半夏塊莖組培增殖技術(shù)研究

楊會(huì)苗 張 秦 張軍民 劉蘭英

（北京市海淀區(qū)植物組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室/北京市植物組織培養(yǎng)工程技術(shù)研究中心/北京?；ㄉ锟萍加邢薰?北京 100091）

半夏（Pinellia ternate）為天南星科半夏屬多年生草本植物，其干燥塊莖可入藥，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)等功效；半夏用藥歷史悠久，在臨床上主要用于降逆止嘔、鎮(zhèn)咳、解毒抗炎、抗癌、治療冠心病等[1-5]。 我國(guó)半夏野生資源分布廣泛，除了黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古、新疆、青海、西藏外，其他地區(qū)均有分布，近年來(lái)因生態(tài)環(huán)境和人為因素影響，野生資源銳減，不能滿足市場(chǎng)需求[6-7]。 傳統(tǒng)人工栽培技術(shù)主要是用塊莖進(jìn)行繁殖，周期長(zhǎng)，生產(chǎn)成本高，繁殖系數(shù)小，生產(chǎn)中易受病害侵染，產(chǎn)量品質(zhì)無(wú)法保障，種源退化[8]；而利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)可在短時(shí)間內(nèi)快速獲得大量塊莖，降低生產(chǎn)成本，提高種苗品質(zhì)和半夏藥品質(zhì)量。 本研究以半夏塊莖為供試材料，研究了不同濃度配比的6-BA、NAA、 活性炭和蔗糖對(duì)半夏塊莖組培增殖的影響， 以期對(duì)半夏種苗繁育及其相關(guān)技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)以半夏無(wú)菌組培塊莖為供試材料，于2021-2022 年在北京市海淀區(qū)植物組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以MS 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，研究不同濃度配比的6-BA、NAA、 活性炭和蔗糖對(duì)半夏塊莖組培增殖的影響，培養(yǎng)基中瓊脂用量均為6 g/L。

（1）6-BA 和NAA 試驗(yàn)： 培養(yǎng)基中6-BA 濃度分別為0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L，NAA 濃度分別為0.1 mg/L、0.3 mg/L、0.5 mg/L，以未加激素的培養(yǎng)基為對(duì)照，蔗糖用量均為30 g/L。

（2）活性炭試驗(yàn)： 培養(yǎng)基中活性炭濃度分別為0 （CK）、0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L，NAA 濃度均為0.5 mg/L，蔗糖用量均為60 g/L。

（3）蔗糖試驗(yàn)：培養(yǎng)基中蔗糖濃度分別為30 g/L（CK）、60 g/L、90 g/L、120 g/L、150 g/L，NAA 濃度均為0.5 mg/L。

以上3 個(gè)試驗(yàn)中每個(gè)處理3 次重復(fù)， 每個(gè)重復(fù)接種12 個(gè)直徑約位0.3 cm 的半夏塊莖。

1.2.2 培養(yǎng)條件和指標(biāo)測(cè)定 培養(yǎng)溫度為25℃，光照度2 000～2 500 lx，光照時(shí)間12 h/d，培養(yǎng)80 d 后統(tǒng)計(jì)塊莖的直徑、鮮重和數(shù)量。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS 17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 激素對(duì)半夏塊莖增殖和膨大的影響

激素對(duì)半夏塊莖增殖和膨大的影響見(jiàn)表1、圖1。 培養(yǎng)基中添加0.5～2.0 mg/L 的6-BA 時(shí)， 半夏塊莖直徑＜0.4 cm，鮮重為0.4～0.6 g，各處理之間差異不顯著，但均顯著小于對(duì)照；半夏塊莖數(shù)量隨著6-BA濃度的升高先增加后降低， 各處理之間差異顯著，并顯著高于對(duì)照。 結(jié)果表明， 添加0.5～2.0 mg/L 的6-BA 能明顯促進(jìn)半夏塊莖增殖， 其中6-BA 濃度為1.0 mg/L 時(shí)塊莖數(shù)量最多，可達(dá)19.82 個(gè)。

表1 6-BA 和NAA 對(duì)半夏塊莖增殖的影響

圖1 半夏在不同濃度6-BA 和NAA 培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

培養(yǎng)基中添加0.1～0.5 mg/L 的NAA 時(shí)，半夏塊莖直徑和鮮重隨NAA 濃度升高而降低，各處理之間差異顯著；當(dāng)NAA 濃度為0.1 mg/L 時(shí)，塊莖直徑最大為0.94 cm，與對(duì)照差異不顯著，鮮重最大為0.670 g，顯著大于對(duì)照；半夏塊莖數(shù)量與NAA 濃度呈正比，當(dāng)NAA 濃度為0.5 mg/L 時(shí)， 塊莖數(shù)量最多為4.78 個(gè)，顯著高于對(duì)照。 結(jié)果表明，添加0.1～0.5 mg/L 的NAA有利于半夏塊莖增殖和膨大，其中最適宜半夏塊莖膨大的NAA 濃度為0.1 mg/L；NAA 濃度為0.5 mg/L 有利于半夏塊莖增殖，但顯著小于6-BA 濃度為1.0 mg/L的塊莖增殖數(shù)量。

