六堡茶真菌固態(tài)發(fā)酵優(yōu)勢單菌的篩選

吳新惠，杜金杰，劉曉純，廖楷濱2,，覃玉娜2,，梁煒杰2,，張靈枝2,，龍志榮，邱瑞瑾,*

（1.梧州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院梧州分院，廣西 梧州 543003；2.廣西六堡茶生物學(xué)與資源利用重點實驗室，廣西 梧州 543003；3.韶關(guān)學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512000；4.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642；5.梧州市茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，廣西 梧州 543000）

六堡茶屬黑茶類，是國家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品，因原產(chǎn)于梧州蒼梧六堡鎮(zhèn)而得名，是廣西特有的歷史名茶[1]。六堡茶飲用歷史悠久，特殊的地理環(huán)境和生產(chǎn)工藝造就其特殊的品質(zhì)風(fēng)味。適度渥堆和陳化是使六堡茶保持良好風(fēng)味的關(guān)鍵工序[2-3]。與其他五大類黑茶不同，六堡茶在渥堆、陳化和貯存過程中細(xì)菌和真菌持續(xù)的生理活動，使六堡茶“越陳越好”，因而六堡茶有“耐于久藏，且越陳越香”之說[4-5]。真菌在傳統(tǒng)食品發(fā)酵中有著廣泛的應(yīng)用，前人研究表明真菌是影響黑茶發(fā)酵過程的關(guān)鍵因素[6-9]。但傳統(tǒng)渥堆工藝無法控制發(fā)酵過程中的菌種類型，容易滋生多種雜菌，復(fù)雜多樣的微生物參與發(fā)酵導(dǎo)致六堡茶品質(zhì)不穩(wěn)定、難以控制。因此，篩選有益菌株進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，探索不同真菌發(fā)酵對六堡茶品質(zhì)的影響對六堡茶發(fā)酵菌種工業(yè)化應(yīng)用有積極意義。

固態(tài)發(fā)酵是指在固態(tài)基質(zhì)中加入微生物進(jìn)行發(fā)酵的過程，固態(tài)培養(yǎng)基不溶于水，可以為微生物提供生長所需的營養(yǎng)及生存環(huán)境[10]。微生物在茶葉固態(tài)發(fā)酵中可以保持自然的生長狀態(tài)，代謝產(chǎn)物更容易積累，更具豐富性，且固態(tài)發(fā)酵含水量低，生產(chǎn)成本也較低。人工接種真菌固態(tài)發(fā)酵不僅可以解決自然渥堆發(fā)酵品質(zhì)參差不齊、衛(wèi)生安全等問題，還能賦予茶葉豐富的滋味品質(zhì)和獨特的保健功效[6,11]。楊洪元[12]利用從六堡茶中分離到的真菌進(jìn)行組合混菌發(fā)酵毛茶，結(jié)果顯示，接種組合青霉＋冠突曲霉＋黑曲霉＋毛霉＋酵母菌發(fā)酵可以取得與傳統(tǒng)渥堆六堡茶品質(zhì)相近的效果，且發(fā)酵時間縮短了近1/3。胡沛然[13]利用從渥堆樣品中分離鑒定出的產(chǎn)多酚氧化酶的嗜熱菌（灰黃青霉、黑曲霉和煙曲霉）固態(tài)發(fā)酵六堡茶，發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時間的延長，3 種嗜熱真菌發(fā)酵茶的茶多酚含量均呈降低趨勢，其中轉(zhuǎn)化效果最明顯的是煙曲霉發(fā)酵組，各發(fā)酵組的茶黃素含量均下降，茶紅素和茶褐素含量變化不同。劉琨毅等[14]將地衣芽孢桿菌L1接種于滅菌和未滅菌的曬青茶中，發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌與其他微生物可能產(chǎn)生協(xié)同作用，從而改變普洱茶中的特征成分、提升普洱茶的感官品質(zhì)。王琪琪[15]以福鼎大白茶青為原料，接種人工益生菌群（阿姆斯特丹散囊菌、異常威克漢姆酵母、漢遜酵母、釀酒酵母、解淀粉芽孢桿菌）固態(tài)發(fā)酵茶葉，茶湯顏色從紅亮轉(zhuǎn)變?yōu)殓晟?，滋味甜醇，青氣消失，有菌香。近年來，許多學(xué)者通過研究進(jìn)一步證明了真菌發(fā)酵可以顯著提升茶葉品質(zhì)，比如冠突散囊菌影響茯磚茶的發(fā)花工藝[16-19]。人工接種固態(tài)發(fā)酵不僅可以提升茶葉渥堆發(fā)酵效率、縮短發(fā)酵時間，還可以提升茶葉品質(zhì)，是一種高效而有益的茶葉發(fā)酵方法。

