和TIM等致敏原的相關(guān)表位也陸續(xù)被鑒定（表4）。目前來看，蝦類食物致敏原的抗原表位主要集中在L.vannamei中，TM、AK、MLC和SCP的抗原表位均已被鑒定；此外，其余蝦類食物中，如E.modestus、M.ensis，抗原表位的相關(guān)研究均集中在主要致敏原TM中。表4總結(jié)了甲殼類水產(chǎn)品致敏原已被鑒定的線性表位和構(gòu)象表位。

表4 甲殼類水產(chǎn)品致敏原抗原表位Table 4 Epitopes of crustacean allergens

致敏原線性抗原表位的定位主要有重疊肽技術(shù)、抗原抗體復(fù)合物共結(jié)晶技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、OBOC篩選技術(shù)等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法。Ayuso等[52]通過重疊肽技術(shù)鑒定了Lit v 1的3 個(gè)線性表位、Lit v 2的7 個(gè)線性表位、Lit v 3的5 個(gè)線性表位、Lit v 4的3 個(gè)線性表位；Yang Yang等[60]基于血清和抗體為靶蛋白庫(kù)，利用噬菌體展示技術(shù)篩選得到Scy p 2的7 個(gè)線性表位和8 個(gè)構(gòu)象表位區(qū)域。但不同實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法原理不同，篩選出的抗原表位有所區(qū)別，Li Mengsi等[39]對(duì)比分析噬菌體展示技術(shù)和OBOC篩選技術(shù)對(duì)于定位Scy p 3抗原表位的區(qū)別，發(fā)現(xiàn)2 種方法篩選出的構(gòu)象表位有部分重合，這些重合的表位可能是致敏原的主要致敏表位。

相比于傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法確定抗原表位，多種生物信息學(xué)軟件聯(lián)用可以快速且有針對(duì)性地預(yù)測(cè)潛在的抗原表位，F(xiàn)u Linglin等[67]利用DNAStar、AntheProt、BepiPred 1.0、ABCpred和Immunomedicine Group 5 種生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)獲得P.chinensisTM的10 個(gè)線性表位、Pen c 2的7 個(gè)線性表位；Liu Meng等[38]基于多種生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)，采用模擬胃腸液連續(xù)消化模型結(jié)合質(zhì)譜分析獲得Scy p 1的7 個(gè)線性表位。

此外，食品過敏原構(gòu)象表位可引起口腔過敏綜合征[68]，但考慮到構(gòu)象表位的不穩(wěn)定性和致敏原晶體結(jié)構(gòu)的匱乏，甲殼類水產(chǎn)品致敏原構(gòu)象表位的研究方法以噬菌體展示技術(shù)、OBOC篩選技術(shù)等方法為主，Yang Yang等[60]利用噬菌體展示技術(shù)篩選得到Scy p 2的8 個(gè)構(gòu)象表位區(qū)域，Li Mengsi等[39]采用OBOC也確定了Scy p 3的構(gòu)象表位區(qū)域。但這類方法技術(shù)門檻較高、實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，且篩選結(jié)果容易出現(xiàn)假陽性，需結(jié)合分子突變技術(shù)對(duì)陽性表位進(jìn)一步驗(yàn)證。

甲殼類水產(chǎn)品致敏原抗原表位的研究多集中在主要致敏原TM中，且當(dāng)前抗原表位多以線性表位為主。單一方法定位抗原表位存在檢測(cè)率及準(zhǔn)確性等方面的局限；預(yù)測(cè)、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等多種方式聯(lián)用可較為全面地鑒定抗原表位，甲殼類水產(chǎn)品致敏原抗原表位的相關(guān)研究還需要進(jìn)一步加強(qiáng)。

3 甲殼類水產(chǎn)品致敏原的MR處理

基于國(guó)內(nèi)外學(xué)者目前的研究，MR可通過改變致敏原的結(jié)構(gòu)，或者影響氨基酸之間的交聯(lián)、以糖基化等方式化學(xué)修飾致敏原，以掩蓋、暴露、形成食品致敏原抗原表位，進(jìn)而影響食品致敏原的致敏性[69-70]。雖然MR引起反應(yīng)物結(jié)構(gòu)及與IgE結(jié)合能力的變化，但其并非一定能降低致敏原的致敏性[71]，Lit v 1與麥芽糖經(jīng)MR后，其致敏性未發(fā)生顯著變化[72]。此外，不同類型的蛋白質(zhì)，其致敏性本身也有較大不同，因此本文總結(jié)了已報(bào)道的甲殼類水產(chǎn)品致敏原經(jīng)MR后的致敏性變化情況（表5）。

表5 已報(bào)道的MR對(duì)甲殼類水產(chǎn)品致敏原致敏性的影響Table 5 Influence of reported MR on the allergenicity of crustacean allergens

