基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)探討魚(yú)腥草治療前列腺癌分子作用機(jī)制

李 進(jìn) 楊青斌 徐 靜▲

前列腺癌（prostate cancer，PCA）是指發(fā)生在前列腺上皮細(xì)胞的惡性腫瘤。前列腺癌在全球的發(fā)病率不斷上升，是嚴(yán)重威脅男性健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一。多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期[1]。激素去勢(shì)治療是晚期前列腺癌的首選方案[2]，但是大多數(shù)接受去勢(shì)治療的患者最終都會(huì)進(jìn)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌。近年來(lái)，關(guān)于前列腺癌的治療方法及藥物研究不斷更新發(fā)展，但是晚期前列腺癌患者（尤其是晚期去勢(shì)抵抗性前列腺癌）的總體生存率仍未得到明顯改善。目前，中醫(yī)藥在抗腫瘤方面發(fā)揮著重要作用。魚(yú)腥草具有抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用，有研究表明魚(yú)腥草提取物對(duì)于肺癌[3]、肝癌[4]、乳腺癌[5]、結(jié)腸癌[6]均有明顯的抑制作用，但其具體抗腫瘤作用機(jī)制尚未明確。相關(guān)研究顯示，魚(yú)腥草可通過(guò)降低前列腺癌細(xì)胞中的細(xì)胞周期蛋白、調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白、激活凋亡途徑，以及通過(guò)抑制HER/neu 及VEGFR 在腫瘤中的功能，從而有效地抑制PCA發(fā)展[7]，但目前關(guān)于魚(yú)腥草抗前列腺癌相關(guān)機(jī)制的研究仍比較少，也并不全面。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以反映和明確多種化合物、多個(gè)靶點(diǎn)、多種途徑之間的相互作用關(guān)系，是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探究魚(yú)腥草抗前列腺癌的作用機(jī)制、關(guān)鍵靶點(diǎn)及關(guān)鍵活性成分，希望為魚(yú)腥草抗前列腺癌的臨床研究和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供更多的參考。

1 資料與方法

1.1 魚(yú)腥草成分及作用靶點(diǎn)篩選通過(guò)搜索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）篩選魚(yú)腥草有效成分，設(shè)置條件為口服生物利用度（OB）≥30%，類(lèi)藥性≥0.18[8]，同時(shí)查找相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行補(bǔ)充，建立魚(yú)腥草活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。將獲取的魚(yú)腥草化學(xué)成分轉(zhuǎn)化為MoL2 格式結(jié)構(gòu)文件，將其結(jié)構(gòu)文件上傳至PharmMapper 平臺(tái)（http://www.lilabecust.cn/pharmmapper/），選擇物種為“Homo sapiens”，尋找潛在藥物靶點(diǎn)。利用UniProt 數(shù)據(jù)平臺(tái)（ http:www.uniprot.org/）將蛋白質(zhì)名稱轉(zhuǎn)化為基因名稱。

1.2 前列腺癌靶點(diǎn)篩選以“prostatic cancer”作為關(guān)鍵詞，通過(guò)GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https//www.genecard.org）、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.omim.org/）、Drug Bank數(shù)據(jù)庫(kù)（https://go.drugbank.com/）查找前列腺癌相關(guān)靶點(diǎn)，并對(duì)上述3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的靶點(diǎn)進(jìn)行整理、合并、去重。通過(guò)微生信息數(shù)據(jù)處理平臺(tái)（http://www.bioinformatics.com.cn/），將前列腺癌相關(guān)的疾病靶點(diǎn)和魚(yú)腥草藥物活性成分靶點(diǎn)取交集，繪制Venn圖，獲得魚(yú)腥草治療前列腺癌的潛在治療靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）將潛在治療靶點(diǎn)上傳String 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cn.string-db.org/），設(shè)置最小相互作用閾值為0.4，蛋白種類(lèi)為Homo sapiens，將從String數(shù)據(jù)庫(kù)得到的蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件Cytoscape3.9.1，運(yùn)用Network analyzer 功能及CytoNCA 功能分析靶點(diǎn)度（degree）值，根據(jù)度值大小排列。度值越大，說(shuō)明該靶點(diǎn)在魚(yú)腥草發(fā)揮抗腫瘤中的作用越關(guān)鍵，為魚(yú)腥草治療前列腺癌的核心靶點(diǎn)。

1.4 “藥物-活性成分-共同靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建將藥物活性成分及交集靶點(diǎn)和疾病導(dǎo)入Cytoscape3.9.1 軟件，構(gòu)建“藥物-活性成分-共同靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)（target-pathway），便于數(shù)據(jù)可視化分析。通過(guò)對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，篩選出魚(yú)腥草治療前列腺癌的關(guān)鍵成分。