本研究利用課題組前期從六堡茶渥堆與蒸壓工藝中分離的20 株真菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵[20]，以廣西梧州蒼梧縣群體種毛茶作原料、無菌處理組為空白對照，以六堡茶“紅、濃、陳、醇”的特征品質(zhì)作為參考標(biāo)準(zhǔn)，定期抽樣檢測分析其中感官品質(zhì)和化學(xué)成分變化，探索不同真菌在六堡茶原料中的生長特性及發(fā)酵品質(zhì)變化規(guī)律，篩選可顯著提升六堡茶品質(zhì)或賦予六堡茶新風(fēng)味的固態(tài)發(fā)酵優(yōu)勢真菌，以期為后期人工控菌發(fā)酵六堡茶提供優(yōu)良菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 發(fā)酵茶樣

發(fā)酵毛茶由蒼梧縣群體種六堡茶一芽三葉鮮葉加工制成。

1.1.2 發(fā)酵真菌來源

用于固態(tài)發(fā)酵的20 株真菌從課題組前期實驗中分離篩選得到，大多為六堡茶或其他黑茶中發(fā)現(xiàn)并報道過的真菌，對黑茶發(fā)酵品質(zhì)的轉(zhuǎn)化有一定貢獻(xiàn)作用[20]，如表1所示。

表1 從渥堆六堡茶中分離鑒定到的20 株真菌Table 1 Twenty fungal strains isolated and identified from pile fermented Liupao tea

1.1.3 試劑

兒茶素（catechin，C）、表兒茶素（epicatechin，EC）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin-3-gallate，ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、沒食子兒茶素（gallocatechin，GC）、兒茶素沒食子酸酯（catechin gallate，CG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）、咖啡因 上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜級）美國Thermo Fisher Scientific公司；蒽酮 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；福林-酚、磷酸氫二鈉、茚三酮、磷酸二氫鉀、硫酸、碳酸鈉、蒽酮、氯化鋁（均為分析純）天津化學(xué)試劑有限公司。其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

WFJ7200型可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；TD-5Z型低速離心機 四川蜀科儀器有限公司；SW-CJ-2F雙人雙面超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；GXZ-250A恒溫光照培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；ALANCE E295高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）美國Waters公司；血球計數(shù)板 上海求精生化試劑儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 固態(tài)發(fā)酵

1.3.1.1 六堡毛茶準(zhǔn)備

稱取100 g毛茶于500 mL錐形瓶，封口膜封好，于高壓滅菌鍋121 ℃滅菌20 min，得到滅菌待接種毛茶，備用。

1.3.1.2 菌懸液的制備

菌種活化：取凍存的菌種置于28 ℃恒溫箱，24 h后在超凈工作臺中吸取0.5 mL解凍后的菌懸液于PDA培養(yǎng)基和CA培養(yǎng)基中用無菌涂布棒均勻涂布，密封后置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～7 d，進(jìn)行活化。

孢子懸液制備：將活化后的真菌用劃線法接種于PDA培養(yǎng)基、CA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)4～7 d，得到F1，再劃線培養(yǎng)生長5～10 d得到F2，用無菌生理鹽水洗脫F2孢子并轉(zhuǎn)移至錐形瓶（帶滅菌玻璃珠和適量無菌水），于搖床中振蕩約4～8 h（150～170 r/min），采用血球計數(shù)板計數(shù)孢子濃度并調(diào)節(jié)孢子濃度約為1×107CFU/mL，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.3 接種菌懸液固態(tài)發(fā)酵

