趨化因子配體25、葉酸受體1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系

王盼，楊秀春

作者單位：北京市平谷區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，a普外科，b外科，北京101200

結(jié)直腸癌（CRC）的發(fā)病率逐年上升［1］。大部分病人確診治療時(shí)病情已發(fā)展至中晚期階段，錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)，病人預(yù)后效果不理想，且目前臨床缺乏能夠準(zhǔn)確評(píng)估病人預(yù)后的指標(biāo)，因此，尋找能夠有效評(píng)估CRC病人預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)具有重要的臨床意義［2-3］。趨化因子配體25（CCL25）可一定程度反應(yīng)機(jī)體炎癥程度，機(jī)體內(nèi)主要參與刺激炎癥分子和免疫細(xì)胞分化、增殖和凋亡等生理過(guò)程［4］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［5］。CCL25體內(nèi)主要存在于小腸上皮細(xì)胞和胸腺，其表達(dá)水平與CRC、非小細(xì)胞肺癌和卵巢癌等多種腫瘤疾病發(fā)展密切相關(guān)［6］。葉酸受體1（FOLR1）是一種膜蛋白，參與調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞增殖、分化和遷移等生理過(guò)程［7］。研究發(fā)現(xiàn)FOLR1在多種腫瘤細(xì)胞增殖、分化等過(guò)程中異常表達(dá)，例如卵巢癌、肺癌、肝癌等［8-9］。目前CCL25和FOLR1在CRC發(fā)展過(guò)程中的研究鮮有報(bào)道。本研究對(duì)CRC病人CCL25和FOLR1水平與預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行分析，為臨床中CRC的預(yù)后提供新的研究方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2014年10月至2019年8月北京市平谷區(qū)中醫(yī)醫(yī)院接收的CRC病人（70例）為研究對(duì)象（實(shí)驗(yàn)組），年齡范圍為46～68歲；以同期到本院體檢的35例健康者的血清樣本作為對(duì)照組，年齡范圍為48～65歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床確診為CRC；（2）術(shù)前未進(jìn)行抗腫瘤治療；（3）無(wú)其他并發(fā)癥；（4）病人均知情同意；排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他惡性腫瘤；（2）合并血液相關(guān)疾病；（3）合并肝、腎等其他器官障礙者；（4）基礎(chǔ)臨床病理資料不全者。本研究經(jīng)北京市平谷區(qū)中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（批號(hào)20140825）。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采集CRC病人癌組織以及癌旁組織（距癌組織＞3 cm）。采集CRC病人術(shù)前和對(duì)照組體檢時(shí)3～5 mL空腹靜脈血，離心（3 500 r/min，10 min，半徑8 cm）后，存儲(chǔ)于-80 ℃。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法 分別采用人趨化因子配體25（CCL25）ELISA試劑盒（合肥萊爾生物科技有限公司）、葉酸受體1（FOLR1）ELISA試劑盒（上海優(yōu)科唯生物科技有限公司）檢測(cè)血清CCL25和FOLR1表達(dá)水平，嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色法 將組織進(jìn)行脫蠟、水化、沖洗（PBS緩沖液）后，將抗原進(jìn)行修復(fù)，玻片沖洗（PBS緩沖液，3次）后，依次加入CCL25和FOLR1的一抗，孵育過(guò)夜（4 ℃），沖洗（PBS緩沖液，4次）后加入生物素標(biāo)記的二抗，放置45 min（室溫），沖洗（PBS緩沖液，3次）后進(jìn)行染色、復(fù)染、定色、脫水、封片。陽(yáng)性病理切片為陽(yáng)性對(duì)照，PBS緩沖液為一抗做陰性對(duì)照。

1.2.4 免疫組化結(jié)果判定 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分為將著色強(qiáng)度和著色面積兩個(gè)部分：（1）著色強(qiáng)度評(píng)分：棕褐色（3分）；棕黃色（2分）；淡黃色（1分）；無(wú)著色（0分）。（2）著色面積評(píng)分：占比＞75%（4分）；占比51%～75%（3分）；占比26%～50%（2分）；占比11%～25%（1分）；占比＜10%（0分）。將兩部分評(píng)分相加，評(píng)估其陽(yáng)性表達(dá)（≥3分）和陰性表達(dá)（＜3分）。

