基于數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的淫羊藿保健品組方規(guī)律及主要保健功能研究

劉永銘，劉樹森，熊軼喆，沈知彼，王 翔，齊卓操，詹紅生*，杜國慶*

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 石氏傷科醫(yī)學(xué)中心，上海 201203

2.上海市中醫(yī)藥研究院骨傷科研究所，上海 201203

3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076

4.上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，上海 201203

淫羊藿又名“仙靈脾”，為小檗科淫羊藿屬EpimediumLinn.植物，可用于保健食品的物品[1]，性溫，味辛、甘，歸肝、腎經(jīng)，具有補腎陽、強筋骨、祛風(fēng)濕的功效[2]。淫羊藿中主要的化學(xué)成分包括黃酮類、木脂素類、多糖類、生物堿類、苯酚苷類、揮發(fā)油類、色原酮、蒽醌、鞣質(zhì)、倍半萜、甾醇等[3]。淫羊藿的現(xiàn)代藥理學(xué)研究主要集中在免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、生殖功能等方面，發(fā)現(xiàn)淫羊藿及其主要成分在增強免疫功能、抗氧化、抗衰老、保護心腦血管、抑制破骨細(xì)胞、促進成骨細(xì)胞生長等方面有顯著作用[4-10]。在淫羊藿保健食品的研究中，發(fā)現(xiàn)其具有增強免疫力和緩解體力疲勞的功能[11]。同時研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿在增強骨密度的保健食品中占據(jù)重要地位[12]。

近年來，國家出臺一系列的政策法規(guī)，對保健食品進行了系統(tǒng)化規(guī)范，促進保健食品市場良性發(fā)展。為了更加明確地解析淫羊藿保健品組方規(guī)律，探究淫羊藿保健功能的作用機制，本研究以含淫羊藿的保健食品為研究對象，運用數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)研究含淫羊藿保健食品的組方規(guī)律及其主要保健功能的作用機制，以期為淫羊藿相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)提供理論依據(jù)與參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源及檢索方法

本研究以“淫羊藿”“仙靈脾”為檢索詞，檢索國家市場監(jiān)督管理總局特殊食品信息查詢平臺（http://ypzsx.gsxt.gov.cn/specialfood/#/food）及藥智網(wǎng)（https://db.yaozh.com/），檢索截至?xí)r間為2023 年12 月25 日。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①明確保健功能的保健食品；②保健功能符合《允許保健食品聲稱的保健功能目錄非營養(yǎng)素補充劑（2023 年版）》（https://www.samr.gov.cn/zw/zfxxgk/fdzdgknr/tssps/aar/2023/art_491d5c9de75e425c8cd0203027af1d93.html）；③明確主要原料的保健食品；④同一產(chǎn)品，不同劑型，納入1 條，保留不同劑型；⑤同一產(chǎn)品，不同濃度，納入1 條；⑥重復(fù)注冊的保健食品，納入最后注冊數(shù)據(jù)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①未明確保健功能的保健食品；②未明確適宜人群的保健食品。

1.3 數(shù)據(jù)規(guī)范化

①保健功能參考《允許保健食品聲稱的保健功能目錄非營養(yǎng)素補充劑（2023 年版）》進行規(guī)范，如“抗疲勞”“本品經(jīng)動物實驗評價，具有緩解體力疲勞保健功能”統(tǒng)一歸類為“緩解體力疲勞”，“免疫調(diào)節(jié)”“增強免疫力”統(tǒng)一歸類為“有助于增強免疫力”。②原料提取物統(tǒng)一規(guī)范為中藥原料，參考《中國藥典》2020 年版及《中華本草》對中藥名稱、功效、性味歸經(jīng)、劑型進行規(guī)范，如“淫羊藿提取物”“仙靈脾”統(tǒng)一規(guī)范為“淫羊藿”，“淮山藥”統(tǒng)一規(guī)范為“山藥”。③剔除配方中的輔料及化學(xué)成分，如“硫酸軟骨素鈉”“氨基葡萄糖鹽酸鹽”“葡萄糖酸鋅”。④參考常見不適宜人群，進行不適宜人群數(shù)據(jù)規(guī)范，如“未成年”統(tǒng)一規(guī)范為“少年兒童”，“妊娠期婦女”統(tǒng)一規(guī)范為“孕婦”。