100 g六堡毛茶于121 ℃高壓滅菌20 min后冷卻備用。按照1×107CFU/mL濃度接種菌懸液至滅菌毛茶培養(yǎng)，同時調(diào)整發(fā)酵水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%，于28 ℃、相對濕度80%的培養(yǎng)箱中發(fā)酵，每天觀察生長情況。7 d后，待菌長勢正常，1 周內(nèi)梯度升溫至55 ℃（每7 d循環(huán)一次梯度升溫程序），模擬實際生產(chǎn)的渥堆升溫和翻堆降溫過程。為避免茶樣結(jié)塊，發(fā)酵前7 d每隔2 d搖一次瓶，后期按照升溫梯度7 d一次，使茶樣發(fā)酵均勻。于14、21、28、35 d定時取樣（發(fā)酵期間定期審評，21 d時若審評滋味仍然較澀或無特征香氣就停止發(fā)酵）。以不接種只加無菌純水的滅菌毛茶作為對照（CK）。每組樣品均進(jìn)行3 次重復(fù)發(fā)酵。

1.3.1.4 固樣處理

參考曾貞等[21]的微波固樣法，微波爐額定輸出功率850 W，額定微波頻率2 450 MHz。100%火力固樣3 min，20%火力微波固樣8 min（分為3 次處理：4、2、2 min），最后用烘箱70～80 ℃烘至足干。烘干后，一部分保存于-18 ℃冰箱冷凍，用于感官審評；另一部分磨成茶粉，保存于（0～4 ℃）冰箱冷藏，用于檢測理化成分指標(biāo)。

1.3.2 主要化學(xué)成分的檢測

水浸出物總含量測定參照GB/T 8305—2013《茶 水浸出物測定》[22]；游離氨基酸總含量測定參照GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測定》[23]；黃酮類化合物總含量測定采用三氯化鋁比色法；可溶性糖總含量測定采用蒽酮-硫酸比色法；茶色素總含量測定采用系統(tǒng)分析法；咖啡堿總含量測定參照GB/T 8312—2013《茶 咖啡堿測定》[24]；茶多酚含量、兒茶素組分含量測定參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》[25]。

1.3.3 HPLC樣品制備

1.3.4 HPLC分析

流動相及色譜條件：流動相A：90%甲醇溶液（平衡柱子）；流動相B：5%甲醇溶液；流動相C：0.05%磷酸溶液；流動相D：100%乙腈；流速：1 mL/min；波長：280 nm；后運行時間：5 min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。洗脫條件：0～3 min，95%～90% A，5%～10% B；3～6 min，90% A，10% B；6～8 min，90%～80% A，10%～20% B。HPLC洗脫梯度程序見表2。

表2 HPLC洗脫梯度Table 2 Gradient elution parameters for HPLC

1.3.5 感官審評

按照GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》中黑茶（散茶）的審評方法，審評小組由5 位具有專業(yè)茶葉審評資格的小組成員（2 男3 女）組成，用專業(yè)的茶葉審評術(shù)語得出審評結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

測定結(jié)果取3 次重復(fù)實驗的平均值。采用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 24軟件進(jìn)行方差分析和顯著性分析，多重比較采用最小顯著性差異法（LSD法），數(shù)據(jù)用表示，使用GraphPad Prism 8軟件作圖，Origin 2021軟件進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA），采用Photoshop軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同真菌發(fā)酵對六堡茶感官品質(zhì)的影響

CK組及20 株單菌固態(tài)發(fā)酵茶樣如圖1～3所示，審評結(jié)果如表3、4所示，其中依照發(fā)酵狀態(tài)調(diào)整，10 種真菌發(fā)酵21 d，有2 個時間節(jié)點發(fā)酵樣（14、21 d），另外10 種真菌發(fā)酵35 d，有4 個時間節(jié)點發(fā)酵樣（14、21、28、35 d）。