培養(yǎng)基中同時(shí)添加6-BA 和NAA 時(shí)， 半夏塊莖直徑大部分為0.4～0.5 cm， 顯著大于單獨(dú)添加6-BA的直徑， 顯著小于對(duì)照和單獨(dú)添加NAA 的直徑；半夏塊莖鮮重集中于0.070～0.120 g， 大部分與單獨(dú)添加6-BA 的鮮重差異不顯著，顯著小于對(duì)照和單獨(dú)添加NAA 的鮮重； 在添加6-BA 的情況下， 隨著添加NAA 濃度的增加，塊莖數(shù)量逐漸減少，但塊莖直徑和鮮重的變化不大； 當(dāng)6-BA 濃度為2.0 mg/L、NAA 濃度為0.1 mg/L 時(shí)，塊莖數(shù)量最多為16.44 個(gè)，顯著小于單獨(dú)添加6-BA 濃度為1.0 mg/L 時(shí)的塊莖數(shù)量。

2.2 活性炭對(duì)半夏塊莖增殖和膨大的影響

活性炭對(duì)半夏塊莖增殖和膨大的影響見(jiàn)表2、圖2。 隨著活性炭濃度增加，半夏塊莖的直徑呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)， 大部分處理之間差異不顯著；當(dāng)活性炭濃度為0.5 g/L 時(shí)， 半夏塊莖直徑最大為0.71 cm， 且顯著大于對(duì)照； 當(dāng)活性炭濃度為2.0 g/L時(shí)，半夏塊莖直徑最小為0.61 cm，與對(duì)照差異不顯著。 隨著活性炭濃度的增加， 半夏塊莖鮮重也呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)， 大部分處理之間差異顯著；當(dāng)活性炭濃度為0.5 g/L 時(shí)， 半夏塊莖鮮重最大為0.409 g，顯著大于對(duì)照；當(dāng)活性炭濃度為2.0 g/L 時(shí)，半夏塊莖鮮重最小為0.200 g，顯著小于對(duì)照；活性炭濃度為1.0 g/L 和1.5 g/L 時(shí)， 半夏塊莖鮮重相差不大，且與對(duì)照差異不顯著。 活性炭的濃度與半夏塊莖的繁殖數(shù)量呈反比， 添加活性炭顯著降低了半夏塊莖的繁殖數(shù)量。 結(jié)果表明，適量增加活性炭有利于塊莖的膨大，當(dāng)活性炭濃度為0.5 g/L 時(shí)，半夏塊莖直徑和鮮重最大，但活性炭不利于半夏塊莖的增殖，增殖數(shù)量明顯減少。

圖2 半夏在不同含量活性炭培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

2.3 蔗糖對(duì)半夏塊莖增殖和膨大的影響

蔗糖對(duì)半夏塊莖增殖和膨大的影響見(jiàn)表3、圖3。 隨著蔗糖濃度的增加，半夏塊莖的直徑呈現(xiàn)先增加后降低再增加的趨勢(shì)，蔗糖濃度為60 g/L 時(shí)，半夏塊莖直徑最大為0.66 cm，顯著大于對(duì)照；蔗糖濃度為90 g/L 時(shí)，半夏塊莖直徑最小為0.49 cm，顯著小于對(duì)照； 蔗糖濃度為120 g/L、150 g/L 時(shí)半夏塊莖直徑相差不大，與對(duì)照差異不顯著。 半夏塊莖鮮重的變化趨勢(shì)和直徑相同，蔗糖濃度為60 g/L 時(shí)，鮮重最大為0.350 g，顯著大于對(duì)照；蔗糖濃度為90 g/L 時(shí)，鮮重最小為0.132 g， 顯著小于對(duì)照； 蔗糖濃度為120 g/L 和150 g/L 時(shí)，半夏塊莖鮮重相差不大，但均與對(duì)照及其他處理差異顯著。 半夏塊莖數(shù)量隨蔗糖濃度的升高逐漸降低，蔗糖濃度為60 g/L 時(shí)，半夏塊莖數(shù)量最多為4.86 個(gè)，與對(duì)照差異不顯著，但與其他處理差異顯著。 結(jié)果表明，蔗糖濃度為60 g/L 時(shí)，有利于半夏塊莖增殖和膨大。

