不同誘導(dǎo)物對白地霉中高級醇脫氫酶的影響

朱 靜，楊曉聰，陳亞藍，劉海波，陳 龍，鄭雪珂, ，師俊玲

（1.信陽農(nóng)林學(xué)院食品科學(xué)與工程，河南信陽 464000；2.西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，陜西西安 710072）

白地霉是一種常見真菌[1]，在自然界和食品加工中分布廣泛[2-3]，由于其形態(tài)特征介于酵母菌和霉菌之間[4]，且酶系統(tǒng)豐富[5]，生長繁殖快、適應(yīng)性強[1]，因此廣泛用于食品發(fā)酵[6-8]、動物飼養(yǎng)[9]、糧食安全貯藏[10-11]、食品材料[12]、廢水處理[13]、乳制品風(fēng)味形成[14]等領(lǐng)域。高級醇廣泛存在于食品原料及成品中，其含量過高會導(dǎo)致食品風(fēng)味不良，且對人體產(chǎn)生毒害[15]。尤其是高級醇中的正己醇由于會對周圍神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生損傷，而被歸為有毒物質(zhì)。適當(dāng)降低食品中高級醇含量，對改良食品風(fēng)味和提高食品的安全性具有重要意義。前期從土壤中分離的白地霉（Galactomyces geotrichum）S12 能在酸性條件下有效降解高級醇，尤其是正己醇，轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酸類或酯類物質(zhì)，其屬于脫氫酶類[16-18]。研究表明，大部分真核生物的醇脫氫酶都是在缺氧或有醇存在的條件下才能誘導(dǎo)產(chǎn)生[19]。這些能夠直接或間接影響基因轉(zhuǎn)錄表達的化學(xué)因子或物理因子，通常被稱為誘導(dǎo)物[20]。大多數(shù)酶的底物類似物都是該酶合成的誘導(dǎo)物。作為誘導(dǎo)物，必須能到達酶在轉(zhuǎn)錄和表達時所涉及到的調(diào)控位點。多種誘導(dǎo)物能使脫氫酶的表達量增加或產(chǎn)生，如乙醇[21]、四氫糠醇[22]、伯醇、α,ω-二醇或烷烴[23]等。前期研究表明，白地霉中的高級醇脫氫酶也是一種受高級醇誘導(dǎo)才能產(chǎn)生的誘導(dǎo)酶[16]。然而，在已有文獻中，高級醇由于難溶于水，而被認(rèn)為很難直接進入細(xì)胞來誘導(dǎo)相關(guān)酶類的合成[24]。

本文以G.geotrichumS12 為材料，先把高級醇溶于吐溫-80，再將其加入反應(yīng)體系中，從而使高級醇發(fā)揮很好的誘導(dǎo)作用；用五種不同的高級醇作為誘導(dǎo)物，研究了高級醇的種類、劑量和誘導(dǎo)時間三個因素對整個菌體降解不同高級醇類的能力以及相應(yīng)脫氫酶活的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白地霉S12（Galactomyces geotrichumCCTCC AF2012005）由本實驗室分離自土壤，現(xiàn)保存于中國典型微生物保藏中心（武漢，中國）；正丙醇、正丁醇、異丁醇、正己醇、異戊醇 色譜純（純度≥99%），德國Dr.Ehrenstorfer 公司；2×Native Loading buffer 大連寶生物公司；牛血清白蛋白、三羥甲基氨基甲烷、丙烯酰胺、N,N-甲叉雙丙烯聚酰胺、甘氨酸、過硫酸銨、考馬斯亮藍R-250 和G-250、吩嗪硫酸甲酯、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）、氯化硝基四氮唑藍（NBT）優(yōu)級純，美國Amresco 公司；非變性高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn) 美國GE healthcare 公司；其他試劑均為市售分析純。

SW-CJ-2FD 超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；CMQ.J 型立式滅菌器 山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；SPX-300B-Ⅱ生化培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；ZHWY-2102 型恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智誠分析儀器制造公司；AUY220 電子精密天平 日本Shimadzu 公司；HC-3018R 冷凍離心機 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；GC-17A/FID 氣相色譜分析儀 日本Shimadzu 公司；YCZ-24DN 型迷你雙垂直電泳儀（槽）北京市六一儀器廠；UVmini-1240 島津紫外可見分光光度計 日本Shimadzu公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌體的活化與培養(yǎng) 將保存在PDA 斜面上的菌體接種于PDB 培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)，在28 ℃、160 r/min 條件下培養(yǎng)18 h 后，按2.0%的接種量轉(zhuǎn)入PDB 培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，條件為28 ℃、160 r/min、培養(yǎng)時間38 h。所得培養(yǎng)物在5000 r/min、4 ℃下離心10 min，收集菌體，并用無菌水重新懸浮和離心，重復(fù)5 次，以除去粘附在菌體表面的培養(yǎng)液。最后一次在8000 r/min，4 ℃下離心10 min，收集濕菌體，存于-20 ℃?zhèn)溆肹17]。

1.2.2 高級醇對菌體高級醇脫氫酶的誘導(dǎo)作用 將1.2.1 中制備的菌體20 g，加入100 mL、含1.0 g/L正丙醇、正丁醇、異丁醇、正己醇和異戊醇的MSM培養(yǎng)基中，在28 ℃、160 r/min 下培養(yǎng)6 h，將全部培養(yǎng)液在5000 r/min、4 ℃下離心10 min，收集菌體，用無菌水重新懸浮和離心，清洗5 次，最后在8000 r/min、4 ℃下離心10 min，收集菌體備用，即誘導(dǎo)后的菌體。