圖1 CK組外形、湯色和葉底Fig.1 Tea,infusion and brewed tea leaves in the control group

表3 單菌發(fā)酵4 個時間節(jié)點審評結(jié)果Table 3 Sensory evaluation results of Liupao tea at four time points of single-culture fermentation

從圖1、表3可知，無菌對照CK組感官審評結(jié)果在4 個時間節(jié)點均無明顯差異，干茶外形烏褐油潤，開湯后香氣純正、生曬味，湯色橙黃，清澈明亮，滋味濃強苦澀，葉底綠褐，與毛茶感官品質(zhì)接近，說明在無菌狀態(tài)下僅有的濕熱作用對六堡茶感官品質(zhì)影響不大。

六堡茶品質(zhì)以紅、濃、陳、醇為特征，如圖2、表3所示，這10 種真菌接種固態(tài)發(fā)酵后在4 個時間節(jié)點上均能顯著改善六堡茶湯色、香氣或滋味品質(zhì)。其中，能顯著改善茶葉湯色的有芒果青霉、角膜曲霉、赤曲霉、間型曲霉、阿姆斯特丹曲霉、極細(xì)枝孢霉；呈陳香、木香、菌香、藥香、參香等香氣特征的有塔賓曲霉、黑曲霉、赤曲霉、間型曲霉、團(tuán)青霉、阿姆斯特丹曲霉，而極細(xì)枝孢霉發(fā)酵21 d和28 d有較為獨特的玫瑰花香；在滋味方面，10 個真菌發(fā)酵21、28 d的茶樣滋味均較為醇厚順滑，而發(fā)酵到35 d部分茶樣滋味變苦澀、變酸，推測在本實驗條件下這些真菌接種發(fā)酵時間不宜過長。部分真菌發(fā)酵茶樣香氣到35 d時下沉，變粗雜，甚至出現(xiàn)酸味，說明發(fā)酵過度，如塔賓曲霉和團(tuán)青霉。對比在同一時間的外形、湯色及滋味特征發(fā)現(xiàn)，茶樣表面孢子生長越旺盛，茶湯顏色越深、滋味越醇和；外形越接近毛茶和無菌對照發(fā)酵樣，其湯色越淺、滋味越苦澀。綜上，單菌最佳發(fā)酵時間為21 d。

從表4可以看出，29家醫(yī)養(yǎng)結(jié)合型養(yǎng)老機構(gòu)中的20家綜合效率值為1，視為DEA有效，另外9家處于弱DEA有效，即在規(guī)模效率或純技術(shù)效率值上沒有達(dá)到最優(yōu)，其中，最低的是機構(gòu)10，其綜合效率僅為0.675，相對于其他養(yǎng)老機構(gòu)而言，其投入的資源沒有得到充分利用。在規(guī)模報酬可變的情況下，純技術(shù)效率值為1的有23家，占比79.31%；而從規(guī)模效率角度分析，20家規(guī)模效率有效，9家處于規(guī)模效率無效的狀態(tài)，還存在通過改變規(guī)模提高效率的空間。

圖2 不同真菌固態(tài)發(fā)酵樣4 個時間節(jié)點湯色（A）、外形（B）和葉底（C）Fig.2 Tea infusion (A),tea (B),and brewed tea leaves (C) at four time points of solid-state fermented with different fungi

由圖3、表4可知，單菌接種固態(tài)發(fā)酵14 d后所有菌株在茶葉表面長勢各異，曲霉屬真菌和青霉屬真菌在茶葉表面長勢相較于其他屬真菌更旺盛，部分樣品發(fā)酵14 d和21 d的外形無差異，滋味變化不大，苦澀味仍在。其中也有香氣較為突出的發(fā)酵菌種，如鮮紅青霉、聚多曲霉、產(chǎn)黑色素短梗霉，發(fā)酵后只能對六堡茶某一感官品質(zhì)產(chǎn)生有益的影響，未來可以考慮混菌發(fā)酵，突出其發(fā)酵特征。

圖3 不同真菌固態(tài)發(fā)酵樣2 個時間節(jié)點外形、湯色和葉底Fig.3 Tea,infusion and brewed tea leaves at two time points of solidstate fermentation with different fungi

