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    負(fù)載3-甲基腺嘌呤介孔二氧化硅的制備與釋藥性能研究

    2024-03-14 03:48:28韓卓越王秀巫業(yè)振胡浩然邢亞群蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥劑科安徽蚌埠33000蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院安徽蚌埠33000
    中南藥學(xué) 2024年2期
    關(guān)鍵詞:去離子水批號(hào)電位

    韓卓越,王秀,巫業(yè)振,胡浩然,邢亞群(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥劑科,安徽 蚌埠 33000;.蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,安徽 蚌埠 33000)

    自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種溶酶體依賴性的細(xì)胞降解途徑,是機(jī)體內(nèi)存在的一種自我修復(fù)和維持生命的過程。自噬可以表現(xiàn)出多種功能形式,包括發(fā)揮促生存作用的細(xì)胞保護(hù)形式、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡的細(xì)胞毒性形式和不具有保護(hù)作用的非保護(hù)形式[1]。3-甲基腺嘌呤(3-MA)是一種非特異性磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑,通常在體外用于抑制自噬[2],可與抗腫瘤藥物聯(lián)合發(fā)揮協(xié)同作用。研究表明早期自噬抑制劑 3-MA的使用可保護(hù)心肌細(xì)胞免受阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性[3]。3-MA 可增強(qiáng)順鉑耐藥下咽鱗狀癌細(xì)胞的化療敏感性[4],還可促進(jìn)埃索美拉唑在胃癌細(xì)胞中的抗增殖活性[5]。廣泛使用3-MA可通過自噬激活顯著降低氯仿對(duì)小鼠的肝毒性[6]。此外,3-MA抑制自噬能夠在體外增強(qiáng)缺氧誘導(dǎo)的人結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡[7]。有研究已證明3-MA在體外和體內(nèi)均可抑制骨肉瘤的生長[8]??梢?-MA在自噬相關(guān)的疾病中發(fā)揮了重要作用,盡管用途廣泛,但 3-MA只有在高濃度時(shí)才有效,并且在室溫下的溶解度很差[9]。因此,更有效、更特異性的遞送自噬抑制劑對(duì)于開發(fā)基于抑制自噬協(xié)同抗腫瘤的輔助治療方法至關(guān)重要。

    在納米技術(shù)領(lǐng)域中已經(jīng)報(bào)道了許多納米載體,其中,介孔二氧化硅(MSN)納米粒子是現(xiàn)階段非常理想的新型藥物載體,其具有獨(dú)特的多孔結(jié)構(gòu),良好的化學(xué)穩(wěn)定性、表面功能性和生物相容性,能確保多種藥物分子的可控釋放和藥物靶向性傳遞[10-11]。在納米載體基礎(chǔ)上通過靶向修飾可以改善藥物利用率,提高治療效果,并減少全身毒性相關(guān)的不良反應(yīng)。骨靶向藥物唑來膦酸(ZOL)是雙膦酸鹽的成員之一,對(duì)骨組織表現(xiàn)出良好的親和力,具有與焦磷酸鹽類似的調(diào)節(jié)骨骼礦化的能力,且比焦磷酸鹽更穩(wěn)定,其主鏈存在兩個(gè)膦酸基,可以與羥基磷灰石表面雙齒結(jié)構(gòu)中的二價(jià)鈣離子進(jìn)行螯合[12-13]。因此,ZOL是治療骨相關(guān)疾病靶向配體的最佳選擇。本研究設(shè)計(jì)了一種將ZOL連接在聚多巴胺(PDA)包覆的MSN納米粒上,并裝載3-MA,通過性質(zhì)表征及藥物在不同條件下的釋放行為研究,初步評(píng)價(jià)其基本性能。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器

    儀器 ZNCL-GS智能磁力攪拌器(上海予申儀器有限公司);5424R離心機(jī)(艾本德生命科學(xué)公司);KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);UV-3600紫外分光光譜儀(島津公司);JEM-2100F透射電子顯微鏡(日本電子公司);IS50紅外分光光譜儀(賽默飛世爾科技公司)。

    1.2 試藥

    3-MA(批號(hào):C13979809)、ZOL(批號(hào):C134-76263)、十六烷基三甲基氯化銨(CTAC,批號(hào):C12197343)、正硅酸乙酯(TEOS,批號(hào):C12561839)、三乙醇胺(TEA,批號(hào):20210507)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF,批號(hào):P2136663)、無水乙醇(批號(hào):2211073501)、鹽酸多巴胺(批號(hào):C12659279)、二甲基亞砜(DMSO,批號(hào):P2087852)(上海麥克林)。N,N'-羰基二咪唑(CDI,批號(hào):K00220563)、NH2-PEG-SH(批號(hào):K00220819)(西安凱新生物)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 納米制劑的制備