取上述制備好的菌體0.3 g，加入20 mL 含20 mmol/L 不同高級醇的檸檬酸緩沖溶液（pH4.0、0.1 mol/L）中，在28 ℃下恒溫反應(yīng)1 h，用氣相色譜測定緩沖液中高級醇的剩余量。計算菌體降解活性，表示為每小時的高級醇降解量（mmol/L）。

1.2.3 高級醇誘導(dǎo)時間對高級醇脫氫酶合成的影響

培養(yǎng)時間對菌體生長量的影響：同1.2.2 的處理方法，培養(yǎng)時間分別為0、3、6、9、12 h，測定其在600 nm 處的吸光值（OD600），考察菌體濃度變化；培養(yǎng)時間對菌體降解活性的影響：取10 mL 誘導(dǎo)后培養(yǎng)物，在5000 r/min 下離心10 min，收集菌體，用無菌水清洗3 次后，獲得菌體，同1.2.2 方法測定其對正丙醇、正丁醇、異丁醇、正己醇和異戊醇的降解能力；培養(yǎng)時間對酶活力的影響：取10 mL 培養(yǎng)液中收集所得全部菌體，測定酶活力。取等量上述菌體，液氮充分研磨，1 mL pH5.8 的檸檬酸緩沖溶液（0.1 mol/L）浸提30 min，在8000 r/min下離心10 min，收集上清液，即為粗酶液，分別分析其蛋白濃度、Native-PAGE 電泳條帶、高級醇脫氫酶活性，對照為在相同條件下保溫處理的不加菌體的檸檬酸緩沖液體系。酶活單位（U）定義為每小時的高級醇降解量。酶活力表示為每小時每毫克蛋白降解高級醇的量（U/mg protein）。

1.2.4 高級醇誘導(dǎo)劑量對高級醇脫氫酶合成的影響

按照1.2.3 中的方法，取制備好的菌體加入含不同濃度的正丙醇、正丁醇、異丁醇、正己醇和異戊醇（0.5、1.0、1.5、2.0 和2.5 g/L）的MSM 培養(yǎng)基中，測定指標(biāo)同1.2.3。

1.2.5 不同高級醇誘導(dǎo)產(chǎn)生的相應(yīng)高級醇脫氫酶的對比 為了考察不同高級醇誘導(dǎo)產(chǎn)生的相應(yīng)高級醇脫氫酶是否為同一種酶，將分別在五種不同高級醇的最佳誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生的菌體制備成胞內(nèi)酶粗提液，再將它們同時進行Native-PAGE 電泳分析。取同批次電泳的兩塊膠板，取一塊膠用于考馬斯亮藍R-250 染色，另一塊分割為5 列，分別以五種與菌體誘導(dǎo)時相同的高級醇做底物進行脫氫酶活性染色，然后，再將它們拼接在一起，用凝膠成像照相，分析不同高級醇誘導(dǎo)時所得蛋白條帶的異同。所用各種高級醇的詳細(xì)誘導(dǎo)劑量和時間分別為：正丙醇，1.5 g/L，6 h；正丁醇，1.0 g/L，6 h；異丁醇，0.5 g/L，6 h；正己醇，1.5 g/L，6 h；異戊醇，1.0 g/L，12 h。

1.2.6 正己醇誘導(dǎo)菌體S12 降解高級醇的產(chǎn)物分析

以氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS）分析最適誘導(dǎo)物（正己醇）誘導(dǎo)菌體在檸檬酸緩沖液中的降解產(chǎn)物。將1.2.1中的菌體按照1.2.2 中誘導(dǎo)方法進行誘導(dǎo)，處理條件：誘導(dǎo)劑量1.5 g/L 正己醇，誘導(dǎo)時間6 h。處理好的菌體分別催化含有20 mmol/L 五種不同高級醇、pH4.0 的0.1 mol/L 的檸檬酸緩沖溶液，按照1.2.3的反應(yīng)條件進行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，用GC-MS 進行測定，分別分析正己醇誘導(dǎo)后G.geotrichumS12 催化五種高級醇生成的降解產(chǎn)物。

1.2.7 指標(biāo)測定

1.2.7.1 高級醇的氣相色譜分析 樣品處理[17]：檢測時取2 mL 待測樣放入5 mL 頂空瓶中，每毫升樣品中加入20 μL 內(nèi)標(biāo)（50 g/L 4-甲基-2-戊醇的丙酮溶液）終濃度為9.8 mmol/L，在60 ℃下保溫處理30 min，使氣液平衡，然后用500 μL 微量進樣器在距液面0.3 mm 處吸取300 μL 頂空瓶上層氣體，注入氣相色譜儀中，檢測五種高級醇的殘留量。

色譜條件：色譜柱為彈性石英毛細(xì)管柱DBWAX-10（30 m×0.53 mm，0.30 μm），載氣N2，進樣量300 μL；采取程序升溫，設(shè)初始溫度為55 ℃，在55 ℃下保持3 min；然后15 ℃/min 升至200 ℃，在200 ℃保持3 min。

高級醇降解量的計算方法：對照內(nèi)標(biāo)濃度和峰面積，計算對照樣品和處理樣品中高級醇濃度，按照式（3）和式（4）計算高級醇降解量。

式中：9.8 為內(nèi)標(biāo)的終濃度（mmol/L）；A樣為處理樣品中的高級醇峰面積；A內(nèi)為內(nèi)標(biāo)的峰面積；A0為對照樣品中的高級醇濃度；A1為處理樣品中的高級醇濃度。

1.2.7.2 細(xì)胞光密度（OD600）測定 將分光光度計波長調(diào)整到λ=600 nm，預(yù)熱30 min。以無菌水作為空白對照，測定菌懸液（稀釋10 倍）的吸光值，記為OD600。重復(fù)試驗3 次，按照式（5）計算其平均值，用以表示菌體濃度[25]。