表4 單菌發(fā)酵2 個時間節(jié)點審評結(jié)果Table 4 Sensory evaluation results of tea samples at two time points of single fungal fermentation

綜合感官審評的湯色、香氣和滋味，從60 種發(fā)酵茶樣中篩選出9 種（21 d）發(fā)酵茶樣用于理化成分分析，分別為LB-5、LB-10、LB-22、LB-24、LB-32、LB-35、LB-43、LB-55、LB-81，探究9 種真菌發(fā)酵21 d對六堡茶滋味品質(zhì)成分的影響。

2.2 不同真菌發(fā)酵對六堡茶生化成分的影響

2.2.1 PCA

如圖4所示，基于18 種生化成分，PCA和HCA結(jié)果表明9 種不同真菌發(fā)酵六堡茶和CK組差異顯著。PCA將各處理組劃分為3 組。組1包括CK、團(tuán)青霉和赤酵母組，組2包括塔賓曲霉、黑曲霉、角膜曲霉、赤曲霉、間型曲霉、阿姆斯特丹曲霉組，組3為芒果青霉組。PC1和PC2分別解釋總方差的44.93%和21.57%。CK、團(tuán)青霉、赤酵母與其他發(fā)酵茶樣的成分差異顯著（P＜0.05）；芒果青霉與其他發(fā)酵茶樣相比，在PC2的權(quán)重上被區(qū)分開?？們翰杷?、GCG、EGCG、ECG和茶紅素分別是PC1的前5 位貢獻(xiàn)物質(zhì)，游離氨基酸、黃酮、茶黃素、EC和GC是PC2的前5 位貢獻(xiàn)物質(zhì)（表5）。此外，HCA將生化成分聚為兩簇，EGC、咖啡堿、茶褐素和水浸出物聚為一簇，其他14 種成分聚為另一簇。

圖4 不同茶樣中18 種特定化學(xué)成分的PCA（A）和HCA（B）Fig.4 PCA (A) and HCA (B) plots of 18 chemical components in different tea samples

表5 單菌發(fā)酵六堡茶中18 種主要化學(xué)成分對PC1與PC2的貢獻(xiàn)度Table 5 Contribution rates of 18 major chemical components of Liupao tea fermented by single fungal strains to PC1 and PC2

2.2.2 不同茶樣理化成分的變化

從表6可知，與CK組相比，六堡毛茶經(jīng)9 種不同真菌發(fā)酵21 d后，黑曲霉、赤曲霉、間型曲霉、團(tuán)青霉發(fā)酵茶樣的水浸出物含量顯著下降（P＜0.05），塔賓曲霉、阿姆斯特丹曲霉發(fā)酵樣含量極顯著增加（P＜0.01），明顯高于其他真菌發(fā)酵的六堡茶，結(jié)合感官審評結(jié)論可知，這兩種真菌發(fā)酵的六堡茶茶湯滋味醇厚。與CK樣相比，9 株真菌發(fā)酵樣茶多酚含量呈極顯著變化（P＜0.01），除赤酵母發(fā)酵樣極顯著增加外（P＜0.01），其他8 種真菌發(fā)酵茶的茶多酚含量極顯著減少（P＜0.01），其中降幅最大的是芒果青霉。

表6 單菌發(fā)酵六堡茶理化成分Table 6 Chemical components of Liupao tea fermented by single fungal strains %

9 種真菌固態(tài)發(fā)酵茶樣在21 d時，黑曲霉、芒果青霉、赤曲霉、間型曲霉、團(tuán)青霉、和赤酵母發(fā)酵茶的茶黃素含量極顯著減少（P＜0.01），塔賓曲霉和阿姆斯特丹曲霉發(fā)酵茶的茶黃素含量顯著減少（P＜0.05），而角膜曲霉無顯著變化。相比于CK組，所有真菌發(fā)酵茶樣的茶褐素含量均極顯著增加（P＜0.01），特別是塔賓曲霉、黑曲霉、阿姆斯特丹曲霉。各組的茶紅素含量也呈極顯著變化；與CK組相比，除了赤酵母極顯著升高外（P＜0.01），其他真菌發(fā)酵均呈極顯著降低（P＜0.01）。9 種真菌發(fā)酵茶樣可溶性糖含量均呈極顯著下降趨勢（P＜0.01）。

