異黃酮與β-伴大豆球蛋白的相互作用及其對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和潛在致敏性的影響

鄧 雯，廖雅如，黃麗衡，楊安樹,2,*，陳紅兵,2

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與資源挖掘全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

大豆?fàn)I養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，是人們?nèi)粘ｏ嬍持兄匾牡鞍踪|(zhì)來源[1]。但大豆又是常見的過敏食物之一，目前仍沒有可完全治愈大豆過敏的方法，患者最有效的方法是規(guī)避攝入大豆過敏原[2]。β-伴大豆球蛋白（β-conglycinin，BCG）是大豆中的主要過敏原之一[3]。迄今為止，工業(yè)上使用的任何單一的食品加工處理都不能完全消除大豆的致敏性[4]，而且還極易破壞大豆的營(yíng)養(yǎng)成分與功能特性[5]。所以，尋找安全有效的新型方法降低大豆致敏性具有重要意義。大豆異黃酮是一種植物類雌激素[6]，其中活性成分主要為染料木素（genistein，Gen）、大豆苷元（daidzein，Dai）和黃豆黃素（glycitein，Gly），具有抗氧化[7]、抗過敏、預(yù)防骨質(zhì)疏松、防癌抗癌等功效[8]。研究顯示，大豆異黃酮可以調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡、減少免疫因子合成、加強(qiáng)人體對(duì)致敏食物的耐受[9]。有研究表明，大豆異黃酮可顯著減少花生過敏小鼠的肥大細(xì)胞脫顆粒，有效緩解小鼠過敏癥狀的發(fā)生[10]。迄今為止，黃酮類化合物抗過敏的相關(guān)報(bào)道，多數(shù)文獻(xiàn)主要圍繞黃酮類化合物本身開展抗過敏作用研究，一般通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)的平衡和減少效應(yīng)細(xì)胞中活性介質(zhì)的釋放來緩解過敏反應(yīng)。近年來，從食物組分干預(yù)的角度研究抗過敏作用受到廣泛關(guān)注，如通過主要過敏蛋白與多酚類、黃酮類活性物質(zhì)發(fā)生相互作用，可降低花生過敏蛋白的致敏性[11-12]。由于不同種類異黃酮與不同過敏蛋白的相互作用機(jī)制及其對(duì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)與致敏性的影響也存在差異，大豆異黃酮能否改變大豆中主要過敏原蛋白的結(jié)構(gòu)從而影響其致敏性，有待進(jìn)一步研究。

本研究以Gen、Dai 2 種活性異黃酮和BCG為研究對(duì)象，利用熒光光譜法分析異黃酮與蛋白相互作用機(jī)制及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，并利用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法和免疫印跡評(píng)估復(fù)合物及其消化產(chǎn)物的致敏性，以期在分子水平為活性大豆異黃酮與BCG相互作用機(jī)制提供新的見解，并為其在食物過敏預(yù)防和管理中的潛在應(yīng)用提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BCG（純度為84.1%）實(shí)驗(yàn)室自制；Gen、Dai（純度≥98%）上海源葉生物科技有限公司；苯氨基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、胃蛋白酶、胰蛋白酶、生物素標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）美國(guó)Sigma公司；大豆過敏患者血清（詳細(xì)信息見表1）重慶曼紐艾克科技有限公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的鏈霉親和素 深圳欣博盛生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

表1 大豆過敏患者血清信息Table 1 Sera information about soybean allergic patients participating in this study

1.2 儀器與設(shè)備

F-4600熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；MOS-450圓二色光譜儀 法國(guó)Bio-Logi公司；UV WinLab紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Perkin Elmer公司。