1.2.7.3 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）

參照Stroh 等[26]和Almeida 等[27]方法進行。所用凝膠條件為：5%濃縮膠，10%分離膠；電泳條件為：電壓80 V，樣品到分離膠后改為120 V，60 min 左右。整個電泳過程在4 ℃下進行，電泳結(jié)束后分別用考馬斯亮藍R-250 和脫氫酶活性染色劑染色，該染色劑中底物與誘導(dǎo)用高級醇一致。采用非變性高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，分子量范圍為66～669 kDa。

Native-PAGE 電泳分析是將20 μL 粗酶液與2×Native Loading buffer 進行等比例混合，同時在兩塊電泳凝膠上進行電泳分析[27]。電泳結(jié)束后，一塊用考馬斯亮藍R-250 染色，另一塊用含正丙醇等的脫氫酶活性染色劑染色。用Quantity One 4.6.7 軟件分析凝膠照片上的條帶光密度，用其表示脫氫酶的濃度與活性。

1.2.7.4 蛋白含量的測定 蛋白含量的測定按照Bradford[28]的方法進行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS Statistics 20.0 進行單因素ANOVA 分析和Duncan 檢驗，P＜0.05 表示顯著性差異，使用Excel 2019 整合試驗數(shù)據(jù)，Origin 9.1 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析與制圖，全文試驗設(shè)置3 次平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 高級醇對菌體高級醇脫氫酶的誘導(dǎo)作用

根據(jù)Zhang 等[16]的研究結(jié)果，正己醇是G.geotrichumS12 合成降解正己醇脫氫酶的誘導(dǎo)劑。為了考察正丙醇、正丁醇、異丁醇、正己醇和異戊醇是否也能誘導(dǎo)該菌合成高級醇脫氫酶，用1.0 g/L 正丙醇對菌體進行誘導(dǎo)處理了6 h，結(jié)果如圖1 所示，五種高級醇能誘導(dǎo)該菌株產(chǎn)生可同時作用于多種高級醇的降解活性，但所得菌株對不同高級醇的降解活性有所差異。正丙醇誘導(dǎo)后菌株對不同高級醇降解能力依次為：正丁醇＞正己醇和異戊醇＞正丙醇＞異丁醇；正丁醇為誘導(dǎo)劑時降解能力依次為：正丙醇＞正丁醇＞正己醇＞異戊醇和異丁醇；以異丁醇為誘導(dǎo)劑時，誘導(dǎo)后菌體對各種高級醇的降解能力都有顯著提高（P＜0.05），均高于以正丙醇和正丁醇為誘導(dǎo)劑時所得菌體的降解能力，降解能力依次為：異戊醇＞異丁醇＞正己醇＞正丙醇＞正丁醇。以正己醇為誘導(dǎo)劑時，降解能力依次為：正己醇＞正丁醇＞異丁醇＞正丙醇＞異戊醇，誘導(dǎo)作用與以異丁醇為誘導(dǎo)劑時的結(jié)果接近，對五種高級醇的降解能力均高于以正丙醇和正丁醇為誘導(dǎo)劑時所得菌體的降解能力；而且，其對正己醇和正丁醇的降解能力均高于以異丁醇為誘導(dǎo)劑時所得菌體；但是，對正丙醇、異丁醇和異戊醇的降解能力低于以異丁醇為誘導(dǎo)劑時所得菌體的活性；經(jīng)過異戊醇誘導(dǎo)的菌體降解活性依次為：正丁醇＞正丙醇＞異丁醇＞異戊醇＞正己醇。正己醇和異丁醇對酶的啟動作用則可能是由于有機物介入酶分子的內(nèi)部，通過改變介質(zhì)的介電常數(shù)和酶的空間構(gòu)象來影響酶的催化活性，這種變化可能使酶活性中心的柔性增強，有利于酶功能的發(fā)揮；正丙醇誘導(dǎo)產(chǎn)生的脫氫酶活力低的原因可能是正丙醇的親水性較強，可有效奪取酶周圍的水化層，致使直接或間接由水參與形成的氫鍵、疏水鍵及范德華力等受到破壞，引起酶構(gòu)象的改變，使酶活下降[29]。

圖1 高級醇誘導(dǎo)對菌體S12 高級醇降解能力的影響Fig.1 Effect of higher alcohol induction on the capability of strain S12 to degrade different higher alcohols

2.2 高級醇誘導(dǎo)時間對高級醇脫氫酶合成的影響

2.2.1 正丙醇誘導(dǎo)時間對高級醇脫氫酶合成的影響

以1.0 g/L 正丙醇為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)不同時間后所得菌體降解活性及胞內(nèi)酶活力結(jié)果如圖2 所示。在整個誘導(dǎo)時間內(nèi)，反應(yīng)體系中的OD600隨著誘導(dǎo)時間延長而增大，但在誘導(dǎo)6 h 后，OD600值有所下降。這說明，菌體可利用底物進行生長，當(dāng)6 h 后，因正丙醇被消耗，這種促進能力減少，菌體量有所下降。

圖2 正丙醇誘導(dǎo)時間對菌體和胞內(nèi)酶的正丙醇降解活性的影響Fig.2 Effects of induction time on 1-propanol degrading activity of the strain and enzymes formed by strain S12 with 1-propanol as the inducer

在不同誘導(dǎo)時期所得菌體降解活性和酶活力均表現(xiàn)為：隨著誘導(dǎo)時間的延長，呈先升后降的趨勢。以正丙醇為底物時，誘導(dǎo)6 h 所得酶活力最強，與菌體量的增加時間相吻合；而誘導(dǎo)9 h 菌體降解活性大，滯后于胞內(nèi)酶。這可能是因為胞內(nèi)酶從產(chǎn)生到分泌還需要一定的時間[30]。