2.2.3 兒茶素組分含量的變化

兒茶素是茶多酚中含量最高的化合物，其含量的多少與茶湯的苦澀味強度呈正相關(guān)，主要包括C、EC、GC、EGC、CG、ECG、GCG、EGCG 8 種單體，前4 種為非酯型兒茶素，后4 種為酯型兒茶素。不同標(biāo)準(zhǔn)品HPLC見圖5。

圖5 不同標(biāo)準(zhǔn)品的HPLCFig.5 HPLC chromatograms of catechin standards

從表7、8 可知，與對照組相比，黑曲霉、角膜曲霉、間型曲霉、團(tuán)青霉、阿姆斯特丹曲霉、赤酵母發(fā)酵茶的非酯型兒茶素含量均極顯著減少（P＜0.01）。塔賓曲霉、黑曲霉、芒果青霉、赤曲霉、間型曲霉、團(tuán)青霉、阿姆斯特丹曲霉發(fā)酵茶的酯型兒茶素含量均極顯著減少（P＜0.01），赤酵母顯著減少（P＜0.05），角膜曲霉無顯著變化。與CK組相比，9 種真菌發(fā)酵茶中GC、ECG含量均呈極顯著變化（P＜0.01），只有芒果青霉和赤曲霉發(fā)酵六堡茶的GC含量極顯著上升（P＜0.01），塔賓曲霉、黑曲霉、間型曲霉、團(tuán)青霉、阿姆斯特丹曲霉、赤酵母發(fā)酵茶樣的GC含量極顯著降低（P＜0.01），角膜曲霉發(fā)酵茶顯著降低（P＜0.05）。與CK相比，芒果青霉和赤曲霉、間型曲霉發(fā)酵茶中EGC含量均無顯著差異，而其他6 種真菌發(fā)酵茶EGC含量均極顯著減少（P＜0.01）。角膜曲霉、赤曲霉和赤酵母發(fā)酵六堡茶的C含量無顯著變化，其他5 種真菌發(fā)酵茶均呈極顯著減少（P＜0.01）。塔賓曲霉、黑曲霉、團(tuán)青霉接種發(fā)酵21 d后EC含量呈極顯著減少（P＜0.01），而赤曲霉發(fā)酵茶呈極顯著增加（P＜0.01）。9 種真菌發(fā)酵茶的酯型兒茶素含量除角膜曲霉和赤酵母外，均呈極顯著減少（P＜0.01）。EGCG含量除了角膜曲霉和赤酵母發(fā)酵茶無顯著變化外，其他真菌發(fā)酵茶均極顯著降低（P＜0.01）；9 種真菌發(fā)酵茶樣的GCG含量均呈極顯著降低（P＜0.01），特別是塔賓曲霉、黑曲霉和阿姆斯特丹曲霉；除角膜曲霉和赤酵母發(fā)酵茶ECG含量顯著升高外（P＜0.05），其他真菌發(fā)酵茶ECG含量極顯著降低（P＜0.01）；除角膜曲霉外，其他8 種真菌發(fā)酵對CG含量均有顯著影響（P＜0.05），其中黑曲霉極顯著增加了CG含量（P＜0.01）。除赤酵母外，8 種真菌發(fā)酵茶總兒茶素含量顯著下降（P＜0.05），減弱了六堡毛茶的苦澀味和刺激性。