表3 蔗糖對(duì)半夏塊莖增殖的影響

圖3 半夏在不同濃度蔗糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

3 討論與結(jié)論

半夏塊莖既是藥用的重要部分， 也是繁殖的主要材料。 通過(guò)組培的方法進(jìn)行塊莖的增殖，能夠短時(shí)間內(nèi)獲得大量半夏種苗。 本研究以半夏組培苗為供試材料，探究6-BA、NAA、活性炭和蔗糖對(duì)半夏塊莖增殖的影響，以期找到合適的添加物及濃度，加快半夏塊莖增殖速度，為生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)6-BA 和NAA 對(duì)半夏塊莖組培增殖具有重要作用，培養(yǎng)基中單獨(dú)添加1.0 mg/L 的6-BA可使塊莖的增殖數(shù)量達(dá)到最大（19.82 個(gè)）；單獨(dú)添加0.1 mg/L 的NAA 可使塊莖直徑達(dá)到最大（0.94 cm），鮮重達(dá)到最大（0.67 g）；在6-BA 存在的情況下，NAA濃度與塊莖數(shù)量呈反比， 但對(duì)塊莖直徑和鮮重影響不大。 其他研究者對(duì)半夏組培增殖也做了許多工作，也證明了6-BA 和NAA 對(duì)半夏組培增殖的重要作用。 陳紅艷等[9]以野生旱半夏為供試材料，研究了不同外源激素對(duì)野生旱半夏組培快繁的影響， 認(rèn)為添加6-BA 2.0 mg/L 和NAA 0.2 mg/L 最適合增殖；陶米林等[10]以野生半夏塊莖為供試材料，對(duì)不定芽的分化條件進(jìn)行了研究， 發(fā)現(xiàn)塊莖不定芽分化最佳條件為6-BA 1.0 mg/L 和NAA 0.2 mg/L；房海悅[11]以旱半夏塊莖為材料，研究了旱半夏組織培養(yǎng)體系最優(yōu)激素配比，發(fā)現(xiàn)最佳的不定芽分化條件為6-BA 0.8 mg/L和NAA 0.4 mg/L。 對(duì)比發(fā)現(xiàn)，半夏塊莖不定芽的分化增殖均使用6-BA，大多添加有NAA，但濃度配比不同，可能與半夏品種、培養(yǎng)基種類、試驗(yàn)條件等不同相關(guān)。董濤等[12]對(duì)半夏不同等級(jí)株芽進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)和生產(chǎn)性能評(píng)價(jià)研究， 發(fā)現(xiàn)直徑為0.8～1.0 cm 的珠芽適宜于大田栽培；張明等[13]對(duì)不同大小半夏塊莖進(jìn)行種植對(duì)比試驗(yàn)， 發(fā)現(xiàn)直徑為1 cm 左右的半夏塊莖生理活性較強(qiáng)， 抗性較強(qiáng)， 作為種源產(chǎn)量較高， 在經(jīng)濟(jì)上也更實(shí)用。 本試驗(yàn)獲得的半夏塊莖直徑可達(dá)0.94 cm，能直接用于移栽，可以提高種苗的成活率，實(shí)現(xiàn)半夏種苗的快速繁育和高效優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)。

本試驗(yàn)探究了活性炭對(duì)半夏塊莖增殖的影響，發(fā)現(xiàn)活性炭濃度為0.5 g/L 時(shí)， 半夏塊莖直徑和鮮重最大，隨著活性炭濃度的增加，半夏塊莖直徑、鮮重和數(shù)量均降低， 試驗(yàn)結(jié)果與其他研究者的試驗(yàn)結(jié)果類似。 劉慶等[14]以旱半夏為供試材料，研究了活性炭對(duì)半夏增殖的影響，發(fā)現(xiàn)活性炭濃度越高增殖越慢；王曉麗等[15]以垂花百合鱗莖為供試材料，探究了活性炭對(duì)鱗莖膨大影響， 發(fā)現(xiàn)一定量的活性炭對(duì)百合鱗莖膨大具有顯著作用，但隨著濃度升高，直徑和鮮重也隨之降低。 孫靜秋[16]和張彥妮[17]在大巖桐和毛百合的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)同樣的規(guī)律。 分析原因可能是與活性炭的吸附作用有關(guān)，活性炭濃度增加吸附能力增強(qiáng)，不僅吸附培養(yǎng)基和外植體產(chǎn)生的生長(zhǎng)抑制物質(zhì)、瓊脂中的雜質(zhì)及蔗糖經(jīng)高溫產(chǎn)生的有害物質(zhì)， 還吸附培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)或有機(jī)物等[18]。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)半夏塊莖增殖適宜的蔗糖濃度為60 g/L，高于此濃度，半夏塊莖的直徑、鮮重和數(shù)量均降低。 王家福[19]、孫靜秋[16]、張彥妮[17]、張延龍[20]分別在對(duì)百合、大巖桐、毛百合、東方百合的試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)提高蔗糖濃度有利于直徑增加，高于一定濃度時(shí)有抑制作用；孫靜秋[16]的研究中還發(fā)現(xiàn)適當(dāng)提高蔗糖濃度對(duì)鮮重有促進(jìn)作用，而濃度太高，鮮重則降低，這與本試驗(yàn)中得到的結(jié)果一致。 分析原因可能是蔗糖不僅作為碳源，促進(jìn)多糖物質(zhì)的合成和貯藏，還起到調(diào)節(jié)滲透壓作用， 濃度過(guò)高會(huì)影響滲透壓從而抑制植株生長(zhǎng)。