1.4 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

采取雙人背靠背獨立錄入方法，且雙人背靠背核對后，參考數(shù)據(jù)規(guī)范化原則對數(shù)據(jù)進行規(guī)范，分別將產(chǎn)品名稱、注冊年份、劑型、主要原料、保健功能、適宜人群、不適宜人群統(tǒng)一錄入IBM SPSS Statistics 23.0、中醫(yī)傳承計算平臺V3.5，由第3 人進行數(shù)據(jù)的整合和處理，確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，形成含淫羊藿的保健食品數(shù)據(jù)庫。

1.5 組方規(guī)律分析

①采用中醫(yī)傳承計算平臺V3.5 軟件中的中藥分析模塊，對中藥頻次、功效、四氣、五味、歸經(jīng)進行分析；使用方劑分析模塊，進行組方規(guī)律分析。②采用IBM SPSS Statistics 23.0 分析劑型、保健功能、適宜人群與不適宜人群。

1.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.6.1 淫羊藿活性成分及靶點的收集與篩選 以“淫羊藿”為關(guān)鍵詞，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、SymMap 數(shù)據(jù)庫（http://www.symmap.org/）、TCMID 數(shù)據(jù)庫（https://bidd.group/TCMID/）、HERB 數(shù)據(jù)庫（http://herb.ac.cn/）、ETCM 數(shù)據(jù)庫（http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/）、HIT 數(shù)據(jù)庫（http://hit2.badd-cao.net/）、TCMIP數(shù)據(jù)庫（http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/）中檢索收集淫羊藿的化學(xué)成分和作用靶點信息，在中國知網(wǎng)、PubMed 等網(wǎng)站檢索淫羊藿相關(guān)文獻補充上述數(shù)據(jù)庫未收錄的化學(xué)成分和作用靶點信息。刪除重復(fù)的化學(xué)成分，收錄不完整的信息通過化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫（https://organchem.csdb.cn）和PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）進行補充。使用SwissTargetPrediction 平臺（http://www.Swisstargetprediction.ch/）獲取淫羊藿活性成分的作用靶點，整理刪除重復(fù)靶點后，通過 Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）獲得標(biāo)準(zhǔn)化基因名。

1.6.2 保健功能潛在靶點的篩選 以“1.5”項數(shù)據(jù)挖掘研究得到的最主要的保健功能作為關(guān)鍵詞，分別在 GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、PathCards 數(shù)據(jù)庫（https://pathcards.genecards.org/）、DrugBank 數(shù)據(jù)庫（https://go.drugbank.com/）檢索與保健功能相關(guān)的疾病蛋白靶點。將上述數(shù)據(jù)庫中收集到的靶點合并去重后，通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫獲得標(biāo)準(zhǔn)化基因名，作為保健功能潛在靶點。

1.6.3 淫羊藿保健功能關(guān)鍵靶點的獲取 將淫羊藿活性成分潛在靶點與保健功能潛在靶點取交集獲得共同靶點，作為淫羊藿保健功能的關(guān)鍵靶點。使用R 語言的VennDiagram 軟件包[13]繪制韋恩圖，獲得淫羊藿保健功能交集靶點圖。

1.6.4 蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選 將淫羊藿保健功能關(guān)鍵靶點基因?qū)隨TRING 網(wǎng)站（https://cn.stringdb.org/），選擇蛋白種類為“homo sapiens”，設(shè)置required score 為medium confidence（0.400），并去除游離節(jié)點，在線預(yù)測各基因間的相互關(guān)系。使用Cytoscape 3.10.0 軟件中的CytoHubba 插件[14]對PPI網(wǎng)絡(luò)進行可視化，然后根據(jù)度（degree）值大小篩選核心靶點。

1.6.5 基因本體（gene ontology，GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路富集分析 使用R 語言的clusterProfiler[15]軟件包，對淫羊藿保健功能關(guān)鍵靶點基因分別進行 GO 生物學(xué)過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞成分（cellular component，CC）分析和KEGG 信號通路富集分析，借助ggplot2 軟件包[16]進行可視化處理。