2.2.4 不同茶樣咖啡堿、總黃酮、游離氨基酸含量的變化

由表8可知，與CK相比，赤酵母發(fā)酵的六堡茶咖啡堿含量無顯著變化，而其他8 種真菌發(fā)酵六堡茶的咖啡堿含量均顯著增加（P＜0.05），塔賓曲霉、黑曲霉、芒果青霉、角膜曲霉、間型曲霉、團(tuán)青霉、阿姆斯特丹曲霉發(fā)酵的六堡茶咖啡堿含量呈極顯著增加趨勢（P＜0.01）；其中塔賓曲霉發(fā)酵茶樣咖啡堿含量最高，為（60.11±0.63）mg/g。與CK相比，9 種真菌發(fā)酵茶黃酮含量變化不同，黑曲霉發(fā)酵茶樣黃酮含量極顯著增加（P＜0.01），塔賓曲霉、芒果青霉、角膜曲霉、間型曲霉、阿姆斯特丹曲霉發(fā)酵樣黃酮含量呈極顯著減少趨勢（P＜0.01），赤曲霉黃酮含量顯著減少（P＜0.05）。9 種真菌發(fā)酵茶中游離氨基酸含量除阿姆斯特丹曲霉發(fā)酵茶顯著減少外（P＜0.05），其他發(fā)酵茶樣均極顯著減少（P＜0.01），含量減少最多的是芒果青霉。

表8 單菌發(fā)酵對六堡茶主要化學(xué)成分的影響Table 8 Effect of single fungal fermentation on major chemical components in Liupao tea

3 討論與結(jié)論

為探究20 株真菌固態(tài)發(fā)酵對六堡茶品質(zhì)的影響，本研究利用人工接種固態(tài)發(fā)酵六堡毛茶，通過感官審評結(jié)果，挑選出9 株單菌發(fā)酵優(yōu)異茶樣進(jìn)行理化成分分析。感官審評結(jié)果表明，與無菌發(fā)酵樣CK相比，接種不同真菌發(fā)酵的茶樣茶湯顏色加深，滋味由苦澀轉(zhuǎn)為醇和或醇厚，香氣由六堡毛茶的豆香、煙香轉(zhuǎn)化為菌花香、木質(zhì)香、陳香、甜花香。其中曲霉屬對六堡茶品質(zhì)影響最大，主要體現(xiàn)在茶湯上，曲霉屬真菌發(fā)酵六堡茶湯色較其他屬真菌發(fā)酵茶深，滋味更醇厚。綜合各項指標(biāo)顯示，接種發(fā)酵21 d的六堡茶品質(zhì)趨于穩(wěn)定，角膜曲霉、間型曲霉、團(tuán)青霉、阿姆斯特丹曲霉和赤酵母發(fā)酵21 d即可達(dá)到較優(yōu)品質(zhì)，香氣表現(xiàn)為甜香帶菌香，滋味醇厚。

理化成分分析結(jié)果表明，對比CK組，9 株真菌發(fā)酵茶樣茶多酚、茶紅素和可溶性糖含量均呈極顯著變化（P＜0.01），總兒茶素含量方面除角膜曲霉和赤酵母發(fā)酵樣外，其他真菌發(fā)酵與CK相比均極顯著減少（P＜0.01）。茶褐素是黑茶中含量最高的一種色素類物質(zhì)，其具有降血糖、降血脂[26-27]、促進(jìn)膽固醇降解[28]、抑菌[29]、改善腸道菌群、抗氧化[30]、抗癌[31]等一系列特殊功效，本研究中9 株真菌發(fā)酵能使茶樣中的茶褐素含量極顯著增加（P＜0.01），其中黑曲霉在前人研究中已證實在一定條件下能高產(chǎn)茶褐素[32]。咖啡堿含量中赤曲霉發(fā)酵樣顯著增加（P＜0.05），赤酵母無顯著變化，其他7 種真菌發(fā)酵均能極顯著增加咖啡堿含量（P＜0.01），有研究表明曲霉屬真菌在發(fā)酵過程中對茶葉中咖啡堿含量的增加有顯著促進(jìn)作用[33-34]?？傊?，塔賓曲霉、黑曲霉、團(tuán)青霉和阿姆斯特丹曲霉發(fā)酵六堡毛茶能顯著改變茶葉中18 種化學(xué)成分含量，感官審評結(jié)果顯示塔賓曲霉和黑曲霉滋味品質(zhì)不如團(tuán)青霉和阿姆斯特丹曲霉，因此，本研究篩選出團(tuán)青霉和阿姆斯特丹曲霉為最適單菌發(fā)酵菌株。