    2.1.1 MSN的制備 按照文獻(xiàn)[14]的方法,并進(jìn)行相應(yīng)優(yōu)化,簡要方法如下:取適量CTAC置量瓶中加入去離子水(20 mL)混合均勻,加入TEA(0.06 g),在95℃油浴,攪拌1 h后逐滴加入TEOS(1.5 mL),滴加完畢后繼續(xù)攪拌1 h,冷卻至室溫,離心收集,沉淀醇洗3次。然后在酸性乙醇溶液中60℃冷凝回流4 h,去除致孔模板劑CTAC,離心收集,乙醇洗滌兩次。同樣的提取工藝重復(fù)兩次。離心后的沉淀冷凍干燥24 h,最終得到白色粉末MSN。

    2.1.2 PDA的包覆 參考文獻(xiàn)[15]已有的方法:將100 mg MSN完全溶解在50 mL Tris-HCl緩沖液中(pH 8.5),加入50 mg鹽酸多巴胺,室溫有氧條件下攪拌(200 r·min-1)4~6 h后,離心 10 min,沉淀用去離子水洗滌兩次,最終產(chǎn)物冷凍干燥,記為MSN@PDA。

    2.1.3 MSN@PDA-PEG-ZOL的制備

    ① 活化ZOL:將ZOL(100 mg)與適量TEA溶解在DMF中,加入CDI(90 mg,無水),密閉氮?dú)獗Wo(hù),60℃油浴,攪拌反應(yīng)24 h。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)未反應(yīng)完的TEA。沉淀物用乙腈洗滌兩次以去除多余的CDI,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥,得到純活性沉淀物 ZOL[16]。

    ② 活化ZOL與NH2-PEG-SH連接:將純活性沉淀物ZOL(22.6 mg)溶解在適量DMSO和TEA中,將分子量為2000的NH2-PEG-SH(質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1)滴加到溶液中,在密閉的氮?dú)庀路磻?yīng)12 h。反應(yīng)混合物在蒸餾水中透析48 h以去除多余的活性ZOL,得到ZOL-PEG-SH[17]。

    ③ MSN@PDA-PEG-ZOL的制備:將上述所得化合物溶解在20 mL Tris-HCl緩沖液(pH 8.5)中,加入100 mg MSN@PDA,室溫?cái)嚢柽^夜。然后,將溶液在4℃下以12 000 r·min-1離心10 min,得到MSN@PDA-PEG-ZOL,用去離子水洗滌三次后,冷凍干燥。

    2.2 3-MA的包封率(EE)及載藥量(DL)的測定

    2.2.1 3-MA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 稱取5 mg 3-MA于25 mL量瓶中,加去離子水配制200 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液,取標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成1.56、3.125、6.25、12.5、25、50 μg·mL-1的系列工作液,使用紫外檢測,波長為273 nm。以3-MA濃度(C)設(shè)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明3-MA在1~50 μg·mL-1與峰面積線性關(guān)系良好,回歸方程為A=0.0841C+0.0159(R2=0.9995)。

    2.2.2EE和DL的測定 取3-MA對(duì)照品溶解在去離子水中,分別配制50、100、200、500、1000μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取20 mg MSN 分別放在20 mL的離心管中,依次加入10 mL不同濃度的3-MA標(biāo)準(zhǔn)溶液,水浴超聲至MSN完全分散,室溫下攪拌24 h后,離心收集上清液,用去離子水洗滌沉淀兩次。洗滌液與上清液的合并液用于載藥量和包封率的測定[18];沉淀冷凍干燥后備用,記為MSN@3-MA。

    取合并液適量,0.45 μm微孔濾膜過濾,用去離子水稀釋至適宜濃度,測定其吸光度,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算3-MA濃度,EE和DL分別按公式(1)、(2)計(jì)算。

    式中3-MA的含量記為W1(g),MSN@3-MA稱重記為W2(g),初始3-MA投入量記為W3(g)。

    結(jié)果如圖1和表1所示,3-MA在273 nm處存在特征峰,而MSN@3-MA的UV曲線中存在3-MA的特征峰,證明3-MA加載在納米粒子中。不同3-MA濃度的DL和EE如表1所示,在50~1000μg·mL-1范圍內(nèi),DL隨濃度的增加而增加,濃度在1000 μg·mL-1時(shí),EE為(90.87±0.05)%,DL為(37.55±0.02)%。