從正丙醇誘導(dǎo)產(chǎn)生胞內(nèi)酶的Native-PAGE 電泳結(jié)果可看出（圖3），以正丙醇為誘導(dǎo)劑，且以正丙醇為底物進行脫氫酶特異性染色，所得酶類活性的分析結(jié)果與圖2 中的胞內(nèi)酶活力檢測結(jié)果完全吻合，即6 h 時的蛋白條帶的光密度最大。而且，此時的兩條脫氫酶電泳條帶變粗，幾乎合并在一起，說明其產(chǎn)生酶量大、活性高。

圖3 正丙醇不同誘導(dǎo)時間所得胞內(nèi)酶的Native-PAGE 電泳結(jié)果及其光密度分析Fig.3 Band intensity analysis of Native-PAGE of endoenzymes produced by strain S12 under induction with 1-propanol at different induction time

2.2.2 正丁醇誘導(dǎo)時間對高級醇脫氫酶合成的影響

以1.0 g/L 正丁醇為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)不同時間后所得菌體降解活性及胞內(nèi)酶活力分析結(jié)果如圖4 所示。隨著誘導(dǎo)時間的改變，反應(yīng)體系中的OD600值顯著下降（P＜0.05），說明菌體量在減少，意味著菌體發(fā)生了自溶和損失（圖4）。

圖4 正丁醇誘導(dǎo)時間對菌體和胞內(nèi)酶的正丁醇降解活性的影響Fig.4 Effects of induction time on n-butanol degrading activity of the strain and enzymes formed by strain S12 with n-butanol as the inducer

隨著誘導(dǎo)時間的延長，菌體降解活性開始時略有下降，到9 h 時突然增大，之后又迅速下降；而酶活力則呈先升后降的趨勢，在3～6 h 時達到相對穩(wěn)定的較高值（圖4）?？赡艿脑蚴窃谡T導(dǎo)開始的時間里，能降解正丁醇的脫氫酶在胞內(nèi)有所積累（圖5），胞內(nèi)酶活力升高；正丁醇作為一種有機溶劑，會滲透入細(xì)胞膜，增加膜的流動性，且具有一定的細(xì)胞毒性，會干擾細(xì)胞的正常功能[31]。

圖5 正丁醇不同誘導(dǎo)時間所得胞內(nèi)酶的Native-PAGE 及其光密度分析Fig.5 Band intensity analysis of Native-PAGE of endoenzymes produced by strain S12 under induction with n-butanol at different induction time

胞內(nèi)酶的Native-PAGE 電泳及其條帶光密度分析結(jié)果表現(xiàn)出與胞內(nèi)酶活力相同的變化趨勢（圖5）。誘導(dǎo)9 h 時，原條帶（b）分子量降低，可能是出現(xiàn)酶的降解，此時酶活力也急速下降，但還具有脫氫酶活力，因此脫氫酶電泳能夠染色，到12 h 時，已沒有明顯的脫氫酶條帶存在，酶活力也降至最低，說明能降解正丁醇的脫氫酶條帶主要為（b）。

2.2.3 異丁醇誘導(dǎo)時間對高級醇脫氫酶合成的影響

以1.0 g/L 的異丁醇為誘導(dǎo)劑，分別收集不同誘導(dǎo)時間內(nèi)所得菌體，分別分析菌體降解活性和胞內(nèi)酶活力，結(jié)果如圖6 所示。由圖可看出，OD600隨著誘導(dǎo)時間的延長而下降，說明菌體在異丁醇中受到損傷。

圖6 異丁醇誘導(dǎo)時間對菌體和胞內(nèi)酶的異丁醇降解活性的影響Fig.6 Effects of induction time on isobutanol degrading activity of the strain and enzymes formed by strain S12 with isobutanol as the inducer

除誘導(dǎo)時間6 h 外，不同誘導(dǎo)時間所得菌體降解活性均高于胞內(nèi)酶活力，表現(xiàn)出了與前面三種高級醇不同的作用規(guī)律，且表現(xiàn)出隨著誘導(dǎo)時間的增加而呈先升后降的趨勢，在3～6 h 處表現(xiàn)為相對較高值。這可能是因為菌體對異丁醇的親和性較高，而菌體相對密閉的微環(huán)境保護了胞內(nèi)酶的活性。不同誘導(dǎo)時間所得胞內(nèi)酶活力表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，在6 h時達到最大，之后迅速下降。這可能是因為誘導(dǎo)后期產(chǎn)生異丁醇誘導(dǎo)酶的活性較低（圖7）。

圖7 異丁醇不同誘導(dǎo)時間所得胞內(nèi)酶的Native-PAGE 及其光密度分析Fig.7 Band intensity analysis of Native-PAGE of endoenzymes produced by strain S12 under induction with isobutanol at different induction time

胞內(nèi)酶的Native-PAGE 電泳及其條帶光密度分析結(jié)果（圖7）與胞內(nèi)酶活力曲線一致，誘導(dǎo)6 h 時的活性條帶顏色最深，表明此時該酶的合成量最大。由電泳結(jié)果可看出，用異丁醇誘導(dǎo)9 h 和12 h 時，a、b 兩條帶的光均有所變淡，說明此時的酶發(fā)生了降解，與其異丁醇降解能力的下降完全吻合。

2.2.4 正己醇誘導(dǎo)時間對高級醇脫氫酶合成的影響

以1.0 g/L 正己醇為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)處理不同時間，收集菌體，分別檢測菌體降解活性和胞內(nèi)酶活力，結(jié)果如圖8 所示。隨著誘導(dǎo)時間的延長，所得菌體的OD600呈現(xiàn)先小幅度上升之后趨于不變的趨勢，說明以正己醇為誘導(dǎo)劑時，在誘導(dǎo)過程中對菌體沒有損傷作用。