1.6.6 分子對接驗證 結(jié)合實驗結(jié)果并參考現(xiàn)有文獻，選取淫羊藿中含量最高和最主要的成分，從PubChem 數(shù)據(jù)庫（ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound）中下載相應(yīng)的sdf 格式文件。從PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）和Uniprot 數(shù)據(jù)庫（http://www.uni-prot.org/）下載核心靶點的高解析精度（＜0.250 nm）蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)；通過去除原始配體、去除水分子、分離蛋白質(zhì)、添加氫原子對蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化。將篩選的關(guān)鍵成分和核心靶點信息輸入AutoDock Vina 2.0（美國加州分子生物學(xué)斯克里普斯研究所）軟件，進行分子對接，結(jié)合能負(fù)值越大，對接構(gòu)象越穩(wěn)定，自發(fā)結(jié)合能力越強。

2 結(jié)果

通過檢索共得到553 種含淫羊藿的保健食品，其中國產(chǎn)保健食品544 種，進口保健食品9種；根據(jù)納入與排除標(biāo)準(zhǔn)，剔除重復(fù)注冊35 種，未明確保健功能3 種，未明確適宜人群4 種，同一廠家不同濃度相同劑型1 種，同一廠家同一產(chǎn)品不同劑型9 種，共計501 種保健食品納入統(tǒng)計分析，其中劑型共計510 種，主要原料單獨為淫羊藿的17 種。

2.1 中藥頻次及藥性統(tǒng)計分析

納入的501 種保健食品涉及116 種中藥原料，共計頻次為2 341 次，使用頻次≥40 次的分別為淫羊藿（501 次）、枸杞子（255 次）、人參（159 次）、西洋參（118 次）、鹿茸（104 次）、黃芪（92 次）、黃精（80 次）、山藥（58 次）、紅景天（48 次）、骨碎補（44 次）、杜仲（42 次）、茯苓（42 次）、刺五加（40 次）。將使用頻次大于20 次的中藥作為高頻原料，共計26 味，具體結(jié)果見表1。

表1 含淫羊藿的保健食品配方中原料頻數(shù)統(tǒng)計 (頻次＞20)Table 1 Frequency statistics of raw materials in health foods containing Epimedii Folium (frequency > 20)

中藥功效分類包括補虛藥（1 893 次）、收澀藥（83 次）、活血化瘀藥（83 次）、利水滲濕藥（50 次）、安神藥（35 次）、溫里藥（34 次）、解表藥（31 次）、平肝熄風(fēng)藥（30 次）、清熱藥（20 次）、止血藥（15次）、消食藥（11 次）、祛風(fēng)濕藥（11 次）、理氣藥（10次）、化濕藥（7 次）、化痰止咳平喘藥（3 次）、瀉下藥（3 次），共計16 個種類。四氣以溫（1 342 次）、平（644 次）為主；五味以甘（2 052 次）、苦（736次）為主；歸經(jīng)以腎經(jīng)（1 860 次）、肝經(jīng)（1 401 次）、肺經(jīng)（837 次）為主，具體見圖1。

圖1 含淫羊藿的保健食品配方中原料四氣、五味、歸經(jīng)雷達圖Fig.1 Radar plot of four qi, five flavors, meridian distribution of raw materials in health foods containing Epimedii Folium

2.2 劑型

納入的含淫羊藿的保健食品中，涉及9 種劑型，以膠囊（291 次）、酒劑（89 次）為主，也包括片劑（69 次）、口服溶液（30 次）、茶劑（11 次）、顆粒（10次）、丸劑（6 次）、煎膏（2 次）、散劑（2 次）。

2.3 保健功能

納入的501 種保健食品各保健功能出現(xiàn)的頻次共計618 次，其中頻次≥80 的分別為緩解體力疲勞（343 次）、有助于增強免疫力（140 次）、有助于改善骨密度（87 次），具體見圖2。

圖2 含淫羊藿的保健食品的保健功能頻數(shù)統(tǒng)計Fig.2 Frequency statistics of health-care functions of health foods containing Epimedii Folium

