澤瀉提取物改善游離脂肪酸誘導(dǎo)的HepG2 脂肪變性細(xì)胞模型的脂質(zhì)代謝及氧化應(yīng)激異常

謝 燕，李貴平，段月陽，李 良，呂耀中，溫建輝，曹 亮，李 旭，楊 昊,4*，肖 偉,4，王振中,3*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023

2.中藥制藥過程控制與智能制造技術(shù)全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001

3.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001

4.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，上海 201203

非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種以肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過度沉積為主要病理特征的代謝紊亂性疾病[1-2]。NAFLD 的高危因素包括不良生活習(xí)慣、肥胖、糖尿病和不合理膳食結(jié)構(gòu)等[3]。近幾十年來隨著亞洲地區(qū)經(jīng)濟(jì)的快速增長和城市化推動，導(dǎo)致其患病率隨著飲食和生活方式的變化不斷增加。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國NAFLD的成人患病率為29%，為4 年前患病率的2 倍[4]。NAFLD 的晚期形式為非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH），并可進(jìn)一步發(fā)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌。目前NAFLD 的治療手段僅限于生活方式的改變，臨床尚未有獲批的上市治療藥物和方法[5-6]。

NAFLD 是一種由胰島素抵抗、脂毒性和氧化應(yīng)激等多種因素共同導(dǎo)致的疾病，對其所涉及的機(jī)制尚不明確[7]。過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα）是調(diào)節(jié)糖脂代謝和能量代謝的關(guān)鍵受體[8]，大量研究發(fā)現(xiàn)其與NAFLD 疾病進(jìn)展相關(guān)，NAFLD 患者肝臟中PPARα 蛋白表達(dá)水平和活性下降，下降程度與疾病嚴(yán)重程度和內(nèi)臟脂肪蓄積量顯著正相關(guān)[9]，肝臟PPARα 特異性敲除的模型小鼠在高脂誘導(dǎo)后肝臟炎癥和血清中總膽固醇（total cholesterol，TC）含量較對照組小鼠明顯增加[10]。雙重PPARα/γ 激動劑Saroglitazar 在NAFLD/NASH 受試者治療中顯示可減少肝細(xì)胞脂肪變性，改善胰島素抵抗和肝酶水平異常，從而減少肝損傷[11]。PPARα 或是NAFLD 治療的潛在靶點(diǎn)。

當(dāng)前臨床上越來越多地將中醫(yī)藥作為補(bǔ)充及替代療法對NAFLD 進(jìn)行干預(yù)[12-13]。澤瀉作為臨床常用藥，在傳統(tǒng)中醫(yī)中有著悠久的應(yīng)用歷史，其性寒味甘，具有利水滲濕、化濁調(diào)脂和去痰飲濕熱的作用[14]?，F(xiàn)代臨床研究表明，其對慢性代謝性疾病如高血脂、糖尿病、脂肪肝等具有一定的療效[15-17]，澤瀉的三萜類活性成分如澤瀉A-24-乙酸酯和澤瀉B-23-乙酸酯也被發(fā)現(xiàn)具有抗NAFLD 活性，其作用機(jī)制可能部分與脂聯(lián)素或核受體法尼醇X 受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）的激活有關(guān)[18-19]。本課題組前期在澤瀉藥材中調(diào)血脂活性部位的篩選研究中發(fā)現(xiàn)，澤瀉醇A、澤瀉醇A-23-乙酸酯和澤瀉醇A-24-乙酸酯是澤瀉發(fā)揮調(diào)血脂作用的主要活性成分。在此基礎(chǔ)上，經(jīng)過一系列的工藝考察和優(yōu)化，得到了以澤瀉醇A、澤瀉醇A-23-乙酸酯和澤瀉醇A-24-乙酸酯為主要成分的澤瀉提取物（Alisma orientaleextract，AE）[20]。本研究以游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）誘導(dǎo)建立HepG2 脂肪變性細(xì)胞模型，考察AE 及其3 種主要單體成分對HepG2 脂肪變性細(xì)胞模型的改善作用及作用機(jī)制，以期為相關(guān)新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