1.2.5 隨訪觀察 對(duì)CRC病人進(jìn)行為期3年的隨訪（電話及門診復(fù)查），病人隨訪率為100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 通過(guò)SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用例（%）描述，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料行描述，進(jìn)行獨(dú)立樣t檢驗(yàn)（組間）和配對(duì)樣本t檢驗(yàn)（組內(nèi)），通過(guò)Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，CRC病人預(yù)后的影響因素通過(guò)多因素Cox回歸進(jìn)行評(píng)估。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料與血清CCL25、FOLR1的表達(dá)分析 相較于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組病人血清CCL25和FOLR1水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩組年齡、性別均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 CRC病人70例與健康者35例一般資料與血清CCL25、FOLR1的表達(dá)水平分析

2.2 CRC組織和癌旁組織CCL25、FOLR1表達(dá)比較 通過(guò)顯微鏡觀察結(jié)果顯示，CRC組織中CCL25的陽(yáng)性表達(dá)率（68.57%比21.43%）高于癌旁組織，CRC組織中FOLR1的陽(yáng)性表達(dá)率（65.71%比25.71%）高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2，圖1。

表2 CRC組織及癌旁組織中CCL25、FOLR1的表達(dá)情況/例（%）

圖1 結(jié)直腸癌（CRC）組織及癌旁組織中趨化因子配體25（CCL25）、葉酸受體1（FOLR1）的表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色×200）

2.3 CRC病人血清CCL25、FOLR1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系分析 選擇病人年齡、腫瘤長(zhǎng)徑、瘤體類型、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)程度等臨床病理特征進(jìn)行分類，分析其病理特征與血清CCL25、FOLR1表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果顯示：CRC病人血清CCL25、FOLR1表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、浸潤(rùn)程度有關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 血清趨化因子配體25（CCL25）、葉酸受體1（FOLR1）的表達(dá)與結(jié)直腸癌70例臨床病理特征的關(guān)系/

表3 血清趨化因子配體25（CCL25）、葉酸受體1（FOLR1）的表達(dá)與結(jié)直腸癌70例臨床病理特征的關(guān)系/

注：CCL25為趨化因子配體25，F(xiàn)OLR1為葉酸受體1。

病理特征年齡＜60歲≥60歲腫瘤長(zhǎng)徑＜3 cm≥3 cm瘤體類型潰瘍型隆起型浸潤(rùn)型TNM分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期分化程度低分化中、高分化淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)有浸潤(rùn)程度未出肌層突出肌層例數(shù)CCL25/（μg/L）t（F）值1.04 P值0.302 FOLR1/（ng/L）t（F）值1.11 P值0.269 38 32 13.90±3.12 14.74±3.64 549.26±81.63 571.92±88.40 0.740.4651.890.063 34 36 13.94±3.72 14.61±3.90 538.84±85.84 579.24±92.42（0.30）0.742（0.59）0.556 23 18 29 13.88±3.20 14.74±3.35 14.31±3.89 544.48±86.90 560.65±84.69 570.98±89.25 3.96＜0.0013.330.001 37 33 12.59±3.48 16.18±4.11 525.96±86.50 597.37±92.67 0.860.3960.960.341 32 38 13.88±3.14 14.62±3.96 548.95±83.35 568.60±86.94 2.720.0083.060.003 35 35 13.08±3.22 15.48±4.10 529.10±74.55 590.14±91.74 2.950.0043.280.002 31 39 12.59±3.50 15.63±4.82 521.58±78.49 589.86±92.42

2.4 CRC病人血清CCL25、FOLR1表達(dá)與病人3年生存率的關(guān)系分析 分析CRC病人血清CCL25、FOLR1的表達(dá)與病人預(yù)后的關(guān)系，以CRC病人血清CCL25、FOLR1的平均水平值為臨界點(diǎn)，CCL25≥14.28 μg/L為高表達(dá)組（32例），＜14.28 μg/L為低表達(dá)組（38例），F(xiàn)OLR1≥559.62 ng/L為高表達(dá)組（30例），＜559.62 ng/L為低表達(dá)組（40例）。結(jié)果顯示CCL25高表達(dá)組的3年生存率（31.25%，10/32）低于低表達(dá)組（78.95%，30/38），F(xiàn)OLR1高表達(dá)組3年生存率（30.00%，9/30）低于低表達(dá)組（77.50%，31/40），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.63、4.61，均P＜0.001）。