2.4 適宜人群與不適宜人群

納入的501 種保健食品適宜人群累計618 次，包括易疲勞者（343 次）、免疫力低下者（140 次）、中老年人（112 次）、睡眠狀況不佳者（7 次）、處于缺氧環(huán)境者（6 次）、有黃褐斑者（3 次）、需改善記憶者（2 次）、有化學(xué)性肝損傷危險者（2 次）、營養(yǎng)性貧血者（1 次）、血脂偏高者（1 次）、缺鐵性貧血者（1 次）。不適宜人群累計1 433 次，包括少年兒童（501 次）、孕婦（412 次）、乳母（366 次）、酒精過敏者（49 次）、肝腎功能不全者（23 次）、心腦血管疾病患者（22 次）、婦科腫瘤患者（11 次）、有婦科腫瘤家族病史者（11 次）、慢性腹瀉者（9 次）、肝病家族史者（6 次）、月經(jīng)過多者（5 次）、蜂產(chǎn)品過敏者（3 次）、糖尿病患者（2 次）、婦女（2 次）、過敏體質(zhì)者（2 次）、花粉過敏者（2 次）、月經(jīng)期婦女（2 次）、失眠者（1 次）、腎功能不全者（1 次）、食用真菌過敏者（1 次）、有出血傾向者（1 次）、異體蛋白過敏者（1 次）。

2.5 含淫羊藿的保健食品及不同保健功能的保健食品中核心原料組合

因單味淫羊藿不具有分析價值，故剔除單味淫羊藿組成的保健食品，共納入484 種含淫羊藿保健食品。使用中醫(yī)傳承計算平臺V3.5 方劑分析-關(guān)聯(lián)規(guī)則模塊，設(shè)置支持度為48、置信度為0.7，進行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，見表2；同時使用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)淠K繪制原料關(guān)系圖，見圖3-a。其中，緩解體力疲勞的保健食品共計335 種，使用中醫(yī)傳承計算平臺V3.5 方劑分析-關(guān)聯(lián)規(guī)則模塊，設(shè)置支持度為45，置信度為0.65，進行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，見表2；同時使用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)淠K繪制原料關(guān)系圖，見圖3-b。有助于增強免疫力的保健食品共計137 種，使用中醫(yī)傳承計算平臺V3.5 方劑分析-關(guān)聯(lián)規(guī)則模塊，設(shè)置支持度為10，置信度為0.75，進行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，見表2；同時使用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)淠K繪制藥物關(guān)系圖，見圖3-c。有助于改善骨密度的保健食品共計80 種，使用中醫(yī)傳承計算平臺V3.5 方劑分析-關(guān)聯(lián)規(guī)則模塊，設(shè)置支持度為10，置信度為1，進行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，見表2；同時使用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)淠K繪制藥物關(guān)系圖，見圖3-d。

圖3 含淫羊藿的保健食品 (a) 及其不同保健功能緩解體力疲勞 (b)、有助于增強免疫力 (c)、有助于改善骨密度 (d) 的保健食品中高頻原料關(guān)系網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Network relationship of high-frequency raw materials in health foods containing Epimedii Folium (a) and health foods with different health functions to relieve physical fatigue (b), enhance immunity (c), improve bone density (d)

表2 含淫羊藿的保健食品及其不同保健功能的保健食品中高頻原料關(guān)聯(lián)規(guī)則分析Table 2 Analysis of association rules of high-frequency raw materials in health foods containing Epimedii Folium and health foods with different health functions

2.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果

2.6.1 淫羊藿活性成分及靶基因的收集與篩選 通過各數(shù)據(jù)庫及檢索到的淫羊藿相關(guān)文獻，共收集到淫羊藿相關(guān)化學(xué)成分205 個，去除不規(guī)范名稱、SwissTargetPrediction 平臺無法識別信息的數(shù)據(jù)后，得到139 個淫羊藿有效成分，并且獲得淫羊藿有效成分的預(yù)測靶標(biāo)1 677 個。

2.6.2 保健功能潛在靶點的篩選 上述“2.3”項中得到的保健功能中頻次排名前3 位的是緩解體力疲勞（343 次）、有助于增強免疫力（140 次）、有助于改善骨密度（87 次）?？紤]到其他的保健功能頻次均小于平均值51.5 次，故本研究選擇淫羊藿保健功能中頻次排名前3 位的保健功能進行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究。在GeneCards 數(shù)據(jù)庫、PathCards 數(shù)據(jù)庫及DrugBank 數(shù)據(jù)庫中分別檢索體力疲勞、免疫力、骨質(zhì)疏松相關(guān)靶點，然后去除重復(fù)靶點，通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)化靶點的基因名，獲得體力疲勞相關(guān)的潛在靶點849 個，獲得免疫力相關(guān)的潛在靶點2 076 個，獲得骨質(zhì)疏松相關(guān)的潛在靶點1 440 個。