1.3 方法

1.3.1 熒光猝滅光譜分析

首先掃描BCG樣品（2×10-6mol/L）的熒光光譜，再依次將60 μL異黃酮溶液（2×10-4mol/L）等分10 次加入，掃描混合溶液的熒光光譜。同時(shí)掃描磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）的熒光光譜作為空白對(duì)照，并扣除相應(yīng)濃度異黃酮溶液的熒光。光譜條件：在溫度298 K和314 K下，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)（λex）為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)（λem）為250～500 nm，狹縫寬度為2.5 nm，固定掃描速率為1 200 nm/min。分別以Gen、Dai濃度為橫坐標(biāo)、F0/F為縱坐標(biāo)擬合得到Stern-Volmer曲線進(jìn)行分析，方程如式（1）所示：

式中：F和F0分別為有、無猝滅劑時(shí)的大分子熒光強(qiáng)度；[Q]為淬滅劑濃度/（mol/L）；KSV為猝滅常數(shù)/（L/（mol·s））；Kq為生物分子的猝滅速率常數(shù)/（L/mol）；τ0為無猝滅劑時(shí)生物大分子的平均壽命（10-8s）。

1.3.2 同步熒光光譜分析

在Δλ=15/60 nm 條件下，掃描BCG 溶液（2×10-6mol/L）的同步熒光光譜，再將60 μL異黃酮溶液（2×10-4mol/L）分5 次加入，每次加入后靜置3 min后，依次掃描混合溶液的熒光光譜，并扣除相應(yīng)濃度異黃酮溶液的熒光。

1.3.3 三維熒光光譜分析

配制BCG與異黃酮物質(zhì)的量比分別為1∶1、1∶10、1∶20的混合溶液，以PBS作為空白對(duì)照，掃描其三維熒光光譜，并扣除相應(yīng)濃度異黃酮溶液的熒光。掃描條件為：激發(fā)波長(zhǎng)200～400 nm，發(fā)射波長(zhǎng)200～600 nm，光譜采集間距5 nm，溫度298 K。

1.3.4 外源性熒光光譜分析

室溫條件下，配制不同濃度異黃酮溶液，分別加入BCG溶液（0.2 mg/mL）中，得到不同物質(zhì)的量比混合溶液，靜置2 h。將20 μL 5 mmol/L ANS溶液加入2 mL混合溶液中，黑暗條件下反應(yīng)30 min后，掃描疏水性熒光光譜，并扣除相應(yīng)濃度異黃酮溶液的熒光。掃描條件為：激發(fā)波長(zhǎng)390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)400～600 nm。

1.3.5 圓二色光譜分析

配制不同濃度異黃酮溶液，加入BCG溶液（0.2 mg/mL）中，得到不同物質(zhì)的量比混合溶液，靜置2 h后掃描圓二色光譜。設(shè)置掃描范圍為190～250 nm，光徑為1 mm，掃描速率為60 nm/min，掃描間隔為1 nm，相關(guān)結(jié)果利用圓二色光譜在線分析網(wǎng)站（http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/process.shtml）進(jìn)行整理分析。

1.3.6 異黃酮-BCG復(fù)合物的制備

復(fù)合物制備參考Sui Xiaonan等[13]的方法，主要步驟如下：1）堿性復(fù)合物：用PBS（pH 9.0）將BCG稀釋至4 mg/mL，將異黃酮溶液稀釋至0.4 mmol/L后邊攪拌邊加入蛋白溶液中，調(diào)節(jié)混合溶液pH值為9.0，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24 h后超濾除去游離異黃酮；2）中性復(fù)合物：與堿性復(fù)合物制備大致相同，但略有改動(dòng)。BCG溶液和異黃酮稀釋后不調(diào)節(jié)pH值，攪拌反應(yīng)時(shí)間為2 h。

將BCG在堿性條件下分別與Gen、Dai制備的復(fù)合物標(biāo)注為BCG-Gen-A、BCG-Dai-A，在中性條件下分別與Gen、Dai制備的復(fù)合物標(biāo)注為BCG-Gen-N、BCGDai-N。

