響應(yīng)面法優(yōu)化蠟質(zhì)芽孢桿菌低產(chǎn)正丙醇發(fā)酵工藝

唐 浪,舒 梨,趙興秀,趙長(zhǎng)青

(四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院,四川自貢 643000)

正丙醇作為白酒發(fā)酵過(guò)程中的高沸點(diǎn)副產(chǎn)物,是白酒中的一種香氣物質(zhì)[1],也是白酒中苦味的主要來(lái)源之一[2],其含量過(guò)高不但影響白酒的品質(zhì),還會(huì)影響人體神經(jīng)系統(tǒng)[3]。我國(guó)國(guó)標(biāo)GB/T 10343-2002《食用酒精》中對(duì)其在食用酒精中的含量做了規(guī)定(≤100 mg/L)[4]。如何降低食用酒精中正丙醇的含量,提高食用酒精質(zhì)量,是制酒行業(yè)不可避免的問(wèn)題,極具研究意義。

傅其軍等[5]研究了食用酒精的酒度和生產(chǎn)過(guò)程中精餾塔底溫與正丙醇含量的關(guān)系,并在生產(chǎn)中做出了相應(yīng)優(yōu)化。謝文華[6]研究了正丙醇的性質(zhì)和來(lái)源,并通過(guò)調(diào)整發(fā)酵液組成、優(yōu)化提取工藝等方法降低食用酒精中正丙醇的含量,提高了食用酒精質(zhì)量。羅惠波等[7]采用模擬固態(tài)發(fā)酵的方法,通過(guò)減少水用量、加糠量以及投糧量,增大加曲量,可降低白酒中正丙醇含量。張翠英等[8]把低產(chǎn)正丙醇優(yōu)勢(shì)釀酒酵母工程菌應(yīng)用在小曲酒的釀造中,達(dá)到了降低小曲酒中正丙醇含量的目的?？梢?jiàn),目前相關(guān)領(lǐng)域研究主要體現(xiàn)在白酒生產(chǎn)設(shè)備改進(jìn)、發(fā)酵工藝優(yōu)化以及優(yōu)選釀酒酵母等方面。而將優(yōu)勢(shì)功能芽孢桿菌應(yīng)用至白酒發(fā)酵以降低白酒中正丙醇含量的研究,則鮮有報(bào)道。

針對(duì)這一領(lǐng)域研究的不足,本課題組在之前的試驗(yàn)中從濃香型白酒釀酒大曲和糟醅中分離出了低產(chǎn)正丙醇的功能芽孢桿菌—蠟質(zhì)芽孢桿菌(Bacilluscereus)[9]。在這一基礎(chǔ)上,本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)該B.cereus發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,以期進(jìn)一步降低B.cereus發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的正丙醇含量,為將B.cereus應(yīng)用至濃香型白酒傳統(tǒng)釀造工藝提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠟質(zhì)芽孢桿菌(B.cereus)本實(shí)驗(yàn)室分離和保存,用于蘇氨酸液體發(fā)酵;乙酸丁酯、正丙醇 色譜純,天津市光復(fù)精細(xì)化工所;無(wú)水乙醇 優(yōu)級(jí)純,成都市科隆化學(xué)品有限公司;蛋白胨酵母膏、瓊脂、巴豆酸 分析純,成都市科隆化學(xué)品有限公司。

Agilent 7890A型氣相色譜儀 美國(guó)Agilent公司;DPH-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上?；厶﹥x器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 LB(Luria-Bertani)固體培養(yǎng)基[10]:蛋白胨10 g,酵母膏5 g,氯化鈉10 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH7.0,121 ℃滅菌20 min;

種子培養(yǎng)基:LB液體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,酵母膏5 g,氯化鈉10 g,蒸餾水1000 mL,pH7.0,121 ℃滅菌20 min;

蘇氨酸液體發(fā)酵培養(yǎng)基[11]:葡萄糖30 g,酵母膏1 g,氯化鈉6 g,巴豆酸2 g,蘇氨酸2.5 g,蒸餾水1000 mL,115 ℃滅菌30 min。

1.2.2 種子液的制備 將保存于斜面培養(yǎng)基中的B.cereus取出,接種于LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線,置于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h,以此操作純化3次,并接種斜面于4 ℃保存。將菌株從斜面上取一環(huán)至100 mL已滅菌的種子培養(yǎng)基中,置于37 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng),后將其菌落數(shù)稀釋為107CFU/mL,作為種子液備用。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中正丙醇含量的影響 將蘇氨酸液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH調(diào)為8.0,按5%接種量接入種子液,150 r/min搖床培養(yǎng),于37 ℃下分別發(fā)酵24、36、48、60、72 h。發(fā)酵結(jié)束后,測(cè)定發(fā)酵液中正丙醇含量。

