牡丹籽粕的添加對(duì)發(fā)酵豆醬理化性質(zhì)的影響

付瑋琦　李西西　任佳敏　趙雪如　李佳瑩　李風(fēng)娟

摘要：牡丹籽粕是油用牡丹籽榨油后得到的副產(chǎn)物，富含蛋白質(zhì)、多糖、黃酮等營(yíng)養(yǎng)成分。該研究在傳統(tǒng)豆醬的制作原料中添加牡丹籽粕，以研究其對(duì)豆醬發(fā)酵過程中曲料酶活及營(yíng)養(yǎng)成分的影響。通過單因素實(shí)驗(yàn)確定牡丹籽粕的最佳添加比例為黃豆∶籽粕為7∶3，在該條件下制得的成曲中性蛋白酶、淀粉酶和糖化酶最大酶活分別為1 177.85，686.58，1 564.36 U/g；后酵35 d后，所得牡丹籽粕豆醬中還原糖含量為9.66 g/100 g DW，多肽含量為19.53 g/100 g，總黃酮含量為1.93 mg CE/g DW，醬香濃郁、咸鮮適宜，具有良好的感官接受度，為提升牡丹籽粕附加值及開發(fā)新型營(yíng)養(yǎng)型調(diào)味品提供了理論指導(dǎo)和技術(shù)思路。

關(guān)鍵詞：牡丹籽粕；制曲；發(fā)酵豆醬；酶活

中圖分類號(hào)：TS201.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1000-9973（2024）01-0013-05

Effect of Addition of Peony Seed Meal on Physiochemical Properties of Fermented Soybean Paste

FU Wei-qi， LI Xi-xi， REN Jia-min， ZHAO Xue-ru， LI Jia-ying， LI Feng-juan*

Abstract： Peony seed meal （PSM） is a by-product obtained after oil extraction from peony seeds， which is rich in proteins， polysaccharides， flavonoids and other nutrients. In this study， peony seed meal is added into the raw materials of traditional soybean paste to study its effects on koji enzyme activity and nutrients during soybean paste fermentation. The best addition ratio of peony seed meal determined by single factor experiment is the ratio of soybean to seed meal of 7∶3. The maximum enzyme activities of neutral protease， amylase and glucoamylase in finished koji produced under such conditions are 1 177.85， 686.58， 1 564.36 U/g respectively. After post-fermentation for 35 days， the reducing sugar content of the obtained soybean paste with peony seed meal is 9.66 g/100 g DW， the polypeptide content is 19.53 g/100 g， and the total flavonoid content is 1.93 mg CE/g DW. The product has a strong paste aroma and moderate saltiness and umami， with good sensory acceptability. This study has provided theoretical guidance and technical ideas for increasing the added value of peony seed meal and developing new nutritious condiments.

Key words： peony seed meal; koji making; fermented soybean paste; enzyme activity

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）是雙子葉植物綱、芍藥科、芍藥屬落葉灌木。其種子牡丹籽富含油脂、蛋白質(zhì)、黃酮、芍藥苷等多種活性成分[1]。牡丹籽粕是牡丹籽經(jīng)壓榨浸出工藝榨油后得到的副產(chǎn)物，含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、維生素、礦物質(zhì)等物質(zhì)[2]，具有抗氧化、抗癌等多種益生功效[3]。牡丹籽粕目前多作為替代氮源用于家畜飼料、植物栽培基質(zhì)的改善[4]，在食品加工中的應(yīng)用有限[5]，作為食品配料，其潛力還有待進(jìn)一步開發(fā)。

豆醬（soybean paste）是中國(guó)傳統(tǒng)調(diào)味品，一般以黃豆、面粉為原料，在自然條件下發(fā)酵而成。在發(fā)酵過程中，微生物能夠?qū)⒃现械拇蠓肿游镔|(zhì)（蛋白質(zhì)、多糖）水解為小分子物質(zhì)，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)更容易吸收，同時(shí)給豆醬帶來多種理化活性，對(duì)人體健康起到促進(jìn)作用[6]。目前也有研究通過在原料中添加營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的食品加工副產(chǎn)物，如醬渣[7]、紫蘇粕[8]、菜籽粕[9]的方式來生產(chǎn)豆醬，不僅豐富了豆醬產(chǎn)品的風(fēng)味、滋味和營(yíng)養(yǎng)組成，而且充分利用了這些副產(chǎn)物中富含的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提高了其應(yīng)用價(jià)值。