1.3.7 競(jìng)爭(zhēng)ELISA

參考張英[14]方法，采用競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA法檢測(cè)BCG及其復(fù)合物與大豆過敏患者血清特異性IgE的結(jié)合能力。通過方陣滴定法確定蛋白的包被質(zhì)量濃度為0.4 μg/mL，大豆過敏患者血清（一抗）稀釋倍數(shù)為1∶35，生物素標(biāo)記的羊抗人IgE（二抗）稀釋倍數(shù)為1∶10 000，HRP標(biāo)記的鏈霉親和素稀釋倍數(shù)為1∶300。用酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品在450 nm波長(zhǎng)處的光密度（OD450nm），按式（2）計(jì)算抑制率，IgE結(jié)合能力以半抑制質(zhì)量濃度（50% inhibiting concentration，IC50）表示。

1.3.8 復(fù)合物體外模擬胃腸消化

包括模擬嬰幼兒胃腸消化和模擬成人胃腸消化，參考Dupont[15]、孟軒夷[16]等的方法并稍作修改。

1.3.8.1 模擬嬰幼兒胃腸消化

模擬胃消化：在離心管中分別加入5 mL的BCG及復(fù)合物（2 mg/mL）。將6.9 mL KCl溶液（0.5 mol/L）、12.5 mL NaHCO3溶液（1 mol/L）、11.8 mL NaCl溶液（2 mol/L）、0.9 mL KH2PO4溶液（0.5 mol/L）、0.4 m L M g C l2(H2O)6溶液（0.1 5 m o l/L）和0.5 mL (NH4)2CO3溶液（0.15 mol/L）混勻，調(diào)節(jié)pH值為3.0，定容至500 mL配制成胃儲(chǔ)液，加入4.909 mL胃儲(chǔ)液和91 μL胃蛋白酶（2 500 U/mL），調(diào)節(jié)pH值至3.0，將所有樣品置于搖床（37 ℃、100 r/min）中消化反應(yīng)2 h，滴加NaHCO3調(diào)節(jié)溶液pH值至7.0終止反應(yīng)。

模擬腸消化：在離心管中加入5 mL胃消化后的樣品。將6.8 mL KCl溶液（0.5 mol/L）、42.5 mL NaHCO3溶液（1 mol/L）、9.6 mL NaCl溶液（2 mol/L）、0.8 mL KH2PO4溶液（0.5 mol/L）和1.1 mL MgCl2(H2O)6溶液（0.15 mol/L）混勻，調(diào)節(jié)pH值為6.5，定容至500 mL配制成腸儲(chǔ)液，通過加入4.94 mL腸儲(chǔ)液、35 μL胰酵素（2.5 mg/mL）和25 μL CaCl2(H2O)2（0.3 mol/L）溶液模擬腸消化環(huán)境，調(diào)節(jié)溶液pH值至6.5后，將所有樣品置于搖床中反應(yīng)2 h，沸水浴加熱5 min結(jié)束消化。

1.3.8.2 模擬成人胃腸消化

實(shí)驗(yàn)步驟與嬰幼兒胃腸消化類似，實(shí)驗(yàn)參數(shù)略有改動(dòng)。成人胃消化：胃蛋白酶活力為182 U/mg，pH值為2.5。成人腸消化：胰蛋白酶活力為35 U/mg，pH值為6.5。

1.3.9 復(fù)合物消化產(chǎn)物免疫印跡

參考常雪嬌[17]方法對(duì)BCG胃腸消化產(chǎn)物進(jìn)行免疫印跡鑒定。將胃腸消化產(chǎn)物經(jīng)過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電泳凝膠洗滌后在轉(zhuǎn)印儀上進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，設(shè)置轉(zhuǎn)膜電壓100 V，電流400 mA，時(shí)間60 min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后在室溫下封阻1 h；加入大豆過敏患者血清（一抗，1∶10）后，4 ℃孵育過夜，含0.1% Tween-20的Tris緩沖液（Tris buffered saline with Tween-20，TBST）漂洗3 次；加入生物素標(biāo)記的羊抗人IgE（二抗，1∶2 500），室溫孵育60 min，TBST漂洗3 次；滾動(dòng)孵育HRP標(biāo)記的鏈霉親和素（1∶60稀釋）60 min，TBST漂洗3 次；再使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯色劑顯色，并立即用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定3 次。采用Excel軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著，通過Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 異黃酮與BCG相互作用