1.2.3.2 接種量對(duì)發(fā)酵液中正丙醇含量的影響 將蘇氨酸液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH調(diào)為8.0,分別按1%、2.5%、5%、7.5%、10%接種量接入種子液,150 r/min搖床培養(yǎng),于37 ℃下發(fā)酵36 h。發(fā)酵結(jié)束后,測(cè)定發(fā)酵液中正丙醇含量。

1.2.3.3 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液中正丙醇含量的影響 將蘇氨酸液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH調(diào)為8.0,按5%接種量接入種子液,150 r/min搖床培養(yǎng),分別于22、27、32、37、42 ℃下發(fā)酵36 h。發(fā)酵結(jié)束后,測(cè)定發(fā)酵液中正丙醇含量。

1.2.3.4 發(fā)酵液初始pH對(duì)發(fā)酵液中正丙醇含量的影響 將蘇氨酸液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,按5%接種量接入種子液,150 r/min搖床培養(yǎng),于32 ℃下發(fā)酵36 h。發(fā)酵結(jié)束后,測(cè)定發(fā)酵液中正丙醇含量。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取發(fā)酵時(shí)間(A)、接種量(B)、發(fā)酵溫度(C)和發(fā)酵液初始pH(D)作為響應(yīng)變量,以正丙醇含量為響應(yīng)值,采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1[12-14]。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.5 正丙醇的測(cè)定方法 色譜條件:色譜柱為DB-WAX(60.0 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細(xì)管色譜柱,進(jìn)樣口溫度210 ℃,檢測(cè)器溫度230 ℃;柱箱升溫程序:起始40 ℃,保持1 min,6 ℃/min升至180 ℃保持2 min,10 ℃/min升至220 ℃,保持5 min,運(yùn)行時(shí)間35 min;載氣:N2,N2∶H2=80∶20,載氣流量:5 mL/min,載氣壓力:0.08 MPa,進(jìn)樣量1 μL。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:分別準(zhǔn)確吸取乙酸丁酯、正丙醇色譜純標(biāo)準(zhǔn)試劑2 mL于100 mL容量瓶中,用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇(超純水稀釋無(wú)水乙醇得到)定容至100 mL,體積分?jǐn)?shù)為2%。準(zhǔn)確吸取體積分?jǐn)?shù)為2%的各標(biāo)準(zhǔn)溶液各3 mL于25 mL容量瓶,用50%乙醇溶液定容至刻度,用于建立系統(tǒng)模板和計(jì)算校正因子。

模板建立和校正因子的計(jì)算:根據(jù)各種物質(zhì)在同一色譜柱和相同儀器條件下有確定不變的保留值,因此可以定性混合標(biāo)準(zhǔn)液中各種成分,確定其出峰順序。取混合標(biāo)準(zhǔn)液1 μL進(jìn)樣色譜分析,進(jìn)樣2次,確定出峰順序,定性混合標(biāo)準(zhǔn)液中各種成分。出峰順序依次為正丙醇、乙酸丁酯(內(nèi)標(biāo))。校正因子=內(nèi)標(biāo)物峰面積×標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度/內(nèi)標(biāo)物濃度/標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰面積。

發(fā)酵液測(cè)定:發(fā)酵液放入高速離心機(jī)中,6000 r/min離心6 min,取上清液過(guò)0.45 μm濾膜后備用。取離心后的發(fā)酵液1.5 mL,加入體積分?jǐn)?shù)為2%的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)物(乙酸丁酯)0.15 mL,內(nèi)標(biāo)物濃度為146.109 mg/100 mL?；靹蚝?再與f值相同條件下測(cè)定。正丙醇濃度=校正因子×正丙醇峰面積×內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度/內(nèi)標(biāo)物峰面積。

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用美國(guó)Microsoft Corporation公司的Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并制成柱狀圖;響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用美國(guó)Stat Ease公司的Design-Expert 8.0.6軟件,統(tǒng)計(jì)差異比較采用軟件中的方程顯著性檢驗(yàn)操作,通過(guò)方差分析檢驗(yàn)(p<0.05)模型及因素的顯著性。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 校正因子

如表2所示,混合標(biāo)準(zhǔn)樣品(正丙醇、乙酸丁酯)中兩種成分相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)<5%,校正因子可靠,適用于香氣成分定量分析[15-17]。

表2 混合標(biāo)準(zhǔn)液的校正因子Table 2 Correction factors for the mixed standard solution