2.6.3 關(guān)鍵靶基因篩選和PPI 網(wǎng)絡(luò)分析 將淫羊藿靶基因與體力疲勞、免疫力和骨質(zhì)疏松相關(guān)靶基因取交集，繪制Venn 圖，見圖4。獲得淫羊藿緩解體力疲勞的關(guān)鍵靶點227 個，獲得淫羊藿增強免疫力的關(guān)鍵靶點358 個，獲得淫羊藿改善骨密度的關(guān)鍵靶點332 個。采用淫羊藿緩解體力疲勞的227 個靶點構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，共有219 個節(jié)點和3 307 條邊，見圖5-a；采用淫羊藿有助于增強免疫力的358 個靶點構(gòu)建的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，共有357 個節(jié)點和8 699條邊，見圖5-b；采用淫羊藿改善骨密度的332 個共同靶點構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，共有328 個節(jié)點和7 573條邊，見圖5-c。針對上述3 個PPI 網(wǎng)絡(luò)，通過Cytoscape 軟件的中的cytoHubba 插件進行拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)篩選，以度值排序得到淫羊藿緩解體力疲勞的10 個核心靶點，分別為白蛋白（albumin，ALB）、細(xì)胞腫瘤抗原p53（cellular tumor antigen p53，TP53）、胰島素（insulin，INS）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL6）、β-連環(huán)蛋白1（catenin beta-1，CTNNB1）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1 beta，IL1B）；淫羊藿增強免疫力的10 個核心靶點，分別為蛋白激酶B1（protein kinase B1，AKT1）、TNF、IL6、TP53、STAT3、IL1B、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src，SRC）、絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、T 細(xì)胞表面糖蛋白CD4（T-cell surface glycoprotein CD4，CD4）、轉(zhuǎn)錄因子Jun（transcription factor Jun，JUN）；淫羊藿改善骨密度的10 個核心靶點，分別為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、AKT1、INS、ALB、IL6、TNF、TP53、VEGFA、IL1B、STAT3。

圖4 淫羊藿與體力疲勞、免疫力、骨質(zhì)疏松相關(guān)靶基因的交集基因的Venn 圖Fig.4 Venn diagram of intersection genes of target genes related to physical fatigue, immunity, osteoporosis and Epimedii Folium

2.6.4 關(guān)鍵靶點基因GO 功能及KEGG 通路富集分析 在GO 富集分析結(jié)果中，淫羊藿緩解體力疲勞從BP 方面得到2 796 個條目，主要富集在激酶活性的正向調(diào)節(jié)（positive regulation of kinase activity）、對缺氧的反應(yīng)（response to hypoxia）、對異生物刺激的反應(yīng)（response to xenobiotic stimulus）等方面；在MF 方面得到249 個條目，涉及蛋白絲氨酸/ 蘇氨酸/ 酪氨酸激酶活性（ protein serine/threonine/tyrosine kinase activity）、蛋白酪氨酸激酶活性（protein tyrosine kinase activity）、細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）等方面；在CC 中得到126 個條目，涉及到膜筏（membrane raft）、膜微域（membrane microdomain）、囊泡腔（vesicle lumen）等；各功能結(jié)果按照排序選取前10條，具體見圖6-a；淫羊藿增強免疫力從BP 方面得到2 931 個條目，主要富集在細(xì)胞因子產(chǎn)生的正調(diào)控（positive regulation of cytokine production）、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)（response to molecule of bacterial origin）、對脂多糖的反應(yīng)（response to lipopolysaccharide）等方面；在MF 方面得到241個條目，涉及蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）、蛋白質(zhì)絲氨酸/ 蘇氨酸激酶活性（ protein serine/threonine kinase activity）等方面；在CC 中得到119 個條目，涉及到囊泡腔、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔（cytoplasmic vesicle lumen）、分泌顆粒腔（secretory granule lumen）等；各功能結(jié)果按照排序選取前10條，具體見圖6-b；淫羊藿改善骨密度從BP 方面得到3 462 個條目，主要富集在肽的反應(yīng)（response to peptide）、細(xì)胞外刺激的反應(yīng)（response to extracellular stimulus）、營養(yǎng)水平的反應(yīng)（response to nutrient levels）等方面；在MF 方面得到325個條目，涉及蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性（protein tyrosine kinase activity）、受體配體活性（receptor ligand activity）等方面；在CC 中得到140 個條目，涉及到膜筏、膜微域（membrane microdomain）、洞穴（caveola）等；各功能結(jié)果按照排序選取前10條，具體見圖6-c。