2.1.1 熒光猝滅機(jī)制

通過熒光猝滅光譜分析Gen/Dai與BCG相互作用的猝滅機(jī)制。由圖1中Stern-Vlomer圖可以觀察到，隨著Gen和Dai添加量的增加，蛋白熒光強(qiáng)度呈線性下降趨勢(shì)。根據(jù)表2中數(shù)據(jù)，在298 K和314 K條件下加入Gen和Dai后，BCG的Kq均遠(yuǎn)大于2.0×1010L/（mol·s）（最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)）[18]，說明2 種活性異黃酮與BCG發(fā)生的猝滅屬于靜態(tài)猝滅[19-20]。靜態(tài)猝滅是多酚類化合物與蛋白結(jié)合的常見猝滅方式，在多酚-玉米醇溶蛋白[21]、白藜蘆醇-大豆分離蛋白（soybean protein isolated，SPI）[22]以及表沒食子兒茶素沒食子酸酯-SPI[23]相互作用的研究中均有體現(xiàn)。

圖1 Gen（A、B）和Dai（C、D）對(duì)BCG熒光猝滅的影響Fig.1 Effects of Gen (A and B) and Dai (C and D) on the fluorescence quenching of BCG

表2 異黃酮與BCG結(jié)合的相關(guān)常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic constants and thermodynamic parameters of the interaction between isoflavones and BCG

根據(jù)Scatchard方程可計(jì)算得到BCG與Gen/Dai的結(jié)合常數(shù)（Ka）和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）（表2）。溫度升高，2 種活性異黃酮與BCG之間的Ka均增大，并且不同溫度的n都接近1，表明BCG與Gen/Dai在空間結(jié)構(gòu)上至少存在1 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

生物大分子與小分子之間存在的非共價(jià)作用力主要有氫鍵、靜電相互作用、疏水相互作用和范德華力，由熱力學(xué)參數(shù)（ΔS、ΔH和ΔG）可以推斷蛋白質(zhì)與小分子之間相互作用力的類型。通過Van’t Hoff方程計(jì)算可得到相互作用的熱力學(xué)參數(shù)（表2）。按照Ross等[24]總結(jié)的熱力學(xué)參數(shù)與相互作用力之間的規(guī)律，表2中ΔH、ΔS均為正值，表明BCG與Gen、Dai的相互作用力中疏水相互作用起主要作用。這可能是因?yàn)镚en/Dai含有碳碳雙鍵和苯環(huán)等疏水基團(tuán)，這些基團(tuán)與BCG中的疏水基團(tuán)或結(jié)構(gòu)域發(fā)生疏水相互作用。類似地，疏水相互作用也是姜黃素與SPI[25]、VB12與大豆7S/11S蛋白[26]結(jié)合的主要驅(qū)動(dòng)力。