HepG2 細(xì)胞購自浙江美森細(xì)胞有限公司。

1.2 藥材

澤瀉由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供，經(jīng)連云港康濟(jì)大藥房連鎖有限公司吳舟執(zhí)業(yè)藥師鑒定為澤瀉科植物澤瀉A.orientalis(Sam.) Juzep.的干燥塊莖。

1.3 藥品與試劑

澤瀉醇A（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.22%，批號149027）、澤瀉醇A-24-乙酸酯（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號150961）購自美國MCE 公司；澤瀉醇A-23-乙酸酯（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號CF9236）、細(xì)胞色素P450 酶7A1（cytochrome P450 enzyme 7A1，CYP7A1）抗體（批號AC7948）購自美國Biorbyt 公司；胎牛血清（批號2059458CP）、0.25%胰酶（批號2465621）、DMEM高糖培養(yǎng)基（批號20220928）購自美國Gibco 公司；即用型PBS 片劑（批號J103KA7999）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；油酸鈉（批號921V038）、棕櫚酸鈉（批號924V021）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，批號1122G022）、油紅O 溶液（批號SLCK1135）購自美國Sigma 公司；增強(qiáng)型CCK-8 試劑盒（批號12142220230519）、增強(qiáng)型BCA 蛋白檢測試劑盒（批號20221101）、活性（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒（批號060722220624）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；三酰甘油（triglyceride，TG）檢測試劑盒（批號20211112）、TC 檢測試劑盒（批號20211112）、總谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒（批號20230918）購自南京建成生物有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號1026786-4）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號1032673-1）、血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）抗體（批號1011567-2）、重組酰基輔酶A 氧化酶1（acyl coenzyme A oxidase 1，ACOX1）抗體（批號1032699-13）、PPARα 抗體（批號1012132-1）購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；PPAR 共激活因子-1α（peroxisome proliferatoractivated receptor gamma coactivator-1α，PGC-1α）抗體（批號5）、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A（carnitine palmitoyl transferase 1A，CPT1A）抗體（批號1）、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體（批號30）購自美國CST 公司；核因子紅細(xì)胞2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythrocyte 2-associated factor 2，Nrf2）抗體（批號YD3883204）購自美國Invitrogen 公司。

1.4 儀器

MS1003S 型分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；371 型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Flex station 3 型多功能酶標(biāo)儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]；SCIENTZ-ⅡD型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Power PacTM HC 型電泳儀、Trans-blot SD型半干轉(zhuǎn)膜儀、Universal HoodII 型凝膠成像發(fā)光系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；5810R 型高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；IX73 倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）。

2 方法

2.1 AE 的制備

將澤瀉干燥塊莖粉碎，加入80%乙醇，加熱回流1.5 h 萃取2 次，濾過，將提取物減壓濃縮后加入60%乙醇-濃硫酸混合物并回流溶液，將溶液冷卻至4 ℃，24 h 后加入NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至5～6，加入去離子水制成含乙醇量40%的溶液，用DM130 大孔吸附樹脂填充色譜柱，45%～55%乙醇洗脫，收集洗脫液后濃縮干燥，將樣品溶于石油醚-醋酸乙酯溶劑，濃縮并在70%下真空干燥72 h，即得AE 粉末。采用配備二極管陣列檢測器的反相高效液相色譜外標(biāo)法對AE 的3 種主要成分含量進(jìn)行測定。監(jiān)測儀的波長為235 nm，體積流量為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2 細(xì)胞用含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素溶液的高糖DMEM 培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

2.3 HepG2 脂肪變性細(xì)胞模型建立

取對數(shù)生長期的HepG2 細(xì)胞，以2×105/孔接種于6 孔板，細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的FFA（油酸-棕櫚酸2∶1）造模劑1 mL，對照組加入1 mL DMEM 完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h后，油紅染色評估細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積量。

