超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定蔬菜中氯酸鹽和高氯酸鹽

鄒淼，劉順鑫，馮靜，韓曉鷗

（遼寧省疾病預(yù)防控制中心，沈陽(yáng) 110005）

氯酸鹽是使用含氯消毒劑消毒時(shí)產(chǎn)生的副產(chǎn)物，會(huì)阻礙甲狀腺對(duì)碘的吸收，還會(huì)破壞紅血球，引起貧血癥及高鐵性血紅蛋白血癥，導(dǎo)致呼吸困難[1]。高氯酸鹽化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，溶解度高，具有一定的持久性和擴(kuò)散性。高氯酸鹽由于和碘離子擁有相似的離子半徑及電荷，能夠抑制碘的吸收，影響人體甲狀腺功能，導(dǎo)致功能紊亂，對(duì)孕婦和嬰幼兒影響更大[2]。隨著氯酸鹽和高氯酸鹽進(jìn)入環(huán)境，遷移至土壤和水體中，被水生物、植物體吸收、富集，通過(guò)食物鏈最終進(jìn)入人體，威脅人類(lèi)健康[3]。蔬菜是人們?nèi)粘Ｋ枋澄铮瑸槿梭w提供必需的維生素和礦物質(zhì)等，其在生長(zhǎng)及運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程富集土壤、水體中的污染物，通過(guò)飲食攝入影響人體健康。目前已有報(bào)道，在大米、蔬菜、水果等產(chǎn)品中均有氯酸鹽和高氯酸鹽的檢出，為保障人民群眾舌尖上的安全，對(duì)蔬菜中氯酸鹽及高氯酸鹽的檢測(cè)非常必要。當(dāng)前對(duì)于蔬菜中高氯酸鹽的檢測(cè)研究較多，而對(duì)于氯酸鹽和高氯酸鹽同時(shí)快速檢測(cè)較少，因此，建立高效、準(zhǔn)確的方法同時(shí)檢測(cè)食品中氯酸鹽和高氯酸鹽殘留具有重要意義。

現(xiàn)有的氯酸鹽和高氯酸鹽檢測(cè)方法有離子色譜法[4-5]、離子色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6-7]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-9]等。離子色譜法當(dāng)樣品基質(zhì)復(fù)雜時(shí)容易出現(xiàn)假陽(yáng)性；離子色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法普及率較低；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有抗干擾能力強(qiáng)，分析速度快，靈敏度高，避免基質(zhì)干擾的優(yōu)點(diǎn)，因而得到普遍應(yīng)用。

筆者以少量水稀釋分散樣品，用乙腈提取，然后用PRⅠME HLB 固相萃取柱凈化，以同位素內(nèi)標(biāo)法定量，建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定蔬菜中氯酸鹽和高氯酸的快速檢測(cè)方法，為了解我國(guó)蔬菜中氯酸鹽和高氯酸鹽的殘留水平提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：Acquity Xevo TQ型，美國(guó)沃特世公司。

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：ST16R型，美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

多用途漩渦混合器：Vortex genie2 型，美國(guó)Scientific Ⅰndustries公司。

固相萃取儀：Vac Elut SPS 24型，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

固相萃取柱：PRⅠME HLB 型，200 mg (6 mL)，美國(guó)沃特世公司。

氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 004 μg/mL (以ClO3-計(jì))，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號(hào)為SB05-223-2008，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所。

高氯酸鹽(ClO4-)標(biāo)準(zhǔn)溶液、氯酸鹽(Cl18O3-)內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液、高氯酸鹽(Cl18O4-)內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液：質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，美國(guó)Cambridge Ⅰsotope Laboratories公司。

乙腈：色譜純，美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水，由Milli-Q純水系統(tǒng)制得。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：其中含有1.0 μg/mL ClO4-和2.0 μg/mL ClO3-。分別準(zhǔn)確移取100 μL 高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液和20 μL氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL容量瓶中，用超純水定容至標(biāo)線，混勻。

混合同位素內(nèi)標(biāo)使用液：其中含有1.0 μg/mL Cl18O4-和10 μg/mL Cl18O3-。分別準(zhǔn)確移取100 μL高氯酸鹽內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液和1 000 μL 氯酸鹽內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL 容量瓶中，用超純水定容至標(biāo)線，混勻。