2.1.2 同步熒光光譜

同步熒光光譜通過同步掃描λex和λem可以提供生色團(tuán)分子附近微環(huán)境的信息。當(dāng)波長(zhǎng)間隔Δλ為15、60 nm時(shí)，同步熒光分別體現(xiàn)出酪氨酸（Tyr）或色氨酸（Trp）殘基微環(huán)境的變化[27]。由圖2可知，蛋白熒光強(qiáng)度隨著Gen/Dai的加入逐漸降低，當(dāng)Δλ為15 nm時(shí)，可以觀察到Gen僅對(duì)BCG中Tyr殘基的最大吸收波長(zhǎng)向長(zhǎng)波方向移動(dòng)了1 nm，而添加Dai后，最大吸收波長(zhǎng)并未出現(xiàn)明顯移動(dòng)；當(dāng)Δλ為60 nm時(shí)，Gen使BCG中Trp特征峰紅移14.6 nm，而Dai使其紅移4 nm。某些關(guān)鍵氨基酸決定了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，這些氨基酸微環(huán)境的改變會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)整體結(jié)構(gòu)發(fā)生相應(yīng)變化[28]，同步熒光光譜的結(jié)果表明，蛋白中酪氨酸和色氨酸周圍環(huán)境的極性增加，BCG與2 種異黃酮發(fā)生絡(luò)合作用，從而使蛋白結(jié)構(gòu)更加松散，使其內(nèi)部更多的親水性氨基酸暴露[29]。由于2 種異黃酮結(jié)構(gòu)存在差異，Gen比Dai多1 個(gè)酚羥基，且多出的酚羥基在空間位置上更接近羰基，導(dǎo)致Gen的活性更強(qiáng)，因此對(duì)BCG氨基酸殘基微環(huán)境的影響比Dai更明顯[30]。

圖2 Gen（A、B）和Dai（C、D）對(duì)BCG同步熒光光譜的影響Fig.2 Effects of Gen (A and B) and Dai (C and D) on the synchronous fluorescence spectrum of BCG

2.1.3 三維熒光光譜

為進(jìn)一步了解Gen/Dai對(duì)BCG構(gòu)象的影響，運(yùn)用三維熒光光譜進(jìn)行分析，由圖3和表3可知，在λex＝295 nm和λex＝282 nm處，BCG的三維熒光光譜顯示出2 個(gè)峰。根據(jù)峰位置分析，峰a（λex＝295 nm）和峰b（λex＝282 nm）是BCG中Tyr或Trp殘基的2 個(gè)特征峰[31]。隨著2 種活性異黃酮的添加，峰a和峰b的峰高都明顯降低。相較于Dai，Gen對(duì)峰a的影響更為顯著，當(dāng)BCG∶Gen＝1∶10時(shí)，峰a完全消失。逐漸添加Gen后，峰b的λem發(fā)生紅移；而Dai加入后，峰b從原來的282 nm/323 nm紅移至284 nm/325 nm和287 nm/325 nm，同時(shí)中高劑量異黃酮誘導(dǎo)蛋白產(chǎn)生了一個(gè)新的峰c（377 nm/380 nm）。以上信息表明，異黃酮的加入促使BCG的特征峰產(chǎn)生紅移，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微的去折疊或適應(yīng)性重排[32]，引起氨基酸微環(huán)境的極性增加，導(dǎo)致蛋白構(gòu)象發(fā)生變化[33]。

圖3 異黃酮對(duì)BCG三維熒光光譜的影響Fig.3 Effects of isoflavones on the three-dimensional fluorescence spectrum of BCG

表3 BCG與活性異黃酮相互作用后三維熒光光譜峰位置和峰強(qiáng)度Table 3 Three-dimensional fluorescence peak positions and intensities of BCG-isoflavone complexes

2.1.4 外源性熒光光譜

同步熒光與三維熒光光譜展示了蛋白氨基酸微環(huán)境的變化，外源性熒光光譜主要是從整體上體現(xiàn)蛋白質(zhì)表面疏水性的強(qiáng)弱。蛋白質(zhì)表面疏水性是支撐蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定必不可少的部分，對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)有極其重要的影響[34]。ANS是一種疏水性熒光探針，在水溶液中其熒光強(qiáng)度很微弱，但與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域結(jié)合時(shí)，其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。因此可采用ANS熒光探針作為標(biāo)記物，檢測(cè)2 種活性異黃酮添加量變化對(duì)BCG表面疏水性的影響。由圖4可知，當(dāng)BCG與Gen物質(zhì)的量比為1∶1時(shí)，BCG表面疏水性明顯增加；而隨著Gen濃度增大，BCG表面疏水性又減小，即中、高劑量（10、20 倍）的Gen使BCG的表面疏水性明顯降低。添加Dai對(duì)BCG表面疏水性的影響與劑量之間的規(guī)律不明顯，BCG與Dai物質(zhì)的量比為1∶1和1∶20時(shí)，BCG的疏水性顯著增加，而BCG與Dai物質(zhì)的量比為1∶10時(shí)，BCG表面疏水性顯著減小。