3.1 甲殼類TM的MR處理

甲殼類水產(chǎn)品致敏原的MR相關(guān)研究均集中于TM，其主要原因可能有2 個(gè)：1）TM是甲殼類中的主要致敏原，人群中致敏頻率較高[38]；2）TM的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、熱變性溫度較高、熱穩(wěn)定性較好[77]，常規(guī)熱處理無法完全降低其致敏性，因此對(duì)其進(jìn)行加工處理更有實(shí)際應(yīng)用意義。TM致敏性降低的原因主要有：1）結(jié)構(gòu)的變化：TM的空間結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，α-螺旋的變化對(duì)致敏性影響較大；如Pen c 1[19]、Pen a 1[75]等發(fā)生的MR反應(yīng)，致敏原二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋解開，致敏原分子呈舒展?fàn)顟B(tài)，構(gòu)象變化較大；2）氨基酸的修飾：具有ε-氨基的賴氨酸可以發(fā)生縮合反應(yīng)，精氨酸中的胍基也已經(jīng)被證明可以參與MR[78]；TM抗原表位上賴氨酸、精氨酸、組氨酸等也是參與MR的主要氨基酸，這也是甲殼類TM致敏性降低的原因之一[19,76]；Scy p 1抗原表位（R105-A116）中第112位的賴氨酸在MR中被修飾[30]，Lit v 1中19 個(gè)賴氨酸和18 個(gè)精氨酸也被發(fā)現(xiàn)發(fā)生了位點(diǎn)修飾[20]。此外，有學(xué)者認(rèn)為不含賴氨酸或精氨酸殘基的抗原表位具有較高的IgE結(jié)合親和力，隨后的研究也證明MR可以修飾組氨酸和半胱氨酸[20]，反應(yīng)發(fā)生在組氨酸中的咪唑基團(tuán)，而色氨酸中的吲哚基團(tuán)也可以被MR所修飾[79]，進(jìn)而影響其致敏性；3）干預(yù)免疫系統(tǒng)：Exo m 1與半乳糖低聚糖、甘露聚糖低聚糖和麥芽糖戊糖發(fā)生MR后，小鼠體內(nèi)嗜堿性粒細(xì)胞的脫顆粒程度降低，免疫信號(hào)通路被抑制，小鼠致敏癥狀減弱、致敏性降低[74]；Exo m 1與D-葡萄糖、麥芽三糖、麥芽五糖、麥芽七糖發(fā)生MR后，糖化產(chǎn)物可顯著影響噬堿性粒細(xì)胞KU812的激活、且腸上皮黏膜細(xì)胞Caco-2中白細(xì)胞介素8的釋放被抑制，其致敏性降低[71]。

Fu Linglin等[19]報(bào)道，P.chinensis中TM經(jīng)MR處理時(shí)，相較于核糖、半乳糖寡糖，殼寡糖可在較短反應(yīng)時(shí)間內(nèi)迅速降低TM的致敏性。相較于麥芽三糖、麥芽五糖、麥芽七糖等，麥芽糖對(duì)Lit v 1致敏性沒有顯著的影響，其主要原因在于產(chǎn)物中具有糖基化位點(diǎn)（如賴氨酸）的TM表位可能被破壞，同時(shí)可能產(chǎn)生AGEs新表位；抗原表位損失與AGEs新表位產(chǎn)生之間的平衡改變[72]。這表明，MR中不同糖類可引起不同程度的蛋白質(zhì)構(gòu)象伸展或折疊，對(duì)賴氨酸等抗原表位上的氨基酸進(jìn)行不同程度的修飾，從而對(duì)其致敏性起到?jīng)Q定性作用[12]，但當(dāng)前鮮有還原糖種類/含量與致敏原致敏性之間構(gòu)效關(guān)系的相關(guān)研究。MR過程中應(yīng)注意選擇還原糖的類型，以避免產(chǎn)生抵消致敏性降低的新致敏原[69,71]。

干法和濕法MR均可以降低蝦蟹TM的致敏性，但已報(bào)道的MR處理時(shí)間均較短，這可能跟蝦蟹高蛋白含量及豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有關(guān)[80]，較短的反應(yīng)時(shí)間可最大程度避免食品中營(yíng)養(yǎng)成分的流失。