1.5 通路富集分析DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）是用于基因注釋、分類(lèi)、富集和途徑分析的在線工具。使用DAVID 工具進(jìn)行GO 基因功能和KEGG 信號(hào)通路富集分析，設(shè)定參數(shù)Select Identifier為“official gene symbol”，List Type 選擇“gene list”，物種選擇“homo sapiens”，以“閾值P＜0.05”為條件；并使用微生信息數(shù)據(jù)處理平臺(tái)（http://www.bioinformatics.com.cn） 對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理，選擇關(guān)系密切的分析結(jié)果進(jìn)行繪圖。

1.6 分子對(duì)接通過(guò)Autodock Vina軟件[9]，將篩選出的關(guān)鍵有效活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，計(jì)算結(jié)合能，利用Pymol 軟件進(jìn)行作圖分析。受體-配體的結(jié)合程度可以通過(guò)分子對(duì)接結(jié)果中的結(jié)合能水平來(lái)判斷，當(dāng)結(jié)合能小于0 時(shí)，代表二者之間可以自由結(jié)合，結(jié)合能越低，表示二者結(jié)合越穩(wěn)定[10]。

2 結(jié)果

2.1 魚(yú)腥草活性成分及靶點(diǎn)共檢索到7 個(gè)活性成分，主要為異熱馬酮、山奈酚、1-甲基-2-二十九烷基-4-喹諾酮（1-甲基-2-九糖基-4-喹諾酮）、菠菜甾醇、槲皮素、黃夾次苷丙等；同時(shí)查找文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)魚(yú)腥草中β-谷甾醇、魚(yú)腥草素對(duì)前列腺癌細(xì)胞有抑制作用[11-12]，故共計(jì)9種成分（見(jiàn)表1）。去除重復(fù)靶點(diǎn)后得到388個(gè)活性成分作用靶點(diǎn)。

表1 魚(yú)腥草有效成分基本信息

2.2 前列腺癌相關(guān)靶點(diǎn)通過(guò)檢索GeneCards、OMIM 和Drug bank 3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)分別篩選到798、492、22 個(gè)疾病相關(guān)基因，將得到的基因靶點(diǎn)匯總?cè)ブ?，最終得到1158個(gè)疾病靶點(diǎn)。將藥物活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，繪制Venn圖，得到與前列腺癌相關(guān)的藥物活性成分靶點(diǎn)98個(gè)，見(jiàn)圖1。

圖1 魚(yú)腥草治療前列腺癌靶點(diǎn)Venn圖

2.3 PPI圖的構(gòu)建 將潛在治療靶點(diǎn)上傳String 數(shù)據(jù)庫(kù)建立PPI 網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)軟件Cytoscape3.9.1，運(yùn)用Network analyzer功能及CytoNCA功能分析，共有96個(gè)靶點(diǎn)蛋白節(jié)點(diǎn)（有2 個(gè)靶點(diǎn)游離），2560 條邊，顏色較深、半徑較大的為表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、雌激素受體1（ESR1）、HRas 原 癌 基 因(HRAS)、半 胱 天 冬 酶-3(CASP3)等靶點(diǎn)蛋白，見(jiàn)圖2。度值排名前10 的靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)，表明其在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了重要作用，其靶點(diǎn)蛋白詳細(xì)信息見(jiàn)表2。

圖2 魚(yú)腥草治療前列腺癌交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

表2 魚(yú)腥草治療前列腺癌核心靶點(diǎn)基本信息

2.4 “藥物-活性成分-共同靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建將98 個(gè)潛在治療靶點(diǎn)上傳String 數(shù)據(jù)庫(kù)得到的蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件Cytoscape3.9.1，使用Cytoscape3.9.1 軟件構(gòu)建“魚(yú)腥草-活性成分-共同靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。共得到109 個(gè)節(jié)點(diǎn)，798 個(gè)關(guān)系。圖中粉色表示前列腺癌，橙色表示魚(yú)腥草活性成分，黃色表示潛在治療靶點(diǎn)。圖中填充物顏色越深，說(shuō)明該靶點(diǎn)連接的邊越多，也就是節(jié)點(diǎn)degre值越高；節(jié)點(diǎn)越大，說(shuō)明該成分的degree值越大，表示其相互作用越強(qiáng)，圖3 中提示菠菜甾醇、山奈酚、魚(yú)腥草素、槲皮素、β-谷甾醇可能是魚(yú)腥草治療PCA方面的潛在活性成分。