2.2 色譜分析

圖1是混合標(biāo)準(zhǔn)樣品(正丙醇、乙酸丁酯)的氣相色譜離子流色譜圖。由圖1可知,兩種混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的溶液離子流色譜出峰清楚,因此是可信的。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram of mixed standard solution注：1：正丙醇；2：乙酸丁酯。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中正丙醇含量的影響 由圖2可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),發(fā)酵液中正丙醇含量先降低后升高。這是因?yàn)?4 h之前,發(fā)酵處于起始階段,B.cereus在生長(zhǎng)和增殖過(guò)程中產(chǎn)生了一定的正丙醇,導(dǎo)致正丙醇較多。24～48 h時(shí),發(fā)酵液糖分及其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足,B.cereus代謝良好,相應(yīng)正丙醇的產(chǎn)生受到抑制,之前產(chǎn)生的正丙醇又被利用分解,正丙醇含量較低[18]。48 h之后細(xì)菌老化,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏,正丙醇逐漸積累。故選擇發(fā)酵時(shí)間24、36和48 h作為響應(yīng)面試驗(yàn)的優(yōu)化水平。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中正丙醇含量影響Fig.2 Effect of fermentation time on the content of n-propyl alcohol in the fermentation broth

2.3.2 接種量對(duì)發(fā)酵液中正丙醇含量的影響 由圖3可知,隨著接種量的增加,發(fā)酵液中正丙醇含量逐漸降低。這是因?yàn)榻臃N量的增加使得B.cereus繁殖加快,發(fā)酵液的糖分消耗加快,加速了發(fā)酵的完成,從而避免了正丙醇的積累,所以接種量的增大有利于低產(chǎn)正丙醇。但是考慮到實(shí)際運(yùn)用到白酒發(fā)酵時(shí),過(guò)多接種B.cereus會(huì)嚴(yán)重影響白酒的口感,是不可取的[19]。故選擇接種量2.5%、5%和7.5%作為響應(yīng)面試驗(yàn)的優(yōu)化水平。

圖3 接種量對(duì)發(fā)酵液中正丙醇含量的影響Fig.3 Effect of inoculation amount of B. cereus on the content of n-propyl alcohol in the fermentation broth

2.3.3 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液中正丙醇含量的影響 由圖4可知,隨著發(fā)酵溫度的升高,發(fā)酵液中正丙醇含量逐漸升高。這是因?yàn)榘l(fā)酵溫度升高會(huì)加強(qiáng)蛋白質(zhì)分解和促進(jìn)正丙醇的生成。但是過(guò)低的發(fā)酵溫度會(huì)導(dǎo)致B.cereus活性不足,不利于它的正常繁殖和代謝。當(dāng)實(shí)際運(yùn)用到白酒發(fā)酵時(shí)就會(huì)延長(zhǎng)白酒發(fā)酵的主發(fā)酵期,還會(huì)抑制其它香味物質(zhì)的產(chǎn)生,進(jìn)而影響白酒的品質(zhì)[20]。故選擇發(fā)酵溫度為27、32、37 ℃作為響應(yīng)面試驗(yàn)的優(yōu)化水平。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液中正丙醇含量的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the content of n-propyl alcohol in the fermentation broth

2.3.4 發(fā)酵液初始pH對(duì)發(fā)酵液中正丙醇含量的影響 由圖5可知,隨著發(fā)酵液初始pH的升高,發(fā)酵液中正丙醇含量先降低后升高。這是因?yàn)樗嵝院蛪A性條件下B.cereus的正常代謝受到抑制,但是細(xì)菌體內(nèi)產(chǎn)正丙醇的相關(guān)酶卻還具有相當(dāng)?shù)幕钚?它們促進(jìn)了正丙醇的產(chǎn)生,導(dǎo)致發(fā)酵液中正丙醇的積累[21]。中性條件下代謝正常,正丙醇的產(chǎn)生也受到抑制,發(fā)酵液中正丙醇含量較低。故選擇pH為6.0、7.0和8.0作為響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化水平。

圖5 發(fā)酵液初始pH對(duì)發(fā)酵液中正丙醇濃度影響Fig.5 Effect of initial pH of fermentation broth on the content of n-propyl alcohol in the fermentation broth

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface test

將試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Design-Expert軟件進(jìn)行多元擬合,得到了以正丙醇含量為目標(biāo)函數(shù)的回歸方程:Y(正丙醇含量)=0.88-0.10A+0.009B-0.018C-0.021D+0.25AB+0.005AC-0.18AD-0.033BC+0.15BD-0.22CD+0.76A2+0.52B2+0.46C2+0.61D2

響應(yīng)面回歸模型的方差分析見(jiàn)表4。

表4 正丙醇含量響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of the response surface regression model of the concentration of n-propyl alcohol

