甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白14對(duì)急性早幼粒白血病細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的調(diào)節(jié)作用

張孟孟，伍燕平，張平平，王蒙，李佳佳

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科，安徽蚌埠 233003

急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL）占成人急性髓系白血?。ˋML）的5%～10%，是一種罕見(jiàn)但高度可治愈的AML，大多數(shù)APL 患者可通過(guò)聯(lián)合全反式維甲酸和三氧化二砷療法治愈，但仍有部分患者出現(xiàn)早期死亡和復(fù)發(fā)。目前對(duì)于APL 的發(fā)病機(jī)制及細(xì)胞分化的潛在機(jī)制仍未闡明。研究顯示，N6-甲基腺苷（m6A）甲基化通過(guò)影響不同靶基因分子的翻譯和穩(wěn)定性，調(diào)控相關(guān)通路，參與AML 的發(fā)生發(fā)展［1］；而甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白14（METTL14）通過(guò)增強(qiáng)m6A 甲基化，調(diào)控其靶點(diǎn)如MYB 和MYC 的表達(dá)，促進(jìn)AML進(jìn)展［2］。2022年9月—2023年6月，我們以急性早幼粒細(xì)胞株NB4 為研究對(duì)象，通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)及敲低的METTL14 轉(zhuǎn)染NB4 細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷移的變化，為研究APL 的機(jī)制及臨床治療尋找新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人類早幼粒細(xì)胞株NB4 購(gòu)自中國(guó)無(wú)錫Hasenbio公司。L-谷氨酰胺（美國(guó)Gibco公司），LipofectamineTM2000（美國(guó)Invitrogen公司），質(zhì)粒（中國(guó)上海GenePharma 公司），Transwell 小室（美國(guó)Corning公司）、CCK-8 試劑盒（日本Dojindo 公司），兔抗m6A抗體、山羊抗兔IgG。流式細(xì)胞儀（美國(guó)Bio-Rad 公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)Awareness 公司），電子顯微鏡（日本尼康公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取NB4 細(xì)胞，加入含10%胎牛血清和L-谷氨酰胺的IMDM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.3 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染方法 按照說(shuō)明書(shū)使用LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以每孔1 × 105細(xì)胞接種于6 孔板，后續(xù)轉(zhuǎn)染待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%以上融合時(shí)進(jìn)行。將細(xì)胞分為過(guò)表達(dá)對(duì)照組、過(guò)表達(dá)組、干擾對(duì)照組、干擾組，其中過(guò)表達(dá)對(duì)照組及過(guò)表達(dá)組分別使用LipofectamineTM2000 試劑將空白質(zhì)粒和METTL14質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，干擾對(duì)照組和干擾組分別使用LipofectamineTM2000 試劑將si-NC 和si-METTL14 轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染完成后，置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 細(xì)胞增殖能力觀察 采用CCK-8 法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于96 孔培養(yǎng)板，調(diào)整細(xì)胞密度為1 × 104/孔。加入5 g/L MTT 溶液孵育4 h，離心棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，避光振蕩15 min。上酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490 nm 波長(zhǎng)處的吸光度（OD）值，以O(shè)D值代表細(xì)胞增殖活力。

1.5 細(xì)胞凋亡情況觀察 采用流式細(xì)胞儀。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔1 × 105個(gè)細(xì)胞接種于24 孔培養(yǎng)板，終體積為500 μL。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染同前，轉(zhuǎn)染48 h 后，收集細(xì)胞，用冷PBS 洗滌2 次后將細(xì)胞重懸于100 μL 的Binding Buffer，分別加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI，室溫避光染色10 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.6 細(xì)胞遷移能力觀察 采用Transwell 實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，Transwell 上室加入含2 × 105個(gè)細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基，下室加入含20% FBS的培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。遷移細(xì)胞使用4%甲醛固定，結(jié)晶紫染色10 min。顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)，隨機(jī)選取5個(gè)視野取平均值，代表細(xì)胞遷移能力。

1.7 細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Transwell 實(shí)驗(yàn)。用40 μg Matrigel 包被24 孔板中的Boyden 小室，其余步驟與“1.5”相同。顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)，隨機(jī)選取5個(gè)視野取平均值，代表細(xì)胞侵襲能力。

1.8 細(xì)胞m6A 甲基化水平檢測(cè) 采用Dot blotting法。在真空下從變性和斑點(diǎn)RNA 樣品中收集硝酸纖維素膜。UV 交聯(lián)后，加入5% 脫脂奶粉在0.1% PBST 中封閉1 h。在4 ℃下將兔抗m6A 抗體（1∶500）添加到膜中過(guò)夜。洗滌后，將印跡與山羊抗兔IgG（1∶500）混合，25 ℃孵育1 h。使用Roche LightCycler?480Ⅱ成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描，以灰度值表示各組細(xì)胞m6A甲基化水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism5.0 統(tǒng)計(jì)軟件。采用S-W 法對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖情況比較 過(guò)表達(dá)對(duì)照組和過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞增殖率分別為84.35% ± 2.09%、109.31% ± 1.57%，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞增殖率高于過(guò)表達(dá)對(duì)照組（P＜0.01）。干擾對(duì)照組和干擾組的細(xì)胞增殖率分別為83.55% ± 5.14%、50.15% ± 2.12%，干擾組細(xì)胞增殖率低于干擾對(duì)照組（P＜0.01）。