2.5 CRC病人預(yù)后影響因素的Cox回歸分析 以CRC病人預(yù)后（死亡=1，生存=0）為因變量，TNM分期（Ⅰ～Ⅱ期=0，Ⅲ～Ⅳ期=1）、浸潤(rùn)程度（未出肌層=0，突出肌層=1）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（無(wú)=0，有=1）、CCL25（具體值）和FOLR1（具體值）水平為自變量進(jìn)行多因素Cox回歸。結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、浸潤(rùn)程度、FOLR1和CCL25水平為CRC病人預(yù)后影響因素（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 結(jié)直腸癌病人預(yù)后影響因素的Cox回歸分析

3 討論

CRC是臨床發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段、多基因的過(guò)程［10］。CRC發(fā)病原因復(fù)雜，存在多種內(nèi)在和外在因素，例如家族史、慢性炎癥、飲食習(xí)慣等［11］。CRC早期發(fā)病特征不明顯，病人確診時(shí)多數(shù)已發(fā)展為中晚期，臨床常采用手術(shù)、化療和靶向治療等手段進(jìn)行干預(yù)治療，但由于缺乏特異性預(yù)后評(píng)估指標(biāo)，CRC病人預(yù)后易發(fā)生轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等不良現(xiàn)象，影響病人預(yù)后生活質(zhì)量［12］。因此，尋找CRC預(yù)后評(píng)估的特異性指標(biāo)對(duì)CRC病人預(yù)后生存率提高具有重要意義。

趨化因子是一類由70～100個(gè)氨基酸組成，可以趨化特定細(xì)胞定向遷移的低分子分泌蛋白［13］。CCL25屬于趨化因子配體一員，為CCR9的唯一配體，多項(xiàng)研究表明CCL25與受體CCR9共同作用對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲等具有促進(jìn)作用［14］。研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子誘導(dǎo)機(jī)體T細(xì)胞反應(yīng)，從而影響腸癌微環(huán)境相關(guān)因子的分泌，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體腸道失衡［15］。徐輝等［16］研究趨化因子誘導(dǎo)T細(xì)胞對(duì)CRC微環(huán)境的影響，結(jié)果表明，與癌旁組織相比，CRC組織中趨化因子表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，趨化因子與CRC細(xì)胞浸潤(rùn)和腸道微生物群顯著相關(guān)，趨化因子可刺激T細(xì)胞分泌至腫瘤組織，影響CRC病人的治療及預(yù)后情況。本研究中，CCL25陽(yáng)性表達(dá)率在CRC組織中較高，實(shí)驗(yàn)組病人血清CCL25表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），血清CCL25表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)程度有關(guān)（P＜0.05），CRC病人血清CCL25低表達(dá)病人3年生存率（78.95%）顯著高于高表達(dá)病人生存率（31.25%）（P＜0.05），CCL25水平為CRC病人預(yù)后影響因素（P＜0.05），提示CCL25表達(dá)水平與CRC病人病情發(fā)展密切相關(guān)，且影響病人預(yù)后生存率。

FOLR屬于葉酸受體蛋白，人體葉酸代謝失調(diào)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫因子表達(dá)異常，引發(fā)染色體甲基化異常，與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［17］。目前，F(xiàn)OLR主要包括FOLR1、FOLR2和FOLR3三種亞型，F(xiàn)OLR1在體內(nèi)主要存在于細(xì)胞外膜，對(duì)葉酸存在較高的親和力，通過(guò)其表達(dá)水平變化調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和遷移等［18-19］。本研究中，F(xiàn)OLR1陽(yáng)性表達(dá)率在CRC組織中較高，實(shí)驗(yàn)組病人血清FOLR1表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），血清FOLR1表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)程度有關(guān)（P＜0.05），血清FOLR1低表達(dá)病人3年生存率（77.50%）顯著高于高表達(dá)病人生存率（30.00%）（P＜0.05），F(xiàn)OLR1水平為CRC病人預(yù)后影響因素（P＜0.05），提示FOLR1表達(dá)水平與CRC病人病情發(fā)展密切相關(guān)，且影響病人預(yù)后生存率。

綜上所述，CCL25、FOLR1在CRC病人中表達(dá)水平上升，并影響CRC病人預(yù)后生存率。