2.4 CCK-8 法檢測FFA、AE 及其主要單體成分對HepG2 細(xì)胞活力的影響

取對數(shù)生長期的HepG2 細(xì)胞，以1×104/孔接種于96 孔板，細(xì)胞貼壁后加入含F(xiàn)FA（0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mmol/L）、AE（0.781、1.563、3.125、6.250、12.500、50.000、100.000 mg/L）、澤瀉醇A（0.781、1.563、3.125、6.250、12.500、50.000、100.000 μmol/L）、澤瀉醇A-23-乙酸酯（0.781、1.563、3.125、6.250、12.500、50.000、100.000 μmol/L）、澤瀉醇A-24-乙酸酯（0.781、1.563、3.125、6.250、12.500、50.000、100.000 μmol/L）的DMEM 完全培養(yǎng)基，另設(shè)置對照組（不含藥物）和空白組（不接種細(xì)胞不含藥物）。每組3 個(gè)復(fù)孔，孵育24 h，每孔加入10 μL 的CCK8 試劑，孵育2 h 后于450 nm 處檢測吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝(A給藥－A空白)/(A對照－A空白)

2.5 細(xì)胞內(nèi)TC、TG 含量測定

按“2.3”項(xiàng)方法誘導(dǎo)HepG2 脂肪變性細(xì)胞模型。在誘導(dǎo)同時(shí)加入AE（25.00、12.50、6.25 mg/L）、澤瀉醇A（50.0、25.0、12.5 μmol/L）、澤瀉醇A-23-乙酸酯（25.00、12.50、6.25 μmol/L）、澤瀉醇A-24-乙酸酯（50.0、25.0、12.5 μmol/L）對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，另設(shè)置不含藥物的對照組，孵育24 h 后，按照試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞內(nèi)TC、TG 含量。

2.6 細(xì)胞油紅O 染色

按照“2.5”項(xiàng)方法對細(xì)胞進(jìn)行給藥，孵育完成后，棄去培養(yǎng)基，用冷PBS 清洗2 次；棄去PBS，加入4%多聚甲醛，室溫固定30 min；棄去多聚甲醛，用ddH2O 潤洗3 次，加入60%異丙醇靜置1～2 min；棄去異丙醇，每孔加入2 mL 油紅工作液，避光染色20 min；棄去染液，ddH2O 清洗至水顏色變透明。加入少量ddH2O 后置于倒置顯微鏡下拍照，隨機(jī)選取3 個(gè)視野，用Image J 軟件對脂滴面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.7 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平測定

按照“2.5”項(xiàng)方法對細(xì)胞進(jìn)行處理，孵育完成后，棄去培養(yǎng)基，PBS 洗滌3 次，每孔加入1ml DCFH-DA 探針溶液，37 ℃避光孵育20 min，無血清DMEM 培養(yǎng)基洗滌3 次，熒光顯微鏡下觀察染色情況并拍照，隨機(jī)選取5 個(gè)視野，用Image J 軟件對熒光強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.8 細(xì)胞內(nèi)MDA、GSH 含量及SOD 活性測定

按照“2.5”項(xiàng)方法對細(xì)胞進(jìn)行給藥，孵育完成后，按照試劑盒說明書對細(xì)胞內(nèi)MDA、GSH 含量及SOD 活性進(jìn)行檢測。

2.9 Western blotting 檢測PPARα、PGC-1α、CPT1α、ACOX1 及CYP7A1 蛋白表達(dá)

按照“2.5”項(xiàng)方法對細(xì)胞進(jìn)行給藥，孵育完成后，冷PBS 洗2 次，棄去PBS，每孔加入RIPA 裂解液100 μL，冰上裂解20 min，收集細(xì)胞總蛋白，4 ℃、14 000 r/min 離心10 min，取上清，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。蛋白樣品經(jīng)4%～20%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，TBST 洗滌3 次，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入β-Tubulin（1∶1 000）、PPARα（1∶1 000）、PGC-1α（1∶1 000）、CPT1α（1∶1 000）、ACOX1（1∶1 000）、CYP7A1（1∶1 000）、Nrf2（1∶1 000）及HO-1（1∶1 000）抗體，4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌3 次，二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，TBST 洗滌3 次，加入ECL 顯影液，于Chemi Doc XRS 系統(tǒng)顯影并拍照，Image J 軟件統(tǒng)計(jì)灰度值。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以±s表示，采用GraphPad Prism 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間差異選擇單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 AE 的質(zhì)控

如圖1 所示，經(jīng)測定AE 粉末中澤瀉醇A、澤瀉醇A-24-乙酸酯和澤瀉醇A-23-乙酸酯3 種活性化合物的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85.83%。