圖6 淫羊藿緩解體力疲勞 (a)，有助于增強免疫力 (b)，有助于改善骨密度 (c) 關(guān)鍵靶點GO 富集分析 (前10)Fig.6 GO enrichment analysis (top 10) of key targets for Epimedii Folium relieves physical fatigue (a), helps enhance immunity (b), and helps improve bone density (c)

對淫羊藿緩解體力疲勞、增強免疫力、提高骨密度的關(guān)鍵靶點基因進行KEGG 通路分析，分別得到177 條、192 條和188 條KEGG 通路；去除如癌癥中的蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）、前列腺癌（prostate cancer）、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis）、糖尿病并發(fā)癥中晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體（advanced glycation endproduct-receptor of advanced glycation endproduct，AGE-RAGE）信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、乙型肝炎（hepatitis B）等與淫羊藿緩解體力疲勞、增強免疫力、提高骨密度不相關(guān)的通路。排序前30 的核心通路如圖7 所示。

圖7 淫羊藿緩解體力疲勞 (a)，有助于增強免疫力 (b)，有助于改善骨密度 (c) 關(guān)鍵靶點KEGG 通路富集分析 (前30)Fig.7 KEGG pathway enrichment analysis (top 30) of key targets for Epimedii Folium relieves physical fatigue (a), helps enhance immunity (b), and helps improve bone density (c)

2.7 分子對接驗證結(jié)果

根據(jù)文獻檢索與數(shù)據(jù)庫的整理結(jié)果，參考《中國藥典》2020 年版，選擇淫羊藿定量指標(biāo)的4 個成分朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷作為淫羊藿關(guān)鍵成分[2]。采用分子對接技術(shù)對淫羊藿關(guān)鍵成分與淫羊藿緩解體力疲勞、增強免疫力、改善骨密度的排名前5 的核心靶點（合并重復(fù)靶點后ALB、TP53、INS、TNF、GAPDH、AKT1、IL6、STAT3）的結(jié)合情況進行驗證。如圖8 所示，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷與核心靶點親和力較好，能自發(fā)結(jié)合。在最佳模式下，淫羊藿關(guān)鍵成分與核心靶點的結(jié)合能見表3。

圖8 淫羊藿關(guān)鍵成分與核心靶點分子對接熱圖Fig.8 Molecular docking heat map of key components in Epimedii Folium and core targets

表3 淫羊藿關(guān)鍵成分與核心靶點的結(jié)合能Table 3 Binding energy between key components of Epimedii Folium and core target points

3 討論

本研究納入統(tǒng)計的501 種含淫羊藿的保健食品中，有17 種是單獨使用淫羊藿作為主要原料的保健品，其余的保健食品中中藥原料中以補虛藥、收澀藥和活血化瘀藥為主；藥性以溫、平為主；藥味以甘、苦為主，歸經(jīng)以腎、肝、肺經(jīng)為主。含淫羊藿的保健食品的保健功能排名前3 分別為緩解體力疲勞、有助于增強免疫力、有助于改善骨密度。基于中醫(yī)基礎(chǔ)理論，上述適應(yīng)證均以虛證居多，補虛藥屬于對癥治療。相關(guān)代謝組學(xué)研究表明，補虛藥可能通過調(diào)節(jié)機體能量代謝穩(wěn)態(tài)，從而產(chǎn)生補虛的作用[17]。

淫羊藿的保健食品中劑型以膠囊、酒劑為主。由于該類產(chǎn)品的主功效成分大多是主要原料的總提取物或者總多糖，遇濕熱不穩(wěn)定，故選擇密封嚴(yán)密、用量精確、生物利用度高的膠囊劑型，便于使用者服用及吸收[18]。中醫(yī)認(rèn)為，酒性溫，味甘、苦、辛，與藥結(jié)合引藥入經(jīng)，具有通經(jīng)活絡(luò)、溫補陽氣、祛寒止痛等功效，淫羊藿與酒配伍相得益彰，有助于其發(fā)揮補腎陽、強筋骨、祛風(fēng)濕的功效[19]。不適宜人群中，少年兒童的比例達到100%，因淫羊藿其有效成分淫羊藿苷有性激素樣作用，故不建議少年兒童服用相關(guān)保健食品，避免性早熟等一系列并發(fā)癥[20-21]。