2.2 各組細(xì)胞凋亡情況比較 過(guò)表達(dá)對(duì)照組和過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞凋亡率分別為7.73% ± 0.99%、4.14% ± 0.73%，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞凋亡率低于過(guò)表達(dá)對(duì)照組（P＜0.01）。干擾對(duì)照組和干擾組的細(xì)胞凋亡率分別為7.43% ± 0.74%、34.20% ± 3.46%，干擾組細(xì)胞凋亡率高于干擾對(duì)照組（P＜0.01）。

2.3 各組細(xì)胞遷移能力比較 過(guò)表達(dá)對(duì)照組和過(guò)表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（232 ± 16）、（393 ± 15）個(gè)，過(guò)表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)高于過(guò)表達(dá)對(duì)照組（P＜0.01）。干擾對(duì)照組和干擾組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（232 ± 24）、（113 ± 9）個(gè)，干擾組穿膜細(xì)胞數(shù)少于干擾對(duì)照組（P＜0.01）。

2.4 各組細(xì)胞侵襲能力比較 過(guò)表達(dá)對(duì)照組和過(guò)表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（158 ± 13）、（268 ± 18）個(gè)，過(guò)表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)高于過(guò)表達(dá)對(duì)照組（P＜0.01）。干擾對(duì)照組和干擾組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（155 ± 13）、（64 ± 6）個(gè)，干擾組穿膜細(xì)胞少于干擾對(duì)照組（P＜0.01）。

2.5 各組細(xì)胞m6A 表達(dá)比較 過(guò)表達(dá)對(duì)照組和過(guò)表達(dá)組細(xì)胞m6A 相對(duì)表達(dá)量分別為0.122 ± 0.004、0.240 ± 0.005，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞m6A 表達(dá)水平高于過(guò)表達(dá)對(duì)照組（P＜0.01）。干擾對(duì)照組和干擾組細(xì)胞m6A 相對(duì)表達(dá)量分別為0.128 ± 0.005、0.072 ±0.002，干擾組細(xì)胞m6A 表達(dá)水平低于干擾對(duì)照組（P＜0.01）。

3 討論

APL 是AML 的一種特殊亞型，其特征主要是15號(hào)與17號(hào)染色體發(fā)生易位，導(dǎo)致早幼粒細(xì)胞白血病基因與維甲酸受體基因融合，引起惡性血細(xì)胞克隆性增殖。近年來(lái)采用全反式維甲酸聯(lián)合三氧化二砷療法治療APL，其治愈率已大幅度上升，但仍有部分患者出現(xiàn)早期死亡和復(fù)發(fā)。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)，抑制APL 細(xì)胞增殖、侵襲及遷移對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義。METTL14 是一種甲基轉(zhuǎn)移酶，它可以催化哺乳動(dòng)物的mRNA 進(jìn)行m6A 修飾。表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）是METTL14 的下游靶基因，METTL14 以m6A 甲基化依賴的方式調(diào)控EGFR/PI3K/AKT 信號(hào)通路，從而抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和腫瘤細(xì)胞侵襲［3］。METTL14可阻斷骨髓分化，促進(jìn)正常造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞和AML 細(xì)胞增殖；METTL14 介導(dǎo)的m6A 甲基化可提高下游靶基因MYC/MYB 的基因穩(wěn)定性和翻譯，而METTL14 受SP1 負(fù)調(diào)控，當(dāng)SP1 表達(dá)受到抑制時(shí)，METTL14 可上調(diào)MYC/MYB 表達(dá)，從而導(dǎo)致骨髓分化受阻和腫瘤發(fā)生［2］。METTL14異常表達(dá)與多種腫瘤發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)。研究顯示，METTL14在結(jié)腸癌［4］、肝癌［5］、乳腺癌［6］中表達(dá)降低，并與患者的不良預(yù)后有關(guān)。MARTIN 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，METTL14 在正常小鼠造血干細(xì)胞中呈低表達(dá)，在AML 小鼠造血干細(xì)胞中呈高表達(dá)；對(duì)AML 小鼠造血干細(xì)胞使用分化誘導(dǎo)劑后，METTL14 水平顯著降低，表明降低METTL14可促進(jìn)骨髓細(xì)胞分化。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于METTL14在APL 中作用的研究較少，為了明確METTL14 與APL 的關(guān)系，我們觀察了METTL14 對(duì)APL 細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的調(diào)節(jié)作用。