    表1 不同濃度3-MA的EE及DLTab 1 Encapsulation rate and drug loading amount of different mass ratios of 3-MA

    圖1 3-MA、MSN、MSN@3-MA的UV圖譜Fig 1 UV spectrum of 3-MA,MSN,and MSN@3-MA

    2.3 MSN@PDA-PEG-ZOL的表征分析

    2.3.1 核磁共振氫譜(1H-NMR)分析 取制得的產(chǎn)物適量,在DMSO中檢測,檢測條件為 500 MHz,利用核磁共振氫譜儀對(duì)樣品進(jìn)行測定。結(jié)果如圖2 所示,ZOL結(jié)構(gòu)中相應(yīng)氫的位置見圖2A,羥基活潑氫在譜圖中未出峰,圖2B中ZOLPEG-SH氫譜圖出現(xiàn)與ZOL結(jié)構(gòu)中相應(yīng)氫的位置一致,證實(shí)兩藥合成成功。

    圖2 ZOL(A)與ZOL-PEG-SH(B)的1H-NMR 譜圖Fig 2 1H-NMR of ZOL(A)and ZOL-PEG-SH(B)

    2.3.2 傅里葉變換紅外光譜(FT-IR) ZOL與NH2-PEG-SH、ZOL-PEG-SH的紅外吸收光譜如圖3所示。ZOL-PEG-SH在3143 cm-1、1580 cm-1、1545 cm-1、629 cm-1出現(xiàn)了與ZOL結(jié)構(gòu)中咪唑環(huán)化學(xué)基團(tuán)的吸收峰一致的峰。在1635 cm-1出現(xiàn)了吸收峰與酰胺(C=O)的伸縮振動(dòng)有關(guān)的吸收峰,表明形成了新的酰胺鍵,證實(shí)了兩藥成功合成。MSN和MSN@PDA、MSN@PDA-PEG-ZOL的FT-IR光譜圖如圖4所示,納米粒子均在1054 cm-1和965 cm-1處出現(xiàn)吸收峰,分別為Si-O-Si伸縮振動(dòng)和硅醇基振動(dòng)。包覆PDA后,在1633 cm-1處的峰歸屬于芳環(huán)骨架的伸縮振動(dòng),3385 cm-1處的寬吸收峰歸屬于N-H/O-H的伸縮振動(dòng),證明PDA包覆在MSN表面。而MSN@PDA-PEG-ZOL在1457 cm-1和1349 cm-1處出現(xiàn)的峰表明目標(biāo)配體ZOL存在于納米粒子表面上。

    圖3 ZOL、NH2-PEG-SH和ZOL-PEG-SH的FT-IR光譜圖Fig 3 FT-IR spectra of ZOL,NH2-PEG-SH and ZOL-PEG-SH

    圖4 MSN、MSN@PDA和MSN@PDA-PEG-ZOL的FT-IR光譜圖Fig 4 FT-IR spectra of MSN,MSN@PDA and MSN@PDA-PEG-ZOL

    2.3.3 透射電子顯微鏡(TEM)分析 取適量納米粒子進(jìn)行了TEM分析,觀察其納米粒子形態(tài)、尺寸大小。從圖5A中可以看到 MSN 表面清晰的介孔結(jié)構(gòu),其形態(tài)為分散均勻的球體,圖5B中可以看到PDA包覆后MSN的表面覆蓋了一層薄膜,介孔結(jié)構(gòu)被掩蓋,表明PDA成功包覆。

    圖5 MSN(A)和MSN @PDA(B)的TEM照片F(xiàn)ig 5 TEM diagram of MSN(A)and MSN@PDA(B)

    2.3.4 馬爾文粒度電位儀分析納米粒子的粒徑及Zeta電位 結(jié)果如圖6所示,MSN的粒徑為118 nm,電位為-(24.2±0.4)mV,MSN@PDA粒徑為148 nm,電位為-(10.8±0.2)mV,MSN@PDA-PEG-ZOL粒徑為(229.1±8.8) nm,電位為-(30.3±0.6)mV,這是由于ZOL在溶液中呈負(fù)電性,也說明ZOL成功修飾在納米粒子表面,納米粒子的多分散性指數(shù)(PDI)在0.21~0.42(在可接受的大小范圍內(nèi))。