鑒于此，本研究在豆醬制曲原料中添加牡丹籽粕，對(duì)制曲過程中的酶活進(jìn)行跟蹤測(cè)定，分析了牡丹籽粕的添加對(duì)曲料酶活的影響，并考察了后酵過程中理化性質(zhì)的變化，為餅粕類資源的開發(fā)利用及新型發(fā)酵豆類調(diào)味品的開發(fā)提供了理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料

牡丹籽粕：低溫液壓壓榨而成，購于山東菏澤谷雨牡丹生物科技有限公司；大豆：濰坊天下糧倉食品有限公司；菌種：米曲霉（Aspergillus oryzae 3.042），天津科技大學(xué)發(fā)酵與新資源實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 試劑

谷胱甘肽（GSH）、兒茶素（分析純）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；L-酪氨酸（分析純）、干酪素（生物試劑）、葡萄糖、福林酚、3，5-二硝基水楊酸（DNS）：北京索萊寶科技有限公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

Model 1680酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；FE28-CN pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；IPP Plus 110培養(yǎng)箱 德國(guó)Memmert公司；ALPHA 2-4 LD Plus真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；5810R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；BF51894C-1馬弗爐 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 方法

1.4.1 牡丹籽粕基本成分的測(cè)定

水分的測(cè)定：參照國(guó)標(biāo)GB/T 10358－2008《油料餅粕 水分及揮發(fā)物含量的測(cè)定》[10]。

灰分的測(cè)定：參照國(guó)標(biāo)GB/T 6438－2007《飼料中粗灰分的測(cè)定》[11]。

脂肪的測(cè)定：參照國(guó)標(biāo)GB 5009.6－2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》[12]。

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：參照國(guó)標(biāo)GB/T 14489.2－2008《糧油檢驗(yàn) 植物油料粗蛋白質(zhì)的測(cè)定》（轉(zhuǎn)換系數(shù)6.25）[13]。

1.4.2 豆醬樣品的制備

牡丹籽粕粉碎后過80目篩，在60 ℃下干燥15 min；脫殼黃豆按照1∶3的固液比加水，浸泡12 h[14]，瀝干水分備用；將面粉、黃豆、牡丹籽粕粉一起放入滅菌鍋中，121 ℃，100 kPa，蒸煮20 min[15]。

待原料降溫到30～40 ℃之間后，將不同比例的黃豆和籽粕（黃豆∶籽粕為0∶10、3∶7、5∶5、7∶3、10∶0）與固定質(zhì)量的面粉進(jìn)行混合，使面粉、籽粕粉均勻地裹在黃豆表面。配制孢子濃度為106～107 spores/mL的米曲霉菌懸液，按照每100 g加入1 mL的比例添加到拌好的黃豆中。將籠屜蓋好蓋子，放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。期間適時(shí)進(jìn)行翻曲并取樣。通過比較曲料酶活確定最終原料配比。

按照最佳原料比例進(jìn)行制曲并設(shè)置對(duì)照組（純黃豆制曲發(fā)酵），收曲后將醬曲分裝到150 mL玻璃瓶中，每個(gè)瓶中裝入60 g醬曲，按照1∶1的比例向每個(gè)瓶中添加濃度為20%的鹽水，放入40 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行后酵，于第0，1，3，5，7，14，21，28，35天取樣，將樣品儲(chǔ)藏于－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 pH值的測(cè)定

稱取研磨好的樣品3.00 g加入燒杯中，再加入20 mL蒸餾水，充分振蕩搖勻后測(cè)定pH值。

1.4.4 粗酶液的提取

參照李秀婷等[16]的方法提取樣品粗酶液，精確稱取5.00 g充分研磨的樣品加入100 mL蒸餾水，在40 ℃下水浴浸提1 h，間歇攪拌，過濾即為粗酶液，用于樣品酶活的測(cè)定。

1.4.5 中性蛋白酶活力的測(cè)定

中性蛋白酶酶活的測(cè)定參照劉文奎[17]的方法并作適當(dāng)修改。中性蛋白酶酶活的定義為在40 ℃、一定pH下，1 mL稀釋后的樣品酶液每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為一個(gè)酶活力單位（U/g）。

1.4.6 淀粉酶活力的測(cè)定

淀粉酶酶活的測(cè)定參照劉婉璐[18]的方法。淀粉酶酶活的定義為1 g樣品在一定條件下，1 h水解可溶性淀粉產(chǎn)生1 μmol麥芽糖為一個(gè)酶活力單位（U/g）。