圖8 正己醇誘導(dǎo)時間對菌體和胞內(nèi)酶的正己醇降解活性的影響Fig.8 Effects of induction time on hexanol degrading activity of the strain and enzymes formed by strain S12 with hexanol as the inducer

同時，隨著誘導(dǎo)時間的增加，所得菌體降解活性在前6 h 時迅速增大，之后趨于平穩(wěn)，和菌體OD600的變化趨勢一致；而胞內(nèi)酶活力則呈先升后降的趨勢，在6 h 時達到最大值（圖8）。

胞內(nèi)酶的Native-PAGE 電泳及其條帶光密度分析結(jié)果（圖9）與胞內(nèi)酶活力相符。正己醇為誘導(dǎo)劑時，其酶含量在3 h 后達到一個穩(wěn)定的狀態(tài)，原條帶（a）在12 h 略有增加，其變化和菌體降解活性曲線一致，但酶活力在12 h 下降很快，可能是作用正己醇的脫氫酶不是（a）條帶。

2.2.5 異戊醇誘導(dǎo)時間對高級醇脫氫酶合成的影響

以1.0 g/L 異戊醇為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)不同時間時所得菌體及其胞內(nèi)酶的異戊醇降解活性如圖10 所示，OD600在誘導(dǎo)過程中隨著時間的增加而有所下降，說明菌體在誘導(dǎo)過程中有所損傷。

圖10 異戊醇誘導(dǎo)時間對菌體和胞內(nèi)酶的異戊醇降解活性的影響Fig.10 Effects of induction time on isoamyl alcohol activity of the strain and enzymes formed by strain S12 with isoamyl alcohol as the inducer

誘導(dǎo)時間越長，所得菌體降解活性越強，其中在誘導(dǎo)時間為3～6 h 時所得菌體降解活性增加幅度較大。此后，再繼續(xù)延長誘導(dǎo)時間對菌體降解活性增加幅度較小，誘導(dǎo)時間為9 h 時，所得菌體降解活性最高。隨著誘導(dǎo)時間的延長，所得胞內(nèi)酶活力呈先升后降再升的趨勢。其中，誘導(dǎo)處理6 h 時所得胞內(nèi)酶活力較強；誘導(dǎo)時間9 h 時胞內(nèi)酶活力最弱；而當(dāng)誘導(dǎo)時間延長至12 h 時，所得菌體胞內(nèi)酶活力突然增強。總體來看，菌體降解活性顯著高于胞內(nèi)酶，說明異戊醇誘導(dǎo)產(chǎn)生的高級醇脫氫酶的穩(wěn)定性較差，需借助于細(xì)菌菌體的完整性，才能較好地發(fā)揮其降解作用（圖10）。

胞內(nèi)酶的Native-PAGE 電泳及其條帶光密度分析結(jié)果如圖11，基本與胞內(nèi)酶活力檢測結(jié)果相吻合。由圖11 還可看出，誘導(dǎo)時間為6 h 時所得酶活力較高，可能是因為條帶（a）的光密度加深引起的；而誘導(dǎo)時間為12 h 時所得酶活力突然增大，可能是因為條帶（b）的光密度加深所致。由此說明，以異戊醇為誘導(dǎo)劑時，產(chǎn)生的（b）條帶具有更高的異戊醇降解活性。

圖11 不同異戊醇誘導(dǎo)時間所得胞內(nèi)酶的Native-PAGE及其光密度分析Fig.11 Analysis of band intensity in Native-PAGE of endoenzyme induced by isoamyl alcohol at different induction time

2.3 高級醇誘導(dǎo)劑量對高級醇脫氫酶合成的影響

2.3.1 正丙醇誘導(dǎo)劑量對高級醇脫氫酶合成的影響

圖12 顯示了以不同濃度的正丙醇為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)6 h 后的菌體降解活性和酶活力及菌體OD600的變化。由圖12 可知，在誘導(dǎo)過程中，反應(yīng)體系中的OD600值隨著誘導(dǎo)劑（正丙醇）濃度的增加而趨于穩(wěn)定。這說明，不同濃度的正丙醇對菌體S12 的生長無顯著影響。

圖12 正丙醇誘導(dǎo)劑量對菌體和胞內(nèi)酶的正丙醇降解活性的影響Fig.12 Effects of 1-propanol concentration on 1-propanol degrading activity of the strain and enzymes formed by strain S12 with1-propanol as the inducer

隨著誘導(dǎo)所用正丙醇濃度的增大，所得菌體降解活性和胞內(nèi)酶活力均呈先升后降的趨勢，并分別在正丙醇濃度為2.0 和1.5 g/L 時達到最大值。同時，胞內(nèi)酶的Native-PAGE 電泳及其條帶光密度分析結(jié)果（圖13），表現(xiàn)出與胞內(nèi)酶活力結(jié)果完全一致的變化趨勢。因此，適當(dāng)增大誘導(dǎo)用正丙醇的濃度，能在一定程度上提高菌體中高級醇脫氫酶的合成量。

圖13 不同正丙醇誘導(dǎo)劑量所得胞內(nèi)酶的Native-PAGE電泳結(jié)果及其光密度分析Fig.13 Band intensity analysis of Native-PAGE of endoenzymes produced by strain S12 under induction with different 1-propanol concentration

綜合分析，正丙醇對菌株S12 合成高級醇脫氫酶的最佳誘導(dǎo)劑量和誘導(dǎo)時間分別為1.5 g/L、6 h。

2.3.2 正丁醇誘導(dǎo)劑量對高級醇脫氫酶合成的影響

圖14 顯示了以不同濃度的正丁醇為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)6 h 后所得菌體降解活性和胞內(nèi)酶活力。隨著正丁醇濃度的增大，OD600值趨于穩(wěn)定，說明不同濃度的正丁醇對菌體生長無顯著影響。