正常細(xì)胞增殖失控是腫瘤發(fā)生的重要原因之一，APL 通過(guò)激活PI3K/AKT 信號(hào)通路，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生惡性增殖。METTL14 對(duì)不同腫瘤細(xì)胞增殖的作用不同，表現(xiàn)為促進(jìn)或抑制作用。HU 等［8］報(bào)道，沉默METTL14表達(dá)可顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的活力、增殖和遷移，其機(jī)制可能與METTL14 上調(diào)m6A Myc表達(dá)有關(guān)。WU 等［9］報(bào)道，沉默METTL14 表達(dá)可顯著抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖。GONG 等［10］報(bào)道，METTL14 過(guò)表達(dá)可降低m6A 水平，從而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞增殖率高于過(guò)表達(dá)對(duì)照組，干擾組細(xì)胞增殖率低于干擾對(duì)照組，表明過(guò)表達(dá)METTL14表達(dá)可促進(jìn)NB4 細(xì)胞增殖，而敲低METTL14 表達(dá)則抑制NB4 細(xì)胞增殖，METTL14具有促進(jìn)NB4細(xì)胞增殖的作用。

細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞生物體的重要自穩(wěn)機(jī)制之一，對(duì)白血病的發(fā)病具有重要作用，下調(diào)Bcl-XL 等凋亡抑制基因能夠改變腫瘤細(xì)胞凋亡的閾值。METTL14 對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡主要表現(xiàn)為抑制作用。QIAN 等［11］報(bào)道，在非小細(xì)胞肺癌中，沉默METTL14表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。本研究顯示，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞凋亡率低于過(guò)表達(dá)對(duì)照組，干擾組細(xì)胞凋亡率高于干擾對(duì)照組，表明過(guò)表達(dá)METTL14 可抑制NB4 細(xì)胞凋亡，而敲低METTL14表達(dá)則促進(jìn)NB4 細(xì)胞凋亡，METTL14 具有抑制NB4細(xì)胞凋亡的作用。

在APL 患者中，腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲是威脅患者生存的重要原因，METTL14 在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，通過(guò)發(fā)揮原癌基因功能促進(jìn)腫瘤的遷移和侵襲。WANG 等［12］報(bào)道，在胰腺癌細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)METTL14 可抑制細(xì)胞遷移及侵襲。本研究結(jié)果顯示，在細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)均高于過(guò)表達(dá)對(duì)照組，干擾組穿膜細(xì)胞數(shù)均少于干擾對(duì)照組，表明過(guò)表達(dá)METTL14可以促進(jìn)NB4細(xì)胞遷移和侵襲，而敲低METTL14表達(dá)則抑制NB4細(xì)胞遷移及侵襲，METTL14 具有促進(jìn)NB4 細(xì)胞遷移和侵襲的作用。

m6A 是真核生物mRNA 最主要的內(nèi)部修飾，m6A 甲基化過(guò)程由甲基轉(zhuǎn)移酶、功能效應(yīng)子和去甲基化酶三部分動(dòng)態(tài)和可逆地調(diào)節(jié)，它們分別被稱為m6A 的“寫(xiě)入器”“讀取器”和“擦除器”。m6A 參與多種生理和病理過(guò)程，m6A 水平可影響RNA 代謝，包括mRNA 降解以及修飾RNA 的加工和翻譯［13］。研究表明，失調(diào)的m6A 相關(guān)蛋白和m6A 修飾在病毒感染、應(yīng)激、熱休克、腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。METTL14 是m6A 甲基化轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的核心成分，參與m6A 修飾的動(dòng)態(tài)可逆過(guò)程。m6A 修飾在白血病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［14-15］，而METTL14可以通過(guò)m6A 甲基化阻斷正常骨髓分化，促進(jìn)惡性骨髓的形成。WEI 等［16］研究顯示，過(guò)表達(dá)METTL14 可提高卵巢癌細(xì)胞的m6A 修飾水平。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)METTL14 促進(jìn)m6A 表達(dá)，而敲低METTL14 則抑制m6A 表達(dá)，提示m6A 的修飾水平受到METTL14的調(diào)控。因此認(rèn)為，METTL14可以提高NB4 細(xì)胞的m6A 修飾水平，從而促進(jìn)APL 的惡性增殖。

綜上所述，過(guò)表達(dá)METTL14 的NB4 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力增強(qiáng)，凋亡能力減弱，促進(jìn)NB4 細(xì)胞m6A 表達(dá)增高；而敲低METTL14 的NB4 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力減弱及凋亡能力增強(qiáng)，抑制NB4 細(xì)胞m6A 表達(dá)增高。這表明METTL14 能夠調(diào)節(jié)APL細(xì)胞的生物學(xué)功能，通過(guò)提高NB4 的m6A 修飾可促進(jìn)APL惡性增殖，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。