圖3 魚(yú)腥草治療前列腺癌的“藥物－活性成分－共同靶點(diǎn)－疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO分析及KEGG分析 GO分析結(jié)果顯示，生物學(xué)過(guò)程（BP）共富集464 個(gè)條目，主要涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡過(guò)程的負(fù)向調(diào)控、細(xì)胞遷移的正向調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、蛋白質(zhì)自磷酸化、磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)傳導(dǎo)的積極調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程相關(guān)；細(xì)胞組分（CC）共富集63個(gè)條目，主要涉及細(xì)胞溶質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)、核、黏附斑、富含無(wú)花果蛋白酶-1的顆粒腔、受體復(fù)合物、核質(zhì)等；分子功能（MF）共富集96 個(gè)條目，主要與蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白激酶活性、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、配體激活的序列特異性DNA 結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性、ATP 結(jié)合等功能有關(guān)。因富集條目較多，選取排名前10 的通路建立柱狀圖，見(jiàn)圖4。KEGG 信號(hào)通路富集分析結(jié)果顯示，魚(yú)腥草治療前列腺癌的主要靶點(diǎn)主要涉及癌癥通路、前列腺癌通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路等，見(jiàn)圖5。通過(guò)交集靶點(diǎn)與通路網(wǎng)絡(luò)圖（圖6）可知，PI3K-Akt 信號(hào)通路、癌癥通路、前列腺癌通路等為核心通路；癌癥通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、癌癥蛋白聚糖等通路上均具有AKT1、HRAS等靶點(diǎn)（見(jiàn)表3）。

圖4 魚(yú)腥草治療前列腺癌的GO富集分析

圖5 魚(yú)腥草治療前列腺癌的KEGG信號(hào)通路富集分析

圖6 魚(yú)腥草治療前列腺癌的KEGG通路-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表3 魚(yú)腥草治療前列腺癌的核心通路表

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證綜和核心靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)與KEGG通路-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖選取AKT1、HRAS2與魚(yú)腥草核心成分進(jìn)行分子堆積，通過(guò)圖2中篩選出的山奈酚、魚(yú)腥草素、菠菜甾醇3 個(gè)有效活性成分與AKT1、HRAS2 靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，結(jié)果顯示，HRAS與菠菜甾醇結(jié)合能力最強(qiáng)，AKT1與菠菜甾醇未找到氫鍵，AKT1 與山奈酚、HRAS 與山奈酚、AKT1 與魚(yú)腥草素、HRAS 與魚(yú)腥草素均可自由結(jié)合，見(jiàn)表4；將結(jié)合較好的配體受體可視化，見(jiàn)圖7。

圖7 菠菜甾醇和HRAS分子對(duì)接

表4 主要活性物質(zhì)分子與關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)合能

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是多學(xué)科相互交融，構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)，綜合分析藥物與疾病的相互作用，揭示藥物協(xié)同作用于人體的機(jī)理的一門(mén)新學(xué)科[13]。魚(yú)腥草具有利尿通淋、清熱解毒、消癰排膿等作用，可用于泌尿系感染、前列腺炎等疾病，近年來(lái)臨床發(fā)現(xiàn)魚(yú)腥草對(duì)肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等各類(lèi)腫瘤具有明顯的抑制作用，針對(duì)前列腺癌也有其抑制作用。但是，目前關(guān)于魚(yú)腥草抗前列腺癌相關(guān)機(jī)制的研究比較少，作用機(jī)制也尚未深入研究。本研究綜合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接，對(duì)魚(yú)腥草治療前列腺癌的機(jī)制進(jìn)行了初步探索。