中醫(yī)認(rèn)為，體力疲勞、免疫力下降均屬于“虛”“虛勞”“虛損”的范疇，疲勞的產(chǎn)生與氣、血、陰、陽的損傷有關(guān)，五臟六腑均受影響，故治療應(yīng)整體辨證論治，以氣血為綱、調(diào)和陰陽為主[22]。從藥物關(guān)聯(lián)看，含淫羊藿“緩解體力疲勞”“有助于增強免疫力”的保健食品中常用中藥組合均含有淫羊藿、枸杞子、西洋參、人參、鹿茸、黃芪、黃精、山藥，以上中藥均為高頻中藥，可歸屬為補虛藥[23]。枸杞子滋補肝腎、益精明目；西洋參補氣養(yǎng)陰、清熱生津；黃精補氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎；山藥補脾養(yǎng)胃、生津益肺、補腎澀精，5 味中藥均屬補陰藥，具有益氣健脾、補益肝腎、補氣養(yǎng)陰的功效。淫羊藿補腎陽、強筋骨、祛風(fēng)濕；人參大補元氣、復(fù)脈固脫、補脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智；鹿茸壯腎陽、益精血、強筋骨、調(diào)沖任、托瘡毒，3 味中藥均屬補陽藥，具有補腎強筋、溫陽補血的功效。上述8 味中藥配伍符合中醫(yī)治療體力疲勞的治則，故根據(jù)患者不同體質(zhì)進行保健食品選用，有助于提高保健食品的有效率及價值。

中醫(yī)認(rèn)為“骨密度降低”歸屬為“骨痿”“骨痹”“骨枯”等范疇，以腎精虧虛、骨枯髓減為本，以瘀血痹阻、骨絡(luò)失榮為標(biāo)，治則以補益氣血、調(diào)和陰陽、祛瘀生新為主[24]。從藥物關(guān)聯(lián)看，含淫羊藿的“有助于改善骨密度”的保健食品中常用中藥組合為淫羊藿、骨碎補、杜仲、補骨脂、丹參。淫羊藿、骨碎補、杜仲、補骨脂均屬于補腎中藥，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)補腎中藥主要通過骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein-smads pathway，BMP）-Smads 通路、Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號通路、MAPK、PI3K/AKT 等信號通路，促進成骨細(xì)胞的骨形成作用；通過骨保護素/核因子-κB 配體受體活化因子/核因子-κB 受體活化因子（osteoprotegerin/receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand/receptor activator of nuclear factor-kappaB，OPG/RANKL/RANK）信號通路、雌激素、胰蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）通路等信號通路抑制破骨細(xì)胞的骨吸收作用，達到治療骨質(zhì)疏松癥的目的[25]。丹參屬于活血化瘀中藥，近年來研究發(fā)現(xiàn)丹參及其主要有效成分能抗骨質(zhì)疏松、促進骨形成、促進間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化，具有促進骨折愈合、促進成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞增殖、抑制破骨細(xì)胞和抗骨組織無機元素代謝紊亂的作用[26]。5藥配伍，共奏活血化瘀、補益肝腎功效，促進體內(nèi)骨代謝達到平衡狀態(tài)。