圖1 AE (A) 及對照品溶液 (B) 的HPLC 圖譜Fig.1 HPLC of AE (A) and reference substances solution(B)

3.2 不同劑量FFA 對HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響

如圖2 所示，對照組幾乎觀察不到明顯的紅色脂滴，隨著造模劑濃度從0.5 mmol/L 升高至1.5 mmol/L，紅色脂滴的數(shù)量逐漸增加，且融合形成大滴脂滴。利用Image J 軟件進(jìn)行定量分析并通過GraphPad 軟件進(jìn)行組間差異比較后發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，各劑量FFA 誘導(dǎo)后的脂滴量均具有顯著差異（P＜0.01、0.001）。

圖2 不同劑量FFA 對HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響 (±s , n = 3)Fig.2 Effects of different doses of FFA on lipid accumulation in HepG2 cells (±s , n = 3)

3.3 FFA、AE 及其單體化合物對HepG2 細(xì)胞活力的影響

如圖3 所示，與對照組比較，F(xiàn)FA、AE、澤瀉醇A、澤瀉醇A-23-乙酸酯和澤瀉醇A-24-乙酸酯分別在0.75 mmol/L、25 mg/L、50 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L 及以下濃度對細(xì)胞活力無明顯影響，結(jié)合“3.2”項(xiàng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇0.75mmol/L 的FFA作為造模劑量，AE（25.00、12.50、6.25mg/L）、澤瀉醇A（50、25、12.50 μmol/L）、澤瀉醇A-23-乙酸酯（25.00、12.50、6.25μmol/L）和澤瀉醇A-24-乙酸酯（50.0、25.0、12.5 μmol/L）作為給藥劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 FFA、AE、澤瀉醇A、澤瀉醇A-23-乙酸酯、澤瀉醇A-24-乙酸酯對HepG2 細(xì)胞存活率的影響 (±s, n = 3)Fig.3 Effects of FFA, AE, alisol A, alisol A-23-acetate, alisol A-24-acetate on survival rate of HepG2 cells (±s, n = 3)

3.4 AE 及其單體化合物對HepG2 細(xì)胞內(nèi)TC、TG含量的影響

如圖4 所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)TC、TG 水平均顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，AE（25 mg/L）、澤瀉醇A（50、25 μmol/L）、澤瀉醇A-23-乙酸酯（25.0、12.5 μmol/L）和澤瀉醇A-24-乙酸酯（50 μmol/L）給藥組細(xì)胞內(nèi)TC 水平均顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001），AE（25 mg/L）、澤瀉醇A（50、25 μmol/L）和澤瀉醇A-23-乙酸酯（25 μmol/L）給藥組細(xì)胞內(nèi)TG 水平顯著降低（P＜0.05、0.001）。

圖4 AE、澤瀉醇A、澤瀉醇A-23-乙酸酯、澤瀉醇A-24-乙酸酯對HepG2 細(xì)胞內(nèi)TC、TG 含量的影響 (±s , n = 3)Fig.4 Effects of AE, alisol A, alisol A-23-acetate, alisol A-24-acetate on TC and TG contents in HepG2 cells (±s , n = 3)

3.5 AE 及其單體化合物對HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響

如圖5 所示，與對照組比較，模型組HepG2 細(xì)胞中出現(xiàn)大量紅色脂滴（P＜0.001），表明模型構(gòu)建成功。與模型組比較，各給藥組細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴含量均降低，且AE（25 mg/L）、澤瀉醇A（50、25 μmol/L）和澤瀉醇A-23-乙酸酯（25.0、12.5 μmol/L）給藥組細(xì)胞中脂滴含量與模型組存在顯著性差異（P＜0.01、0.001）。結(jié)合“3.4”項(xiàng)結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用給藥劑量為AE（25 mg/L）、澤瀉醇A（25 μmol/L）、澤瀉醇A-23-乙酸酯（12.5 μmol/L）及澤瀉醇A-24-乙酸酯（50 μmol/L）。

圖5 AE、澤瀉醇A、澤瀉醇A-23-乙酸酯、澤瀉醇A-24-乙酸酯對HepG2 細(xì)胞脂滴蓄積的影響 (±s, n = 3)Fig.5 Effects of AE, alisol A, alisol A-23-acetate, alisol A-24-acetate on lipid accumulation in HepG2 cells (±s , n = 3)