1.4.7 糖化酶活力的測(cè)定

采用DNS法測(cè)定糖化酶酶活[19]。糖化酶酶活的定義為1 g樣品在一定條件下（pH 4.6，40 ℃），1 h水解可溶性淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖為一個(gè)酶活力單位（U/g）。

1.4.8 還原糖含量的測(cè)定

對(duì)1.4.7中糖化酶活力的測(cè)定方法進(jìn)行適當(dāng)修改即制曲過程中還原糖含量的測(cè)定方法，結(jié)果以樣品干重（g/100 g DW）表示。

1.4.9 水提物的制備

將樣品進(jìn)行真空冷凍干燥處理，用超微粉碎機(jī)粉碎后于－20 ℃儲(chǔ)存。稱取樣品凍干粉1 g，加入10 mL蒸餾水，充分渦旋混勻后超聲處理15 min，置于水浴鍋中沸水浴10 min，在室溫下6 000 r/min離心10 min后，過0.45 μm濾膜，得到的濾液即為樣品水提物，將水提物濃度標(biāo)記為100 mg/mL。

1.4.10 多肽含量的測(cè)定

多肽含量的測(cè)定參照劉婉璐[18]的方法。取15 μL樣品水提物、300 μL OPA試劑（1.25 mL 5%溶于甲醇的鄰苯二甲醛溶液、25 mL 0.1 mol/L四硼酸鈉溶液、2.5 mL 20%十二烷基硫酸鈉、0.25 mL β-巰基乙醇混勻后用蒸餾水定容至50 mL）加入96孔酶標(biāo)板中，渦旋混勻，在室溫下反應(yīng)10 min后用酶標(biāo)儀在340 nm處測(cè)定吸光度。以GSH為標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果表示為g/100 g。

1.4.11 總黃酮含量的測(cè)定

后酵過程中總黃酮的測(cè)定采用氯化鋁比色法[20]。以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品，將總黃酮含量表示為兒茶素當(dāng)量（mg CE/g DW）。

1.4.12 感官評(píng)價(jià)

參照國(guó)標(biāo)GB/T 24399－2009[21]設(shè)置感官評(píng)分表對(duì)樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.4.13 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行（n=3），結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用IBM SPSS Statistics軟件（版本26）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用OriginPro 2023軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹籽粕基本成分

牡丹籽粕基本成分見表2。牡丹籽粕中含有的豐富蛋白質(zhì)可以為微生物的生長(zhǎng)提供充足的氮源。同時(shí)，脂肪和灰分等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也能夠有效改善豆醬的營(yíng)養(yǎng)組成。

2.2 制曲過程中酶活的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

2.2.1 中性蛋白酶酶活的變化

制曲過程中不同原料比例對(duì)中性蛋白酶酶活的影響見圖1。

由圖1可知，隨著牡丹籽粕在原料中添加比例的減小，中性蛋白酶酶活整體上呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，其中黃豆和籽粕的比例為7∶3的樣品在48 h達(dá)到最大酶活，為1 177.85 U/g，接近純黃豆制得的曲料。

2.2.2 淀粉酶酶活的變化

制曲過程中不同原料比例對(duì)淀粉酶酶活的影響見圖2。

由圖2可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，制曲過程中各樣品淀粉酶活力呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中黃豆和籽粕的比例為7∶3的樣品在72 h達(dá)到最大酶活，為686.58 U/g。

2.2.3 糖化酶酶活的變化

由圖3可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，制曲過程中糖化酶酶活總體上呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。添加牡丹籽粕的樣品都在第72 h達(dá)到了最高糖化酶酶活，分別為1 564.36，859.05，906.48，365.85 U/g，其中黃豆和籽粕的比例為7∶3的樣品糖化酶酶活最高。

微生物分泌的酶在發(fā)酵食品的生產(chǎn)中至關(guān)重要，米曲霉酶系種類豐富，蛋白酶能夠?qū)⒃现械拇蠓肿拥鞍踪|(zhì)水解為小分子的肽和氨基酸，為豆醬帶來更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特的風(fēng)味[22]。淀粉酶和糖化酶可將原料中的淀粉水解為葡萄糖，為微生物生長(zhǎng)提供能量并參與美拉德反應(yīng)，改善產(chǎn)品的風(fēng)味和色澤[23-24]。綜合以上醬曲中酶活力的變化，選擇黃豆和籽粕的比例7∶3為最佳原料比例進(jìn)行后酵。