系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：高氯酸鹽質(zhì)量濃度分別為0.00、1.00、2.00、5.00、10.0、20.0、50.0 ng/mL，氯酸鹽質(zhì)量濃度分別為0.00、2.00、4.00、10.0、20.0、40.0、100 ng/mL，同位素內(nèi)標(biāo)Cl18O4-和Cl18O3-質(zhì)量濃度分別為5.0、50 ng/mL。分別準(zhǔn)確移取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液至7 只10 mL 容量瓶中，每只容量瓶中加入50 μL混合同位素內(nèi)標(biāo)使用液，用乙酸銨-乙腈溶液(體積比為1∶2)稀釋并定容，混勻。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜儀

色譜柱：Waters Torus DEA柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國(guó)沃特世公司)；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；流動(dòng)相：(A) 20 mmoL/L 乙酸銨溶液，(B)乙腈，流量為0.3 mL/min；淋洗方式：梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫條件Tab.1 Gradient elution conditions

1.3.2 質(zhì)譜儀

電離方式：ESⅠ-；離子源溫度：150 ℃；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；脫溶劑氣溫度：500 ℃；脫溶劑氣流量：800 L/h；錐孔反吹氣流量：50 L/h。氯酸鹽和高氯酸鹽及內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 氯酸鹽和高氯酸鹽及內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 Parameters of mass spectra of chlorate and perchlorate and internal standard

1.4 樣品處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g蔬菜樣品于50 mL離心管中，加入100 μL 混合同位素內(nèi)標(biāo)使用液，加入7.0 mL 超純水，渦旋振蕩提取5 min，再加入13.0 mL 乙腈，混勻，超聲30 min，以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液，待凈化。移取3.0 mL 上清液，過(guò)PRⅠME HLB固相萃取柱，棄去前1 mL初濾液，收集約1 mL續(xù)濾液，過(guò)0.22 μm再生纖維濾膜，上機(jī)測(cè)定。

1.5 樣品測(cè)定

取上述樣品溶液，在1.3 儀器工作條件下測(cè)定，以色譜峰面積內(nèi)標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

氯酸鹽、高氯酸鹽及其內(nèi)標(biāo)物為含有強(qiáng)陰離子酸根的鹽類(lèi)，選擇負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描，確定ClO3-、ClO4-、Cl18O3-、Cl18O4-的母離子子離子見(jiàn)表2，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[10-12]。以上述4 種目標(biāo)化合物的分子離子峰為母離子，進(jìn)行子離子掃描，同時(shí)對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，選取互不干擾且響應(yīng)最高的兩個(gè)離子峰作為子離子，其中響應(yīng)較高的作為定量子離子，另一個(gè)作為定性子離子。

2.2 色譜條件優(yōu)化

氯酸鹽及高氯酸鹽是強(qiáng)極性的離子化合物，常用的C18反相色譜柱很難將其完全分離，因此采用Waters Torus DEA 色譜柱，該色譜柱填料的鍵合相能對(duì)氯酸根和高氯酸根實(shí)現(xiàn)快速、穩(wěn)定的分離，同時(shí)解決了離子交換柱不能應(yīng)用有機(jī)相作為流動(dòng)相的缺點(diǎn)。在實(shí)際測(cè)樣過(guò)程中，由于基質(zhì)的不同，對(duì)目標(biāo)化合物會(huì)有不同程度的抑制，等度洗脫很難滿足實(shí)驗(yàn)要求，故需采用梯度洗脫方式。以20 mmoL/L乙酸銨溶液為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，流量設(shè)定為0.3 mL/min，進(jìn)行梯度洗脫，氯酸鹽、高氯酸鹽的靈敏度、峰形均能滿足分析要求，具有特異性強(qiáng)，假陽(yáng)性少的優(yōu)點(diǎn)。氯酸鹽及高氯酸鹽的MRM提取離子流圖見(jiàn)圖1。

圖1 氯酸鹽及高氯酸鹽的MRM提取離子流圖Fig.1 MRM Chromatogram of chlorate and perchlorate

2.3 樣品處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.3.1 提取試劑的選擇

氯酸鹽、高氯酸鹽都屬于無(wú)機(jī)陰離子，有較好的水溶性，因此，蔬菜樣品取樣后，先加入少量水稀釋分散后再加入有機(jī)溶劑提取。實(shí)驗(yàn)比較了水-乙腈(體積比11∶9)、水-乙腈(體積比1∶1)、水-乙腈(體積比7∶13)、乙腈的提取效率，結(jié)果表明，用乙腈提取時(shí)，回收率不穩(wěn)定波動(dòng)較大，隨著水比例的增加，提取率趨于穩(wěn)定，但是當(dāng)乙腈比例的減少一定程度時(shí)，提取效率開(kāi)始降低，結(jié)果見(jiàn)圖2。乙腈作為提取試劑，具有一定的組織穿透能力，對(duì)于蔬菜提取是較好的選擇。水-乙腈(體積比7∶13)的提取效率較高且穩(wěn)定，因此選取水-乙腈(體積比7∶13)作為提取試劑。