圖4 異黃酮對(duì)BCG表面疏水性的影響Fig.4 Effects of isoflavones on the surface hydrophobicity of BCG

2.1.5 圓二色光譜

α-螺旋結(jié)構(gòu)的圓二色光譜在190 nm附近有一正峰，在222、208 nm波長(zhǎng)處有2 個(gè)負(fù)峰；β-折疊結(jié)構(gòu)在216 nm波長(zhǎng)處有一負(fù)峰，在185～200 nm波長(zhǎng)處有一正峰[35]。由圖5可知，當(dāng)BCG∶Gen＝1∶1時(shí)，在蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋相對(duì)含量略有升高，但當(dāng)Gen濃度繼續(xù)增加后，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量明顯下降；而β-折疊相對(duì)含量隨著Gen的添加顯著增加。同時(shí)Dai的添加使蛋白中β-折疊相對(duì)含量顯著減少，而β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量顯著提高。隨Dai濃度的升高，蛋白的無規(guī)卷曲相對(duì)含量則表現(xiàn)出先降低后升高的變化。綜上所述，Gen的添加使得BCG的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成呈現(xiàn)出從α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)化為β-折疊的趨勢(shì)；Dai的添加使BCG的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)從β-折疊轉(zhuǎn)化為β-轉(zhuǎn)角的趨勢(shì)，這在矢車菊素-3-O-葡萄糖苷與7S/11S蛋白相互作用研究中也有所體現(xiàn)[36]，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更為松散。二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化與前文熒光光譜的研究結(jié)果結(jié)合，可以看出異黃酮的添加使BCG的結(jié)構(gòu)更為疏松，內(nèi)部緊湊的基團(tuán)暴露在外部環(huán)境中。

圖5 異黃酮對(duì)BCG二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effects of isoflavones on the secondary structure of BCG

2.2 異黃酮-BCG復(fù)合物結(jié)構(gòu)及潛在致敏性

2.2.1 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)

由圖6A、B可知，相較于原蛋白，2 種活性異黃酮與蛋白形成復(fù)合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋相對(duì)含量略有升高，占主要地位的β-折疊相對(duì)含量均降低。由于結(jié)合方式與異黃酮種類不同，2 種復(fù)合物結(jié)構(gòu)變化仍有差別，BCG-Gen復(fù)合物主要表現(xiàn)為β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量顯著升高，而BCG-Dai復(fù)合物表現(xiàn)為無規(guī)卷曲相對(duì)含量顯著升高。

圖6 異黃酮-BCG復(fù)合物的結(jié)構(gòu)表征Fig.6 Structure of isoflavone-BCG complexes

蛋白質(zhì)在280 nm處的吸收峰主要由芳香族氨基酸（如Tyr和Trp）的π-π*躍遷引起[33]，可以提供有關(guān)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的信息。由圖6C可知，與原蛋白相比，BCG-Gen-A和BCG-Dai-N在280 nm處的吸收峰強(qiáng)度增強(qiáng)，而BCG-Gen-N和BCG-Dai-A吸收峰強(qiáng)度減弱。這表明BCG-Gen-A和BCG-Dai-N的蛋白展開程度變大，使得Tyr和Trp殘基暴露在蛋白質(zhì)表面，導(dǎo)致紫外吸收峰強(qiáng)度增加[28]；而BCG-Gen-N和BCG-Dai-A暴露在表面的芳香族氨基酸殘基數(shù)量有所減少，可能是因?yàn)閺?fù)合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成發(fā)生了較大的變化，導(dǎo)致芳香族氨基酸的分布出現(xiàn)差異。