    圖6 MSN和MSN@PDA、MSN@PDA-PEG-ZOL的粒徑(A)和電位(B)Fig 6 Particle size(A)and potential(B)of MSN,MSN@PDA and MSN@PDA-PEG-ZOL

    2.3.5 MSN@PDA-PEG-ZOL在水及PBS中的穩(wěn)定性 連續(xù)7 d觀察納米粒子MSN@PDA-PEG-ZOL在37℃的水中及PBS中的穩(wěn)定性,結(jié)果如圖7所示,結(jié)果表明在兩種介質(zhì)中MSN@3-MA-PDA-PEGZOL均能保持良好的粒徑大小,說明納米顆粒在體內(nèi)及體外環(huán)境下都較穩(wěn)定。

    圖7 MSN@PDA-PEG-ZOL在水及PBS中的粒徑Fig 7 Particle size of MSN@PDA-PEG-ZOL in water and PBS

    2.4 體外藥物釋放考察

    考察MSN@3-MA-PDA與MSN@3-MA-PDAPEG-ZOL在不同pH緩沖液中的釋藥性。分別取三組樣品適量,每組平行三份,每份8 mg,精密稱定。于2 mL PBS中超聲至完全溶解,放入透析袋(截?cái)喾肿恿?500)。透析袋浸泡在18 mL的PBS(pH為5.0、6.0、7.4)中,調(diào)整轉(zhuǎn)速為200 r·min-1。于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h 取樣 1 mL,同時(shí)迅速補(bǔ)加同等體積溶出介質(zhì)。使用紫外分光光度法測定3-MA含量,并使用公式(3)計(jì)算出不同時(shí)間累計(jì)釋放率(CRP)。

    式中,Ve為每次所取出的PBS溶液體積(L);V0為緩沖溶液總體積(L);Ci為第i次取出溶液的3-MA濃度(mg·mL-1);n為取液次數(shù);m3-MA為藥物載體所負(fù)載的3-MA總質(zhì)量(mg)。

    如圖8所示,圖8B中MSN@3-MA-PDA-PEGZOL在pH 7.4的PBS溶液中釋藥緩慢,平均釋放率僅為(16.99±0.15)%,而在酸性條件下,3-MA的釋放度增加,在pH 5.0的PBS溶液中釋放率達(dá)到(65.11±1.64)%。說明MSN@3-MA-PDA-PEG-ZOL有利于藥物在腫瘤微環(huán)境中的釋放。

    圖8 MSN@3-MA-PDA(A)與MSN@3-MA-PDA-PEG-ZOL(B)在pH 5.0、6.0、7.4條件下的藥物釋放曲線Fig 8 Release curves of MSN@3-MA-PDA(A)and MSN@3-MAPDA-PEG-ZOL(B)in PBS(pH 5.0,6.0,and 7.4)

    3 討論

    本文使用模板劑法制備了MSN,將PDA包覆MSN納米粒子后,在其表面修飾ZOL與NH2-PEGSH的連接物,制得具有骨靶向性與pH響應(yīng)性的載藥納米顆粒MSN@PDA-PEG-ZOL。通過1H-NMR、FT-IR證實(shí)ZOL與NH2-PEG-SH連接成功。采用TEM、FT-IR、動(dòng)態(tài)光散射粒徑分布儀(DLS)等表征手段對(duì)MSN@PDA-PEG-ZOL合成產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)與性能分析。結(jié)果表明該納米顆粒的粒徑及Zeta電位分別為(229.1±8.8)nm、-(30.3±0.6)mV;通過浸漬離心法負(fù)載3-MA,結(jié)果表明,這種多功能MSN納米顆粒具有高包封率和高載藥量,并在體內(nèi)外具有較好的穩(wěn)定性。

    MSN表面包覆的PDA具有pH響應(yīng)性,在酸性條件下溶解釋放藥物,而本試驗(yàn)的體外釋藥結(jié)果也初步證實(shí)了在腫瘤微環(huán)境中釋藥量明顯高于在正常生理環(huán)境下的釋藥量,這在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。后續(xù)將繼續(xù)深入研究該納米顆粒在小鼠體內(nèi)藥效學(xué)及體內(nèi)外靶向性,進(jìn)一步證實(shí)納米粒子對(duì)腫瘤的靶向性,為后續(xù)骨相關(guān)疾病的治療與自噬抑制劑的遞送奠定研究基礎(chǔ)。

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