3.6 AE 及其單體化合物對HepG2 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響

如圖6 所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞中ROS水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，AE、澤瀉醇A 及澤瀉醇A-24-乙酸酯給藥組細(xì)胞內(nèi)ROS 水平顯著降低（P＜0.05、0.001），澤瀉醇A-23-乙酸酯給藥組細(xì)胞內(nèi)ROS 水平也出現(xiàn)降低，但與模型組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖6 AE、澤瀉醇A、澤瀉醇A-23-乙酸酯、澤瀉醇A-24-乙酸酯對HepG2 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響 (±s, n = 3)Fig.6 Effects of AE, alisol A, alisol A-23-acetate, alisol A-24-acetate on ROS level in HepG2 cells (±s, n = 3)

圖6 AE、澤瀉醇A、澤瀉醇A-23-乙酸酯、澤瀉醇A-24-乙酸酯對HepG2 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響 (±s, n = 3)Fig.6 Effects of AE, alisol A, alisol A-23-acetate, alisol A-24-acetate on ROS level in HepG2 cells (±s, n = 3)

3.7 AE 及其單體化合物對HepG2 細(xì)胞內(nèi)MDA、GSH 水平及SOD 活性的影響

如圖7 所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)MDA 水平顯著升高（P＜0.001），SOD 活性及GSH水平均顯著降低（P＜0.01、0.001）；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞內(nèi)MDA 水平均顯著下降（P＜0.001），AE、澤瀉醇A 給藥組細(xì)胞內(nèi)SOD 活性均顯著升高（P＜0.05），AE、澤瀉醇A 及澤瀉醇A-24-乙酸酯給藥組細(xì)胞內(nèi)GSH 水平顯著升高（P＜0.05、0.01）。

圖7 AE、澤瀉醇A、澤瀉醇A-23-乙酸酯、澤瀉醇A-24-乙酸酯對HepG2 細(xì)胞內(nèi)MDA、GSH 水平及SOD 活性的影響(±s, n = 3)Fig.7 Effects of AE, alisol A, alisol A-23-acetate, alisol A-24-acetate on MDA, GSH levels and SOD activity in HepG2 cells(±s, n = 3)

3.8 AE 及其單體化合物對細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化及膽固醇代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖8 所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞中PPARα、PGC-1α、CPT1A 及ACOX1 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001）；與模型組比較，AE、澤瀉醇A 及澤瀉醇A-23-乙酸酯給藥組細(xì)胞中PPARα、PGC-1α 及ACOX1 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05、0.01），澤瀉醇A 及澤瀉醇A-23-乙酸酯給藥組細(xì)胞中CPT1A 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05、0.01），AE、澤瀉醇A 及澤瀉醇A-24-乙酸酯給藥組細(xì)胞中CYP7A1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05、0.01）。

圖8 AE、澤瀉醇A、澤瀉醇A-23-乙酸酯、澤瀉醇A-24-乙酸酯對HepG2 細(xì)胞中PGC-1α、PPARα、CPT1A、ACOX1及CYP7A1 蛋白表達(dá)的影響 (±s , n = 3)Fig.8 Effects of AE, alisol A, alisol A-23-acetate, alisol A-24-acetate on PGC-1α, PPARα, CPT1A, ACOX1 and CYP7A1 protein expressions in HepG2 cells (±s , n = 3)

3.9 AE 及其單體化合物對細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)通路Nrf2/HO-1 蛋白表達(dá)的影響

如圖9 所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞中Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05、0.01）；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平均呈上升趨勢，其中AE 及澤瀉醇A給藥組Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.05、0.01）。

圖9 AE、澤瀉醇A、澤瀉醇A-23-乙酸酯、澤瀉醇A-24-乙酸酯對HepG2 細(xì)胞中Nrf2/HO-1 蛋白表達(dá)的影響(±s, n = 3)Fig.9 Effects of AE, alisol A, alisol A-23-acetate, alisol A-24-acetate on Nrf2/HO-1 protein expressions in HepG2 cells(±s, n = 3)