圖14 正丁醇誘導(dǎo)劑量對菌體和胞內(nèi)酶的正丁醇降解活性的影響Fig.14 Effects of n-butanol concentration on n-butanol degrading activity of the strain and enzymes formed by strain S12 with n-butanol as the inducer

菌體降解活性呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢，說明菌體對高濃度正丁醇降解能力較弱；而胞內(nèi)酶活力則隨著誘導(dǎo)用正丁醇濃度的增大而呈先升后降的趨勢，在1.0 g/L 處達到最大值（5.60 U/mg protein）。說明一定劑量的正丁醇能誘導(dǎo)菌體產(chǎn)生正丁醇降解酶，但該酶主要存在于細(xì)胞內(nèi)部；高劑量的正丁醇對菌體有殺傷作用，會導(dǎo)致菌體不能合成正丁醇降解酶。

由胞內(nèi)酶的Native-PAGE 電泳及其條帶光密度分析（圖15）可知，正丁醇為誘導(dǎo)劑時，在濃度為0.5及1.0 g/L 時，蛋白表達量較大，且均為兩條帶，說明能降解正丁醇的脫氫酶除了和能降解正丙醇位置一樣的脫氫酶之外，還存在另一種脫氫酶，這和誘導(dǎo)時間的結(jié)果及胞內(nèi)酶活性曲線的變化一致。

圖15 不同正丁醇誘導(dǎo)劑量所得胞內(nèi)酶的Native-PAGE電泳結(jié)果及其光密度分析Fig.15 Band intensity analysis of Native-PAGE of endoenzymes produced by strain S12 under induction with different n-butanol concentration

綜合分析，正丁醇對菌株S12 合成高級醇脫氫酶的最佳誘導(dǎo)劑量和誘導(dǎo)時間分別為1.0 g/L、6 h。

2.3.3 異丁醇誘導(dǎo)劑量對高級醇脫氫酶合成的影響

圖16 顯示了以不同濃度的異丁醇為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)6 h 時后所得菌體降解活性及其胞內(nèi)酶活力。由圖可知，隨著誘導(dǎo)用異丁醇濃度的增大，所得菌體濃度略微下降，說明異丁醇對菌體生長有損傷作用。

圖16 異丁醇誘導(dǎo)劑量對菌體和胞內(nèi)酶的異丁醇降解活性的影響Fig.16 Effects of isobutanol concentration on isobutanol degrading activity of the strain and enzymes formed by strain S12 with isobutanol as the inducer

由圖16 還可看出，隨著誘導(dǎo)劑異丁醇濃度的增大，所得菌體降解活性呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢，和菌體OD600的變化趨勢一致。因此，異丁醇的濃度越大，所得菌體降解活性越弱。當(dāng)異丁醇的濃度為0.5 g/L時，所得菌體的胞內(nèi)酶活力達到最高值，但其他異丁醇濃度誘導(dǎo)所得胞內(nèi)酶活力均比較低。

胞內(nèi)酶的Native-PAGE 電泳及其條帶光密度分析結(jié)果（圖17）與胞內(nèi)酶活力分析結(jié)果相同。綜合分析，異丁醇誘導(dǎo)菌株S12 合成高級醇脫氫酶的最佳誘導(dǎo)劑量和誘導(dǎo)時間分別為0.5 g/L、6 h。

圖17 不同異丁醇誘導(dǎo)劑量所得胞內(nèi)酶的Native-PAGE及其光密度分析Fig.17 Band intensity analysis of Native-PAGE of endoenzymes produced by strain S12 under induction with different isobutanol concentration

2.3.4 正己醇誘導(dǎo)劑量對高級醇脫氫酶合成的影響

由圖18 可看出，以不同濃度的正己醇為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)6 h 后所得菌體OD600值呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢。

圖18 正己醇誘導(dǎo)劑量對菌體和胞內(nèi)酶的正己醇降解活性的影響Fig.18 Effect of hexanol concentration on hexanol degrading activity of the strain and enzymes formed by strain S12 with hexanol as the inducer

所得菌體降解活性在誘導(dǎo)用正己醇濃度為1.0 g/L 時達到最大值，而在其他的誘導(dǎo)劑量時均相對較低；所得胞內(nèi)酶活力呈先降后升再下降再升的波動趨勢，在正己醇誘導(dǎo)劑量為1.5 g/L 時達到最大值。同時，正己醇的誘導(dǎo)劑量小于1.5 g/L 時，菌體降解活性高于胞內(nèi)酶；誘導(dǎo)劑量大于等于1.5 g/L 時，菌體降解活性小于胞內(nèi)酶（圖18）。

胞內(nèi)酶的Native-PAGE 電泳及其條帶光密度分析（圖19）與胞內(nèi)酶的活性分析結(jié)果相一致。綜合分析，正己醇誘導(dǎo)產(chǎn)生高級醇脫氫酶的最適條件為1.5 g/L、6 h。

圖19 不同正己醇誘導(dǎo)劑量所得胞內(nèi)酶的Native-PAGE及其光密度分析Fig.19 Band intensity analysis of Native-PAGE of endoenzymes produced by strain S12 under induction with different hexanol concentration

2.3.5 異戊醇誘導(dǎo)劑量對高級醇脫氫酶合成的影響

圖20 顯示了以不同濃度的異戊醇為誘導(dǎo)劑時，所得菌體降解活性及其胞內(nèi)酶活力。從圖20 中可看出，異戊醇濃度的增加對OD600幾乎沒有影響，說明增加誘導(dǎo)劑異戊醇濃度對菌體生長沒有顯著影響。