本研究通過檢索各數(shù)據(jù)庫及淫羊藿相關(guān)文獻獲得淫羊藿化學(xué)成分205 個，其中有效成分139 個及靶基因1 677 個。另外，從GeneCards 數(shù)據(jù)庫、PathCards 數(shù)據(jù)庫及DrugBank 數(shù)據(jù)庫中篩選體力疲勞相關(guān)的潛在靶點849 個，免疫力相關(guān)的潛在靶點2 076 個，骨質(zhì)疏松相關(guān)的潛在靶點1 440 個；通過淫羊藿和體力疲勞、免疫力、和骨質(zhì)疏松相關(guān)共同靶基因Venn 圖分析，獲得淫羊藿緩解體力疲勞的關(guān)鍵靶點227 個，增強免疫力的關(guān)鍵靶點358 個，改善骨密度的關(guān)鍵靶點332 個；依據(jù)PPI 網(wǎng)絡(luò)的度值排序，淫羊藿緩解體力疲勞的10 個核心靶點為ALB、TP53、INS、TNF、IL6、CTNNB1、EGFR、VEGFA、STAT3、IL1B；增強免疫力的10 個核心靶點為AKT1、TNF、IL6、TP53、STAT3、IL1B、SRC、MAPK3、CD4、JUN；改善骨密度的10 個核心靶點為GAPDH、AKT1、INS、ALB、IL6、TNF、TP53、VEGFA、IL1B、STAT3。同時，獲得淫羊藿緩解體力疲勞的關(guān)鍵靶點在3 171 個GO 條目和177 條KEGG 通路中顯著富集（P＜0.05）；增強免疫力的關(guān)鍵靶點在3 291 個GO 條目和192 條KEGG 通路中顯著富集（P＜0.05）；改善骨密度的關(guān)鍵靶點在3 927 個GO 條目和188 條KEGG 通路中顯著富集（P＜0.05）。

已有研究證明，淫羊藿的醇提物能顯著提高羥甲基戊二酰輔酶A 蛋白（hydroxymethylglutaryl-CoA protein，HMG-CoA）和致類固醇急性調(diào)節(jié)蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，STAR）的相對表達水平，從而影響大鼠內(nèi)源性膽固醇合成和睪酮合成，提高身體的運動能力，緩解體力疲勞[27]。淫羊藿中多糖類成分也具有多種藥理活性，包括抗疲勞、免疫增強和抗骨質(zhì)疏松等方面[28-31]。同時，多項研究表明淫羊藿及其提取物均有延長小鼠負(fù)重游泳時間、降低小鼠運動后血清尿素氮水平、降低小鼠運動后血乳酸水平、升高小鼠肝糖原含量的作用[32-37]。淫羊藿黃酮能顯著降低疲勞小鼠血清中肌酐和尿素氮含量，顯著抑制小鼠肝組織丙二醛（malonaldehyde，MDA）的產(chǎn)生，起到抗疲勞的作用[38-39]。

對于淫羊藿增強免疫力方面，研究表明淫羊藿苷及其代謝物能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能和炎癥因子的釋放，并修復(fù)異常的信號通路[5]；淫羊藿苷具有抗炎作用，對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、支氣管哮喘、多發(fā)性硬化癥和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病有一定應(yīng)用價值，此外，淫羊藿苷還參與調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞、及核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶-p38-c-Jun N 端激酶（extracellular signal-regulated kinase-p38-c-junN-terminal kinase，ERK-p38-JNK）等信號通路發(fā)揮增強免疫的作用[40]。也有研究證實了淫羊藿多糖和黃酮類成分具有良好的免疫增強的活性[41-42]。

對于淫羊藿改善骨密度治療骨質(zhì)疏松癥方面，有大量研究證實淫羊藿黃酮類化合物可以作用于間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞系中的雌激素信號傳導(dǎo)和其他骨形態(tài)發(fā)生途徑，可對雌激素缺乏或其他原因?qū)е碌墓琴|(zhì)疏松癥有改善作用[7,43-47]；淫羊藿類中成藥能有效治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松[48]。

分子對接結(jié)果也證明，淫羊藿的關(guān)鍵成分朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷可與核心靶點自發(fā)結(jié)合且結(jié)合良好。由于淫羊藿的新成分和新靶點仍在不斷被報道，擴展數(shù)據(jù)分析范圍并完善計算機算法顯得尤為重要；免疫力作為一個廣泛的概念，本研究的數(shù)據(jù)收集整理較少，樣本量稍顯不足，今后將進一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究利用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，分析了含淫羊藿的保健食品中相關(guān)中藥頻次、功效、四氣、五味、歸經(jīng)、劑型和不同保健功能的保健食品中常用原料的組合，為淫羊藿后續(xù)保健食品的研發(fā)提供思路。同時進行了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接研究，初步揭示淫羊藿主要保健功能的潛在靶點與機制通路，為淫羊藿后續(xù)保健食品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突