2.3.2 固相萃取柱的選擇

對(duì)比了C18柱、WAX柱、PRⅠME HLB柱3種固相萃取小柱的凈化效果，結(jié)果表明，C18柱與PRiME HLB 柱的回收率無(wú)顯著性差異，而應(yīng)用WAX 柱回收率相對(duì)較低，在70%左右(見(jiàn)圖3)。同時(shí)，PRiME HLB柱操作簡(jiǎn)便，無(wú)需活化，節(jié)約試劑，是快速檢測(cè)的最佳選擇。為簡(jiǎn)便操作，選取PRiME HLB固相萃取柱作為凈化柱。此外，還對(duì)過(guò)柱后的初濾液與續(xù)濾液進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)對(duì)于氯酸鹽，其初濾液和續(xù)濾液結(jié)果存在顯著性差異，而高氯酸鹽無(wú)此差異，這與張文婷等[13]的研究結(jié)果基本一致，因此，應(yīng)棄去前1 mL的初濾液，收集續(xù)濾液用于測(cè)定，以保證氯酸鹽檢測(cè)結(jié)果的正確性。

圖3 氯酸鹽和高氯酸鹽在不同固相萃取柱上的平均回收率Fig.3 Average recoveries of chlorate and perchlorate on different solid phase extraction columns

2.4 內(nèi)標(biāo)物的選擇

利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定時(shí)，目標(biāo)化合物容易受到來(lái)自樣品基質(zhì)的干擾，產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。常見(jiàn)的降低基質(zhì)效應(yīng)的方法有同位素內(nèi)標(biāo)法、基質(zhì)匹配曲線法和減小進(jìn)樣量等[14-15]。同位素內(nèi)標(biāo)有著與目標(biāo)化合物相似的理化性質(zhì)，能夠補(bǔ)償由基質(zhì)效應(yīng)引起的信號(hào)改變。實(shí)驗(yàn)根據(jù)氯酸鹽和高氯酸鹽的性質(zhì)選取內(nèi)標(biāo)物，氯酸鹽以Cl18O3-為內(nèi)標(biāo)，高氯酸鹽以為Cl18O4-內(nèi)標(biāo)，結(jié)果表明，以上述2種同位素為內(nèi)標(biāo)時(shí)，可獲得準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.5 線性范圍和檢出限

在實(shí)驗(yàn)條件下分別測(cè)定系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別以氯酸鹽、高氯酸鹽的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以氯酸鹽、高氯酸鹽與相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以3倍信噪比對(duì)應(yīng)的氯酸鹽、高氯酸鹽質(zhì)量濃度作為方法檢出限，以10倍信噪比對(duì)應(yīng)的氯酸鹽、高氯酸鹽質(zhì)量濃度作為方法定量限，氯酸鹽、高氯酸鹽的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限、定量限見(jiàn)表3。

表3 氯酸鹽、高氯酸鹽的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限Tab.3 Linear relationship， correlation coefficients， detection limits， and limit of quantitation of chlorate and perchlorate

2.6 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)

選取3 組蔬菜陰性樣品，每組6 份，分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)中間液及混合同位素內(nèi)標(biāo)使用液，混勻，靜置，使其充分混合，然后利用該實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行樣品處理，上機(jī)測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。由表4 可知，氯酸鹽、高氯酸鹽的平均回收率為88.9%～97.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%～7.4%(n=6)，回收率和精密度均滿足實(shí)際樣品測(cè)定的要求。

表4 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Recovery results of spiked samples

3 結(jié)語(yǔ)

采用Waters Torus DEA 色譜柱，少量水稀釋分散，乙腈提取，PRⅠME HLB固相萃取柱凈化，結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蔬菜中氯酸鹽和高氯酸鹽。與其他實(shí)驗(yàn)方法相比，選用合適比例的水-乙腈保證提取效率，采用PRⅠME HLB 固相萃取柱簡(jiǎn)化凈化步驟，應(yīng)用同位素內(nèi)標(biāo)降低基質(zhì)效應(yīng)，使得蔬菜中氯酸鹽及高氯酸鹽的檢測(cè)更加準(zhǔn)確，便捷，高效，具有良好的精密度和回收率，適用于蔬菜中氯酸鹽及高氯酸的大批量快速檢測(cè)。