圖20 異戊醇誘導(dǎo)劑量對菌體和胞內(nèi)酶的異戊醇降解活性的影響Fig.20 Effects of isoamyl alcohol concentration on isoamyl alcohol degrading activity of the strain and enzymes formed by strain S12 with isoamyl alcohol as the inducer

誘導(dǎo)劑異戊醇濃度低于1.5 g/L 時，所得菌體降解活性變化很??；而當(dāng)異戊醇濃度高于1.5 g/L 時，菌體降解活性則隨著異戊醇濃度的加大而顯著下降（P＜0.05）。胞內(nèi)酶活力則隨著異戊醇濃度的增大，表現(xiàn)出先增后減再增的波動趨勢。當(dāng)誘導(dǎo)劑濃度為2.5 g/L 時，菌體降解活性很小，而胞內(nèi)酶活力卻很強，說明此時的菌體外圍可能受到了某種損傷，導(dǎo)致其不能作用于異戊醇，而胞內(nèi)的酶類則仍然具有較高的異戊醇降解能力?？傮w來講，當(dāng)異戊醇誘導(dǎo)劑量小于2.0 g/L 時，菌體降解活性大于胞內(nèi)酶；而當(dāng)異戊醇誘導(dǎo)劑量為2.5 g/L 時，胞內(nèi)酶活力則大于完整的菌體（圖20）。

胞內(nèi)酶的Native-PAGE 電泳及其條帶光密度分析結(jié)果（圖21）與胞內(nèi)酶活力檢測結(jié)果相一致。與未誘導(dǎo)的菌體胞內(nèi)酶條帶比，除了0 g/L 和2.0 g/L 異戊醇誘導(dǎo)以外，其他誘導(dǎo)劑量下的誘導(dǎo)后菌體中胞內(nèi)酶增加了一條涂抹帶。結(jié)合胞內(nèi)酶的異戊醇降解活力可推測，這條涂抹帶是由于異戊醇誘導(dǎo)產(chǎn)生的，也是導(dǎo)致胞內(nèi)酶異戊醇降解活性增加的主要原因。綜合分析，異戊醇誘導(dǎo)產(chǎn)生高級醇脫氫酶的最適條件為2.5 g/L、12 h。

圖21 不同異戊醇誘導(dǎo)劑量所得胞內(nèi)酶的Native-PAGE及其光密度分析Fig.21 Analysis of band intensity of Native-PAGE of endoenzymes produced by strain S12 under induction with different isoamyl alcohol concentration

2.4 不同高級醇誘導(dǎo)產(chǎn)生的相應(yīng)高級醇脫氫酶的對比

表1 顯示不同高級醇誘導(dǎo)G.geotrichumS12后，再作用五種高級醇（正丙醇、正丁醇、異丁醇、正己醇和異戊醇）的降解結(jié)果。當(dāng)正己醇和異丁醇作誘導(dǎo)劑時，菌體S12 降解高級醇的能力較強。正丙醇作誘導(dǎo)劑時菌體降解能力最弱。當(dāng)誘導(dǎo)劑為正己醇時，對正己醇和正丁醇的催化活性較強；正丙醇、異丁醇和異戊醇的降解活性較強時的誘導(dǎo)劑為異丁醇，但對正己醇和正丁醇降解活性低，且異丁醇為誘導(dǎo)劑時對菌體及酶有損傷作用。

表1 不同高級醇誘導(dǎo)后的菌株S12 的高級醇降解活性（mmol/L）Table 1 Degrading of higher alcohols by stain S12 induced with different higher alcohols (mmol/L)

不同高級醇誘導(dǎo)產(chǎn)生的相應(yīng)高級醇脫氫酶的電泳結(jié)果如圖22 所示。從圖22 中可以看出，在活性染色膠上（圖22a），用五種不同的高級醇均可誘導(dǎo)產(chǎn)生最上方一條粗的條帶；當(dāng)以正己醇和異戊醇為誘導(dǎo)劑時，該條帶明顯變粗。對照考馬斯亮藍染色（圖22b）可以看出，該條件的分子量約為232 kDa。而且，五種高級醇均可誘導(dǎo)該條帶活性增加。通過計算，該條帶的分子量分布在223 kDa 左右。

圖22 同高級醇誘導(dǎo)所產(chǎn)胞內(nèi)酶的Native-PAGE 電泳圖Fig.22 Native-PAGE of endoenzymes produced by strain S12 under induction with different higher alcohols

2.5 正己醇誘導(dǎo)菌體降解高級醇的產(chǎn)物

以菌體作為酶源應(yīng)用，具有完整的酶系、不需添加輔酶和無需純化等優(yōu)點，且白地霉是一種可添入食品的安全菌。將菌體作為酶源進行應(yīng)用之前，首先要了解菌體代謝高級醇的產(chǎn)物。因此，以最適誘導(dǎo)劑正己醇誘導(dǎo)獲得的菌體分別催化高級醇，采用GCMS 來分析正己醇誘導(dǎo)后菌體催化高級醇（pH4.0、0.1 mol/L 的檸檬酸緩沖溶液）的產(chǎn)物。由圖23 和表2 可看出，正己醇誘導(dǎo)后的G.geotrichumS12 催化五種高級醇的反應(yīng)過程分別為：正丙醇轉(zhuǎn)化為正丙酸；正丁醇轉(zhuǎn)化為丁酸丁酯；異丁醇轉(zhuǎn)化為異丁酸；正己醇轉(zhuǎn)化為正己酸和己酸己酯；異戊醇轉(zhuǎn)化為異戊酸、異戊酸異戊酯和3-甲基-2-丁烯酸-異戊醇酯。因此，在檸檬酸緩沖液中，菌體催化高級醇形成的產(chǎn)物為其相應(yīng)的酸和酯。