4 討論

NAFLD 是一種由脂質(zhì)代謝失衡、胰島素抵抗和氧化應(yīng)激異常等多因素相結(jié)合導(dǎo)致的復(fù)雜性肝病，現(xiàn)已成為慢性肝病的主要原因[21]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)澤瀉提取物能改善NAFLD 的中醫(yī)病機(jī)，有效調(diào)節(jié)肝臟的糖脂代謝，控制氧化應(yīng)激、炎癥和纖維化等肝損傷[22-23]。本研究中使用的AE 的主要單體成分為澤瀉醇A、澤瀉醇A-23-乙酸酯和澤瀉醇A-24-乙酸酯。澤瀉醇A 可通過提高脂蛋白脂酶活性從而降低高脂血癥患者血漿中TG、TC 水平[24]。澤瀉醇A-23-乙酸酯能刺激將TC 轉(zhuǎn)化為膽汁酸的關(guān)鍵蛋白CYP7A1 的轉(zhuǎn)錄，有助于改善高脂血癥和肝臟脂肪變性[25]。澤瀉醇A-24-乙酸酯降低了NASH 小鼠模型肝組織中ROS 水平，通過刺激小鼠肝臟和人肝星狀細(xì)胞的自噬，從而抑制氧化應(yīng)激來改善NASH[19]。以上研究結(jié)果進(jìn)一步證明了AE 中的澤瀉醇A 及其衍生物可能是發(fā)揮抗NAFLD 作用的主要活性成分。FFA 是由棕櫚酸和油酸組成的一種常用的肝脂肪變性造模劑，利用過量的棕櫚酸或FFA 刺激HepG2 細(xì)胞后，細(xì)胞脂毒性增加，細(xì)胞脂質(zhì)氧化相關(guān)蛋白PPARα 及ACOX1 等表達(dá)水平降低，HepG2細(xì)胞會出現(xiàn)嚴(yán)重的脂質(zhì)蓄積并通常伴隨著顯著的氧化應(yīng)激異常[26-28]。因此本實(shí)驗(yàn)通過0.75 mmol/L FFA誘導(dǎo)來構(gòu)建穩(wěn)定的HepG2 脂肪變性細(xì)胞模型，用于評價(jià)AE 及其主要單體化合物的藥效和作用機(jī)制。

肝臟作為重要的代謝器官，在脂質(zhì)的消化、吸收、運(yùn)輸、代謝和合成中起著不可或缺的作用[29]。在生理?xiàng)l件下，肝臟攝取的脂肪酸通常被轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體或過氧化物酶體進(jìn)行β 氧化為機(jī)體供能，僅一小部分脂肪酸轉(zhuǎn)化為TG。因此肝臟的TG 儲存量通常極少[30]。同時(shí)，肝臟可通過CYP7A1 等關(guān)鍵酶將TC 轉(zhuǎn)化為膽汁酸，防止TC 及毒性代謝物的累積，維持體內(nèi)的脂質(zhì)代謝平衡[31]。當(dāng)機(jī)體長期處于高脂質(zhì)水平下時(shí)，肝臟脂質(zhì)代謝平衡失調(diào)，氧化途徑受損，TG、TC 在肝細(xì)胞內(nèi)大量蓄積，從而導(dǎo)致NAFLD的發(fā)生[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，利用造模劑FFA 刺激HepG2 細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴，TC、TG 含量顯著上升。與模型組相比，AE、澤瀉醇A、澤瀉醇A-23-乙酸酯和澤瀉醇A-24-乙酸酯可不同程度地抑制細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量，并明顯降低TC、TG 水平，表明AE 可以改善FFA 造成HepG2 脂肪變細(xì)胞模型的脂質(zhì)蓄積。