由圖6D可知，相較于原蛋白，BCG-Gen-A、BCGDai-A與BCG-Dai-N的表面疏水性增強(qiáng)，疏水基團(tuán)暴露；而BCG-Gen-N的表面疏水性明顯減小。

2.2.2 復(fù)合物的潛在致敏性

為探究復(fù)合物潛在致敏性，采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA評(píng)估BCG及其復(fù)合物的特異性IgE結(jié)合能力，以IC50表示，IC50越大，樣品與IgE的結(jié)合能力越弱。由圖7A可知，復(fù)合物的IC50均顯著變?。≒＜0.05），其中堿性復(fù)合物的IC50變化尤為顯著，即BCG與2 種異黃酮復(fù)合物的致敏性增強(qiáng)，特別是堿性復(fù)合物。

圖7 異黃酮-BCG復(fù)合物的潛在致敏性Fig.7 Potential allergenicity of isoflavone-BCG complexes

通過免疫印跡法鑒定BCG及其復(fù)合物消化產(chǎn)物的潛在致敏性。由圖7B～E可知，蛋白及復(fù)合物消化后存在已被降解的小分子，以及未被消化的蛋白β亞基和大分子聚合物。免疫印跡結(jié)果顯示，蛋白中β亞基及大分子聚合物顯色明顯，而消化后小分子不顯色。嬰幼兒消化產(chǎn)物中BCG-Dai-N與成人消化產(chǎn)物中BCG-Gen-A的免疫印跡條帶顯色明顯強(qiáng)于原蛋白及其他復(fù)合物，具有一定的潛在致敏性。消化產(chǎn)物的電泳與免疫印跡結(jié)果與前文ELISA結(jié)果相互印證，復(fù)合物致敏性的升高也可能是由于蛋白質(zhì)與異黃酮結(jié)合后產(chǎn)生了致敏性強(qiáng)的大分子聚合物，導(dǎo)致表現(xiàn)出較強(qiáng)的IgE結(jié)合能力。

與2 種異黃酮結(jié)合后，BCG的潛在致敏性增強(qiáng)，類似的研究結(jié)果在操?gòu)?qiáng)等[37]研究中也有報(bào)道：卵白蛋白-白藜蘆醇相互作用后卵白蛋白的體外IgE結(jié)合能力變強(qiáng)。結(jié)合前文復(fù)合物結(jié)構(gòu)的表征結(jié)果推測(cè)，復(fù)合物致敏性增強(qiáng)可能是因?yàn)楫慄S酮與BCG相互作用后，蛋白結(jié)構(gòu)變得更為松散，抗原表位更多地暴露在復(fù)合物表面。并且相較于體外實(shí)驗(yàn)，人體內(nèi)的過敏機(jī)制更為復(fù)雜，已有較多研究證明了異黃酮的抗過敏能力。體外血清學(xué)實(shí)驗(yàn)僅表明與2 種活性異黃酮相互作用后蛋白的IgE結(jié)合能力有所增強(qiáng)，但黃酮類化合物在體內(nèi)可能通過影響免疫細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫因子等途徑達(dá)到緩解過敏的作用，后續(xù)將通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究異黃酮對(duì)于大豆過敏蛋白致敏性的影響機(jī)制。

3 結(jié)論

本研究采用多種光譜方法對(duì)大豆中Gen/Dai與BCG的相互作用及復(fù)合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)2 種活性異黃酮通過靜態(tài)猝滅方式猝滅BCG的內(nèi)源性熒光，n均接近1，作用力以疏水相互作用為主；而2 種異黃酮與BCG相互作用后會(huì)導(dǎo)致蛋白的結(jié)構(gòu)與氨基酸殘基微環(huán)境發(fā)生改變，使蛋白結(jié)構(gòu)更為松散。體外血清學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，復(fù)合物與消化產(chǎn)物的致敏性均強(qiáng)于原蛋白，這可能是由于相互作用后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，使更多的過敏原表位暴露。