表2 菌體S12 在檸檬酸緩沖溶液中降解高級醇生成的產(chǎn)物Table 2 Products formed by strain S12 when it was cultivated in citrate buffer with higher alcohols

圖23 高級醇轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的GC-MS 分析結(jié)果Fig.23 Results of GC-MS analysis of the product of higher alcohols

3 討論與結(jié)論

高級醇作為誘導(dǎo)劑處理白地霉S12，會影響菌體降解活性和酶活力。與相關(guān)研究結(jié)果類似，葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、黎蘆醇等作為誘導(dǎo)劑能提高漆酶活性[32-33]；甲醇、乙醇、正丁醇作為誘導(dǎo)物能促進裂殖壺菌積累油脂、角烯鯊、類胡蘿卜素和蝦青素，主要是因為醇類誘導(dǎo)物可以影響菌體代謝途徑[31-33]。

不同高級醇的最適誘導(dǎo)劑量不同，同時Native-PAGE 電泳結(jié)果說明，高級醇誘導(dǎo)脫氫酶活性提高與脫氫酶的表達有一定的關(guān)系。和相關(guān)報道一致，6 g/L 的丁醇使裂殖壺菌體DNA 降低了40%，角烯鯊含量增加了31 倍，積累了更多的類胡蘿卜素，8 g/L丁醇處理后，蝦青素含量增加了245 倍，說明同一誘導(dǎo)物不同誘導(dǎo)濃度對菌體代謝影響不同[33]。一定濃度范圍內(nèi)Ca2+對纖維素酶的分泌具有誘導(dǎo)作用，但當(dāng)超過一定濃度時會對纖維素酶的合成產(chǎn)生不利影響。較高Ca2+濃度易引起滲透脅迫，對微生物細(xì)胞造成毒害[34]。在5 mmol/L Ca2+激活作用最顯著，纖維素酶FPase（4.20 IU/g）和羧甲基纖維素酶CMCase（18.60 IU/g）酶活水平最高，是對照組的1.3～1.61倍。此條件對應(yīng)的胞外蛋白含量達到13.77 mg/g，半纖維素、纖維素、木質(zhì)素降解率為32.39%、41.23%、22.73%。同時，Ca2+誘導(dǎo)條件下纖維素酶合成相關(guān)基因qPCR 檢測結(jié)果表明，Ca2+處理能上調(diào)這些基因的表達倍數(shù)，但隨著Ca2+濃度進一步升高，抑制了FPase 的合成，F(xiàn)Pase、β-葡萄糖苷酶和CMCase 分別為2.03、4.05 和14.30 IU/g[34]。β-酪醇大于60 mg/L時誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞Ⅱ相脫毒酶NAD（P）H：醌氧化還原酶，有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，同時mRNA表達量增加，其抑制細(xì)胞增殖能力隨著濃度的增加而增加[35]。白藜蘆醇可誘導(dǎo)豬卵巢顆粒細(xì)胞中去乙?；窼IRT1 的表達，加速豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，SIRT1表達與豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡存在一定相關(guān)性。當(dāng)甲醇濃度達到3.2%時蝦青素開始積累，在5.6%時達到峰值，比對照增加了2000 倍。而在5.6%甲醇濃度下，生物量、脂質(zhì)、角鯊烯和總甾醇均有不同程度的下降。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析探討了不同甲醇濃度（0%、3.2%和5.6%）對B4D1 表達譜的影響。在甲醇培養(yǎng)條件下，發(fā)現(xiàn)了三個關(guān)鍵的信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和代謝中起重要作用。五個中心碳代謝相關(guān)基因在5.6%甲醇的作用下顯著下調(diào)，因此預(yù)計會導(dǎo)致用于細(xì)胞生長和合成的ATP 和NADPH 減少。高甲醇條件下，參與脂肪酸和角鯊烯/甾醇前體生物合成的3 個基因顯著下調(diào)，而參與蝦青素合成的香葉二磷酸合成酶、番茄紅素環(huán)化酶和-胡蘿卜素3-羥化酶顯著上調(diào)，導(dǎo)致前體水平升高，最終蝦青素產(chǎn)量增加。此外，三個應(yīng)激反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)[36]。

本文采用五種高級醇（正丙醇、正丁醇、異丁醇、正己醇和異戊醇）誘導(dǎo)白地霉S12 結(jié)果為：當(dāng)正己醇和異丁醇分別作為誘導(dǎo)劑時，白地霉S12 產(chǎn)生的高級醇脫氫酶活性較高，且正己醇為誘導(dǎo)劑時，誘導(dǎo)后菌體及其胞內(nèi)酶的正己醇和正丁醇降解活性高于其他高級醇類。此外，高級醇種類對脫氫酶誘導(dǎo)時間和劑量有所影響。正丙醇、正丁醇、異丁醇和正己醇作為誘導(dǎo)劑時，最適誘導(dǎo)時間均為6 h；而以異戊醇為誘導(dǎo)劑時，最佳誘導(dǎo)時間為12 h。以正丙醇和正己醇為誘導(dǎo)劑時，最適的誘導(dǎo)濃度為1.5 g/L；以正丁醇、異丁醇和異戊醇為誘導(dǎo)劑時，最適誘導(dǎo)濃度分別為1.0、0.5 和2.5 g/L。Native-PAGE 電泳結(jié)果說明，高級醇誘導(dǎo)脫氫酶活性提高與脫氫酶的表達有一定的關(guān)系。本文從蛋白表達水平、菌體細(xì)胞和胞外酶活進行不同高級醇誘導(dǎo)特性分析，但缺少轉(zhuǎn)錄水平的機理探究，后續(xù)還需要從此方面進行研究。