PPARs，是配體激活轉(zhuǎn)錄因子的核受體超家族，由3 種亞型組成，其中PPARα 主要存在于肝臟中，可在共激活因子PGC1α 協(xié)同下調(diào)節(jié)膽固醇和脂肪酸代謝[33]。PPARα 可以減少肝臟中富含TG 的脂質(zhì)膽固醇以及TG 的積累，通過影響下游脂肪酸氧化基因和膽固醇代謝基等，調(diào)節(jié)脂肪酸運(yùn)輸，促進(jìn)β-氧化和膽固醇分解[34]。脂肪酸β-氧化主要發(fā)生于線粒體，肝細(xì)胞脂肪酸活化成脂酰輔酶A 后通過CPT1A 轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體中進(jìn)行氧化[35]，是體內(nèi)脂肪酸氧化的主要方式之一，由于線粒體缺乏氧化極長鏈脂肪酸的能力，這些脂肪酸會優(yōu)先通過過氧化物酶體 β-氧化進(jìn)行代謝，此途徑中的限速酶是ACOX1[36]。此外，已有研究證實(shí)NAFLD 患者血清中的TC 比率與其病理評分顯著正相關(guān)，將膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸，可以防止膽固醇及其毒性代謝物的積累，是肝細(xì)胞中膽固醇清除的重要途徑，而PPARα參與膽固醇代謝過程中的關(guān)鍵酶CYP7A1的調(diào)節(jié)[37]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，AE 及其單體成分給藥組細(xì)胞內(nèi)PPARα、PGC1α、CPT1A、ACOX1及CYP7A1 蛋白表達(dá)上調(diào)，提示AE 可能通過影響PPARα 通路改善HepG2 脂肪變性細(xì)胞的脂質(zhì)代謝失衡。

當(dāng)過量FFA 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞發(fā)生脂肪變性時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)脂滴蓄積，脂質(zhì)β 氧化增加了呼吸鏈電子，導(dǎo)致過量ROS 生成[38-39]。過量ROS 會誘導(dǎo)DNA 氧化損傷和各種細(xì)胞毒性相關(guān)蛋白的異常表達(dá)，毒性代謝產(chǎn)物MDA 大量蓄積，抗氧化因子SOD 和GSH活性降低，從而造成肝細(xì)胞線粒體功能損傷，進(jìn)一步加重肝細(xì)胞脂肪變性[40-41]。本研究發(fā)現(xiàn)AE、澤瀉醇A和澤瀉醇A-24-乙酸酯具有良好的抗氧化能力，顯著降低ROS 和MDA 的水平，同時(shí)提高SOD 活性和GSH 水平，提示AE 通過提高抗氧化水平抑制FFA 引起的氧化應(yīng)激異常，從而緩解脂肪變性。

細(xì)胞氧化應(yīng)激的主調(diào)控蛋白為Nrf2，生理?xiàng)l件下，其與Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白（Kelch-like epichlorohydrin-related proteins，Keap1）結(jié)合，在胞質(zhì)中處于非活性狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞被ROS 刺激后，Nrf2從聚合體解偶聯(lián)并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，與Maf 蛋白形成異二聚體后與核內(nèi)抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant reaction elements，AREs）結(jié)合，啟動后續(xù)轉(zhuǎn)錄過程，激活下游靶基因，抗氧化應(yīng)激，減少肝損傷[27,42]。為了確定Nrf2 是否參與了AE 改善HepG2 脂肪變性細(xì)胞模型氧化應(yīng)激異常，本研究檢測了Nrf2/HO-1 通路的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果表明AE 及其單體化合物中的澤瀉醇A 顯著恢復(fù)了由于過量FFA 導(dǎo)致的Nrf2/HO-1 蛋白表達(dá)的病理性降低，這表明AE 可能通過激活Nrf2/HO-1 通路來改善氧化應(yīng)激異常，澤瀉醇A 和澤瀉醇A-24-乙酸酯可能是AE 發(fā)揮抗氧化能力的主要活性成分。已有研究表明PPARα 激動劑可以通過上調(diào)PPARα 蛋白表達(dá)刺激Nrf2 易位到細(xì)胞核中，促進(jìn)其與ARE 的結(jié)合以及AREs 下游抗氧化蛋白HO-1 的轉(zhuǎn)錄起始，從而減輕氧化應(yīng)激損傷[43]。因此，推測AE 可能是通過調(diào)節(jié)PPARα 蛋白表達(dá)，從而激活Nrf2/HO-1 通路，相關(guān)機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

綜上，AE 及其單體化合物可能通過調(diào)節(jié)PPARα 通路來促進(jìn)脂肪酸氧化和膽固醇清除，減少肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積，同時(shí)激活Nrf2/HO-1 通路，抑制氧化應(yīng)激，最終改善HepG2 細(xì)胞脂肪變性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突