2.3 后酵過程中理化性質(zhì)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

2.3.1 pH值的變化

在后酵過程中樣品pH值的變化見圖4。

由圖4可知，豆醬在后酵期間，曲霉菌分泌的酶能夠?qū)⒃现械奶穷悺⒌鞍踪|(zhì)等物質(zhì)轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸、酸性氨基酸等，因此樣品的pH值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。適量的這些物質(zhì)不僅可以豐富豆醬的口感，而且對(duì)豆醬的長(zhǎng)期儲(chǔ)存有積極作用。

2.3.2 還原糖含量的變化

在后酵過程中樣品還原糖含量的變化見圖5。

由圖5可知，還原糖含量整體上呈現(xiàn)先升高后緩慢降低的趨勢(shì)。還原糖含量在后酵前期迅速升高，這是由于微生物分泌的淀粉酶、糖化酶等水解酶對(duì)淀粉等大分子物質(zhì)的水解作用[25]。而隨著后酵的進(jìn)行，還原糖含量有所下降，這是由于淀粉含量下降導(dǎo)致水解生成的還原糖減少，同時(shí)其參與了羰氨反應(yīng)，并作為碳源為微生物的生長(zhǎng)提供能量而被進(jìn)一步消耗。與黃豆醬相比，添加了牡丹籽粕的豆醬整體上還原糖含量更高。

2.3.3 多肽含量的變化

在后酵過程中樣品多肽含量的變化見圖6。

由圖6可知，樣品在后酵的前7 d多肽含量增加明顯，之后含量基本不再發(fā)生明顯變化，這與劉婉璐[18]在黃豆醬發(fā)酵過程中觀察到的趨勢(shì)相似。多肽是蛋白質(zhì)的酶解產(chǎn)物，其含量在前期迅速升高與蛋白酶酶活密切相關(guān)，而米曲霉在生長(zhǎng)過程中會(huì)分泌中性蛋白酶、酸性蛋白酶和堿性蛋白酶，多種蛋白酶作用使得原料中的蛋白質(zhì)被大量水解，多肽含量迅速增加。隨著后酵過程中pH值的不斷降低，中性蛋白酶、堿性蛋白酶酶活受到抑制，多肽含量不再發(fā)生明顯變化。

2.3.4 總黃酮含量的變化

在后酵過程中樣品總黃酮含量的變化見圖7。

由圖7可知，后酵的前7 d各樣品的總黃酮含量變化幅度較小，而在第7～35天，牡丹籽粕發(fā)酵豆醬的總黃酮含量總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)并且最終含量（1.93 mg CE/g DW）高于黃豆樣品（0.89 mg CE/g DW）?？傸S酮是發(fā)酵豆醬中的重要活性物質(zhì)，研究表明，豆制品發(fā)酵過程中大豆苷在微生物的代謝作用下被分解為大豆苷元、黃豆黃素等，這可能是總黃酮含量升高的原因[26]。

2.3.5 感官品質(zhì)分析

牡丹籽粕豆醬感官評(píng)分見圖8。

由圖8可知，相比于傳統(tǒng)釀造黃豆醬，除了滋味和色澤相近外，牡丹籽粕發(fā)酵豆醬的醬香風(fēng)味更加濃郁，且有特殊酯香，整體接受度更好。

3 結(jié)論

本研究考察了牡丹籽粕的添加對(duì)曲料酶活和發(fā)酵過程中豆醬理化性質(zhì)的影響，以酶活為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定豆醬制曲原料中黃豆和籽粕的比例為7∶3，所得曲料具有良好的中性蛋白酶、糖化酶和淀粉酶活力；經(jīng)后酵，產(chǎn)品中多肽含量與黃豆醬中接近，還原糖和總黃酮含量更高，風(fēng)味獨(dú)特，整體接受度高，為開發(fā)營(yíng)養(yǎng)更豐富的新型調(diào)味品及牡丹籽粕資源在食品產(chǎn)業(yè)中的綜合利用提供了借鑒意義。

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收稿日期：2023-07-09

基金項(xiàng)目：天津市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（16JCYBJC23200）

作者簡(jiǎn)介：付瑋琦（1996-），男，碩士，研究方向：發(fā)酵食品功能活性評(píng)價(jià)。

*通信作者：李風(fēng)娟（1983-），女，副研究員，博士，研究方向：食品生物活性成分功能性評(píng)價(jià)。