“藥物-活性成分-共同靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖運(yùn)用Betweenness、Degree 算法拓?fù)浞治觯C合分析魚(yú)腥草活性成分，結(jié)果得出排名較前的活性成分分別為菠菜甾醇、山奈酚、魚(yú)腥草素、槲皮素、β-谷甾醇。β-谷甾醇可直接作用到AKT1、HRAS、RHOA、CASP3、SRC、ESR1 等關(guān)鍵靶點(diǎn)。菠菜甾醇為植物甾醇的一種類(lèi)別[14]，研究顯示，植物甾醇可誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而抑制癌癥的發(fā)展，減少癌細(xì)胞遷移并導(dǎo)致G2/M 細(xì)胞周期停滯，抑制JAK/STAT 信號(hào)通路等過(guò)程，控制多種癌癥類(lèi)型的進(jìn)展[15]；菠菜甾醇對(duì)宮頸癌細(xì)胞系HeLa和鼠巨噬細(xì)胞系RAW 264.7具有抗增殖作用，顯示出了抗腫瘤的潛力[16]。山萘酚可能通過(guò)調(diào)控Cleaved caspase-3 及Notch1 蛋白的表達(dá)從而抑制乳腺癌SK-BR-3 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡[17]；山奈酚可通過(guò)調(diào)控 Ki67 的表達(dá)，從而誘導(dǎo)前列腺癌的細(xì)胞周期分布，誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡[18]；宋文斌[19]研究表明山奈酚通過(guò)影響IGF/AKT/ERK1/2 信號(hào)通路，增強(qiáng)前列腺癌LNCaP 細(xì)胞對(duì)于凋亡誘導(dǎo)劑TRAIL 的敏感性，下調(diào)雄激素受體依賴性基因——前列腺特異性抗原（PSA）及5α 還原酶-1 的表達(dá)等方面發(fā)揮抗前列腺癌作用。魚(yú)腥草素可通過(guò)抑制STAT3/核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路而從改善炎癥性腸病[20]，而炎癥是腫瘤微環(huán)境的特征之一，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與炎癥有一定的相關(guān)性，STAT3通過(guò)介導(dǎo)多種炎癥因子信號(hào)調(diào)控免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等生物學(xué)行為，在慢性炎癥誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生和腫瘤相關(guān)性炎癥形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[21]，STAT3的表達(dá)與癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。槲皮素是一種重要的黃酮類(lèi)化合物，具有抗腫瘤作用，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制代謝活性和細(xì)胞死亡，并可通過(guò)滅活caspase/Cyto-c 途徑、抑制AP-2β/hTERT、抑制NF-κB/COX-2和阻斷Akt/ERK1/2、PI3K-Akt信號(hào)通路而發(fā)揮抗腫瘤作用[22]。同時(shí)，通過(guò)拓?fù)鋮?shù)可知AKT1、HRAS靶點(diǎn)在核心靶點(diǎn)中較為重要。AKT1 是治療癌癥中常見(jiàn)的靶蛋白，可激活PI3K-Akt 信號(hào)通路中的下游分子，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮作用，AKT基因的異?；罨纱龠M(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤的發(fā)生[23-24]。HRAS 基因?qū)儆谥掳┗颍荝AS 致癌基因家族的一個(gè)主要成分，有研究[25]表明，Ras 激活可通過(guò)PI3K 信號(hào)通路降低人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞中相關(guān)成分表達(dá)水平，從而調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。RAS 基因突變通過(guò)抑制GTP 酶活性激活其下游的PI3K 信號(hào)通路，使其異常活化，引起細(xì)胞的持續(xù)生長(zhǎng)導(dǎo)致癌變[26]，RAS 基因在從酪氨酸激酶和G 蛋白偶聯(lián)受體到MAPK和PI3K-AKT通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，約三分之一的腫瘤中存在RAS 突變，其中較常見(jiàn)的為HRAS[27]。閻臻[28]研究顯示，抑制HRAS基因表達(dá)可激活PTEN信號(hào)通路，促進(jìn)上皮間質(zhì)的轉(zhuǎn)化、細(xì)胞自噬和凋亡，抑制宮頸癌的發(fā)生。

本研究通過(guò)分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)，山奈酚、魚(yú)腥草素與AKT1、HRAS 等關(guān)鍵靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合力；KEGG富集結(jié)果顯示，魚(yú)腥草治療前列腺癌主要通路集中在癌癥通路、前列腺癌通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等，且在上述通路中，均存在AKT1、HRAS 等蛋白。本研究通過(guò)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖、GO 及KEGG 富集分析表明，魚(yú)腥草通過(guò)調(diào)節(jié)ATP結(jié)合、絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性等，并通過(guò)癌癥通路、前列腺癌通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路等對(duì)PCA 起治療作用。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)合本領(lǐng)域相關(guān)研究成果得出，HRAS 是魚(yú)腥草抑制前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的重要靶點(diǎn)；魚(yú)腥草中以菠菜甾醇、山奈酚、魚(yú)腥草素為主的活性成分與其抑制前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制關(guān)系最為密切。從本研究結(jié)果可推測(cè)，魚(yú)腥草主要通過(guò)作用于PI3K-Akt 信號(hào)通路，影響下游HRAS 相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而達(dá)到抑制前列腺癌細(xì)胞增殖的效果。這一推斷可以通過(guò)深入研究獲得驗(yàn)證，并指導(dǎo)進(jìn)一步臨床研究，希望能為魚(yú)腥草的新藥開(kāi)發(fā)以及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。