3.2 甲殼類其他致敏原的MR處理

青蟹過敏人群中AK的陽性率高達(dá)42.31%，遠(yuǎn)高于TM的30.77%；SCP的陽性率也高達(dá)15.38%[38]，因此也有學(xué)者對(duì)這類過敏原進(jìn)行MR處理。Scy p 2與阿拉伯糖發(fā)生MR后，小鼠的過敏癥狀得到顯著改善，Th1型細(xì)胞因子表達(dá)升高、Th2型細(xì)胞因子表達(dá)明顯下調(diào)；其致敏性下降的主要原因在于Scy p 2抗原表位中的賴氨酸和精氨酸在MR過程中發(fā)生了明顯的位點(diǎn)修飾[30]。Scy p 4與木糖發(fā)生MR后，蛋白微觀結(jié)構(gòu)變得松散，球狀結(jié)構(gòu)中α-螺旋解開、β-折疊含量升高，疏水性增加，IgE結(jié)合能力降低[76]。相較于簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)的TM，甲殼類水產(chǎn)品AK、SCP等致敏原具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)對(duì)其致敏性的影響更大，在MR過程中致敏原二級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞、表面電荷或表面疏水性發(fā)生變化，進(jìn)而引起空間結(jié)構(gòu)的變化，其致敏性也會(huì)隨之出現(xiàn)明顯變化[81]。

此外，也有學(xué)者基于甲殼類水產(chǎn)品基質(zhì)探究了MR對(duì)L.vannamei可食部分免疫結(jié)合活性的影響及其相關(guān)機(jī)理[20]，L.vannamei與半乳糖在高溫高壓反應(yīng)后，其可食部分的質(zhì)構(gòu)發(fā)生明顯變化、可消化性提高、蝦肉的免疫結(jié)合活性顯著降低，其原因可能是基質(zhì)中Lit v 1、Lit v 2、Lit v 3和Lit v 4抗原表位上的賴氨酸、精氨酸和半胱氨酸經(jīng)MR后發(fā)生了修飾。

MR可作為低致敏性甲殼類水產(chǎn)品加工的候選方法，其機(jī)理主要在于：1）對(duì)致敏原結(jié)構(gòu)的修飾，如α-螺旋等二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞、二硫鍵的修飾、疏水性改變等引起的空間結(jié)構(gòu)變化；2）抗原表位上賴氨酸、精氨酸等的修飾，這種修飾又進(jìn)一步引起其結(jié)構(gòu)的變化，最終影響致敏原與IgE的結(jié)合。但目前的研究對(duì)于反應(yīng)物（還原糖和蛋白質(zhì)）與甲殼類水產(chǎn)品致敏原致敏性之間的構(gòu)效關(guān)系研究還不足，此外，重視單一致敏原致敏性而忽視其食物基質(zhì)致敏性的研究，也制約了MR的工業(yè)化應(yīng)用。

4 結(jié)語

MR是食品加工及貯藏過程中常見的非酶褐變反應(yīng)，可增加食品風(fēng)味、改善蛋白質(zhì)的功能特性，也可有效降低甲殼類水產(chǎn)品致敏原致敏性。本文首先對(duì)MR方法進(jìn)行了系統(tǒng)介紹；同時(shí)，從結(jié)構(gòu)和抗原表位的角度闡述了甲殼類水產(chǎn)品致敏原的研究進(jìn)展；在此基礎(chǔ)上，著重對(duì)甲殼類水產(chǎn)品致敏原經(jīng)MR處理后致敏性變化及其作用機(jī)理進(jìn)行綜述。相較于干法和濕法MR，超聲波等新型輔助方法展現(xiàn)出反應(yīng)效率高、反應(yīng)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，但其在甲殼類水產(chǎn)品致敏性中的相關(guān)研究還較少。致敏原的結(jié)構(gòu)和抗原表位對(duì)于解析其致敏性變化、開發(fā)低致敏性加工方式等具有重要意義，基于致敏原晶體結(jié)構(gòu)的抗原表位解析定位是了解致敏原致敏機(jī)理的前提；但甲殼類水產(chǎn)品致敏原晶體結(jié)構(gòu)及家族分類信息還不足。MR可降低甲殼類水產(chǎn)品致敏性，主要機(jī)理在于其改變了致敏原結(jié)構(gòu)、修飾了抗原表位位點(diǎn)等，但其受致敏原和還原糖種類的影響，因此適合工業(yè)化的反應(yīng)條件仍需要摸索。

在MR影響甲殼類致敏性的相關(guān)研究中還有以下幾個(gè)方面亟待解決：1）進(jìn)一步加強(qiáng)超聲波等新型MR輔助技術(shù)的相關(guān)研究，控制MR反應(yīng)程度，盡快實(shí)現(xiàn)低致敏性甲殼類水產(chǎn)品生產(chǎn)技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用；2）甲殼類水產(chǎn)品的MR相關(guān)研究起步較晚、研究不深入，致敏原致敏性影響因素較多，MR與甲殼類水產(chǎn)品致敏性的構(gòu)效關(guān)系尚不明確，基于工業(yè)化應(yīng)用的角度，仍需要加大對(duì)其構(gòu)效關(guān)系的解析；3）食品中的MR涉及到食物基質(zhì)等的影響，但目前的研究多集中于單一致敏原的MR，難以真正全面衡量MR降低甲殼類水產(chǎn)品致敏性的效果，因此，基于全食品的MR研究迫在眉睫。