此外,顯著性檢驗(yàn)表明,對(duì)正丙醇含量的影響次序?yàn)?A(發(fā)酵時(shí)間)>D(發(fā)酵液初始pH)>C(發(fā)酵溫度)>B(接種量)。另外,A發(fā)酵時(shí)間和B接種量的交互項(xiàng)、A發(fā)酵時(shí)間的二次項(xiàng)、B接種量的二次項(xiàng)、C發(fā)酵溫度的二次項(xiàng)、D發(fā)酵液初始pH的二次項(xiàng)對(duì)正丙醇含量的影響極顯著(p<0.001);A發(fā)酵時(shí)間和D發(fā)酵液初始pH的交互項(xiàng)、C發(fā)酵溫度和D發(fā)酵液初始pH的交互項(xiàng)對(duì)正丙醇含量影響高度顯著(p<0.01);A發(fā)酵時(shí)間、B接種量和D發(fā)酵液初始pH的交互項(xiàng)對(duì)正丙醇含量影響顯著(p<0.05);其它因素對(duì)正丙醇含量的影響不顯著(p>0.05)。

根據(jù)回歸方程得到不同因子對(duì)正丙醇含量的響應(yīng)面結(jié)果見(jiàn)圖6。圖6直觀地給出了各個(gè)因子交互作用的響應(yīng)面3D圖和等高線分析圖。響應(yīng)面3D圖曲面坡度陡峭程度越大對(duì)應(yīng)兩因素對(duì)發(fā)酵液中正丙醇含量的影響就越大[22]。此外,等高線形狀也反映了因素之間交互作用的強(qiáng)弱,橢圓程度越高表示兩因素交互作用越顯著,反之表示交互作用不明顯[23]。通過(guò)響應(yīng)面陡峭程度分析發(fā)現(xiàn),A(發(fā)酵時(shí)間)對(duì)正丙醇含量的影響最大,其次是D(發(fā)酵液初始pH)和C(發(fā)酵溫度),B(接種量)對(duì)正丙醇含量的影響最小。通過(guò)等高線分析發(fā)現(xiàn)AB、AD、BD、CD交互作用對(duì)應(yīng)等高線均為橢圓形,說(shuō)明各因素交互作用均顯著(p<0.05),進(jìn)一步分析其橢圓程度,得到各因素交互對(duì)發(fā)酵液中正丙醇含量的影響程度為:AB>CD>AD>BD。與表4方差分析結(jié)果一致。

圖6 各因素互交對(duì)發(fā)酵液中正丙醇含量的影響Fig.6 Effect of the intercross of various factors on the content of n-propyl alcohol in the fermentation broth

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

依據(jù)建立的響應(yīng)面模型,以正丙醇含量最低為優(yōu)化條件,得到最優(yōu)的發(fā)酵工藝條件為:發(fā)酵時(shí)間32.96 h,接種量4.92%,發(fā)酵溫度32.15 ℃,發(fā)酵液初始pH7.04,得到正丙醇含量的預(yù)測(cè)值為0.69 mg/100 mL,考慮到實(shí)際操作的便捷性,將該工藝條件簡(jiǎn)化為發(fā)酵時(shí)間33 h,接種量4.9%,發(fā)酵溫度32 ℃,發(fā)酵液初始pH7.0。按照該簡(jiǎn)化條件進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn),所得發(fā)酵液中正丙醇含量為(0.70±0.0012) mg/100 mL,吻合度達(dá)到98.6%,說(shuō)明該模型很好地預(yù)測(cè)了B.cereus低產(chǎn)正丙醇發(fā)酵工藝條件。

3 結(jié)論與討論

依據(jù)建立的響應(yīng)面模型,以正丙醇含量最低為優(yōu)化條件,結(jié)合實(shí)際情況,得到最優(yōu)的發(fā)酵工藝條件為:發(fā)酵時(shí)間33 h,接種量4.9%,發(fā)酵溫度32 ℃,發(fā)酵液初始pH7.0,此時(shí),發(fā)酵液中正丙醇含量為(0.70±0.0012) mg/100 mL,吻合度達(dá)到預(yù)測(cè)值的98.6%,說(shuō)明該模型很好地預(yù)測(cè)了B.cereus低產(chǎn)正丙醇發(fā)酵工藝條件。

白酒釀造過(guò)程中功能菌影響著窖泥微生物生態(tài)功能及酒糟發(fā)酵生態(tài),從而決定著白酒的質(zhì)量和風(fēng)格[24]。在濃香型白酒的釀造中,釀酒微生物群中的蠟質(zhì)芽孢桿菌作為一種重要的功能菌而存在,它影響著正丙醇在內(nèi)的多種香味物質(zhì)的產(chǎn)生[25]。因此本文基于從濃香型白酒釀酒大曲中篩選出的低產(chǎn)正丙醇B.cereus,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn),運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化得到了最優(yōu)發(fā)酵工藝。該發(fā)酵工藝條件下發(fā)酵液中正丙醇含量符合中國(guó)國(guó)標(biāo)優(yōu)級(jí)酒要求[26]。如果將該B.cereus及發(fā)酵工藝條件應(yīng)用至濃香型白酒傳統(tǒng)釀造工藝,將有利于提高濃香型白酒品質(zhì)。