周瑋玲,李燕燕,邱 菁,趙淋仙,徐純藝,胡慧玲,游 宇
(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 611137)
褐變現(xiàn)象是指產(chǎn)品中的多酚、糖、氨基酸等成分經(jīng)一系列復(fù)雜反應(yīng)后,生成褐色素物質(zhì)的現(xiàn)象,會(huì)嚴(yán)重?fù)p害產(chǎn)品外觀及有效成分含量[1]。因此,抑制褐變、保全產(chǎn)品活性或營(yíng)養(yǎng)成分、控制產(chǎn)品質(zhì)量一直是含鮮品的中藥產(chǎn)品、食品及相關(guān)領(lǐng)域所關(guān)注的重點(diǎn)。
五汁飲源自《溫病條辨》,由梨、荸薺、藕、鮮蘆根、鮮麥冬5 味鮮品組成,具有養(yǎng)陰生津、清熱止渴之功,可解熱、止渴、生津[2-3],方中多酚、多糖等成分是該方發(fā)揮藥效作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[4-5],但目前相關(guān)研究較少[6-8]。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),五汁飲極易發(fā)生褐變現(xiàn)象,其整體顏色變暗并朝紅黃方向演變,推測(cè)其所含的糖類、酚類成分是參與褐變反應(yīng)的關(guān)鍵物質(zhì),同時(shí)鮮品提取液中難以去除的不溶性組分(果膠等) 對(duì)其也有催化作用[9],不利于后續(xù)制劑、藥效學(xué)研究,故控制褐變現(xiàn)象、優(yōu)化前期制備工藝對(duì)保護(hù)該方藥效成分、控制其整體質(zhì)量尤為重要。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化五汁飲褐變抑制工藝,以期為該方進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。
1.1 儀器 H/T20M 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司); RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠); Ci7XX0 色差儀[愛(ài)色麗(上海) 色彩科技有限公司]; BSA124S 電子分析天平[萬(wàn)分之一,賽多利斯科學(xué)儀器(北京) 有限公司]; PS-100A 超聲清洗機(jī)(深圳潔康超聲波清洗器有限公司); 煎藥鍋(潮州市一壺百飲電器實(shí)業(yè)有限公司); UV-3300 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司); JYL-C93T 榨汁攪拌機(jī)(山東九陽(yáng)股份有限公司)。
1.2 試劑與藥物 果膠酶(批號(hào)02220905,酶活性60 000 U/g,食品級(jí),和氏璧生物科技有限公司);L-半胱氨酸(批號(hào)20211128,食品級(jí),河北華陽(yáng)生物科技有限公司);D-異抗壞血酸鈉(批號(hào)20211120,食品級(jí),江西省德興市百勤異VC 鈉有限公司); 植酸(批號(hào)20211206,食品級(jí),桐鄉(xiāng)鑫洋食品添加劑有限公司); 氯化鈣 ( 批號(hào)20211217,食品級(jí),江蘇科倫多食品配料有限公司); 檸檬酸(批號(hào)20211211,食品級(jí),濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司); β-環(huán)糊精(批號(hào)20211228,食品級(jí),孟州市華興生物化工有限責(zé)任公司); 山梨酸鉀(批號(hào)20211115,食品級(jí),山東昆達(dá)生物科技有限公司)。沒(méi)食子酸對(duì)照品(批號(hào)21012903,純度≥99%,成都普菲德生物技術(shù)有限公司); 福林酚(生物級(jí),上海麥克林生化科技有限公司); 無(wú)水碳酸鈉 (分析純,成都市科隆化學(xué)品有限公司)。鮮麥冬 (無(wú)硫) 購(gòu)于四川綿陽(yáng) (批號(hào)20220622),鮮蘆根購(gòu)于河南南陽(yáng) ( 批號(hào)20220614),經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)龍飛副教授鑒定為正品; 藕購(gòu)于湖北洪湖; 荸薺購(gòu)于安徽蕪湖; 皇冠梨購(gòu)于河北。
2.1 復(fù)合褐變抑制劑配比優(yōu)化
2.1.1 褐變抑制率測(cè)定 前期實(shí)驗(yàn)研究表明,五汁飲在第7 天后褐變反應(yīng)趨于平穩(wěn),故本實(shí)驗(yàn)考察抑制劑在7 d 內(nèi)對(duì)整體顏色的保護(hù)作用。根據(jù)課題組前期研究結(jié)果制備五汁飲,選取新鮮、大小均勻、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械損傷的梨70 g、荸薺30 g、藕20 g,去皮,切塊,榨汁,過(guò)濾,4 ℃、5 000 r/min 離心20 min,取上清液; 取麥冬5 g、蘆根8 g,加入10 倍量蒸餾水浸泡30 min 后武火煮沸,再用文火煎煮60 min,合并3 次濾液,濃縮,冷卻至室溫,將上清液和濾液合并,純水定容至100 mL,即得,在4 ℃下放置7 d。選擇25 mm 孔徑板、透射模式對(duì)Ci7XX0 色差儀進(jìn)行黑白校準(zhǔn),測(cè)定亮度值(L?)、紅綠值(a?)、黃藍(lán)值(b?),計(jì)算褐變指數(shù)、褐變抑制率[10-11],公式分別為褐變指數(shù)= [(X-0.31) ×100] /0.172 [X= (a?+1.75×L?) /(5.645×L?+a?-3.012×b?) ]、褐變抑制率= [(BIX1-BIX2) /(BIX1-BIX0) ] ×100% (BIX0、BIX1、BIX2分別為對(duì)照品第0 天、對(duì)照品第7 天、樣品第7 天的褐變指數(shù))。
2.1.2 單因素試驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)[12-14] 報(bào)道及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇檸檬酸、氯化鈣、D-異抗壞血酸鈉、β-環(huán)糊精、植酸、L-半胱氨酸作為抑制劑,以褐變抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)考察其抑制作用。其中,L-半胱氨酸屬于天然抗酶促褐變物質(zhì),對(duì)褐變反應(yīng)有較強(qiáng)的抑制作用[15],將其用量水平設(shè)定為0.30% ~0.50%; 植酸具有抗氧化功能,可清除活性氧,同時(shí)螯合易于催化氧化反應(yīng)的二價(jià)陽(yáng)離子(Fe2+、Cu2+等)[16],將其用量水平設(shè)定為0.1% ~0.3%; 氯化鈣是多酚氧化酶(PPO) 活性抑制劑,其所含的鈣離子與PPO 結(jié)合后可降低后者活性,從而抑制酶促褐變[17],將其用量水平設(shè)定為0.01% ~0.05%;D-異抗壞血酸鈉用量水平設(shè)定為0.25% ~0.45%; β-環(huán)糊精是PPO 活性抑制劑,其內(nèi)部空腔會(huì)與底物形成包合物組織酶后發(fā)生反應(yīng),從而發(fā)揮抑制作用[18],將其用量水平設(shè)定為0.20% ~0.40%; 檸檬酸有3 個(gè)羧基,能有效絡(luò)合體系中的Fe2+、Cu2+等金屬離子,控制其催化氧化反應(yīng)[19],但其酸性較強(qiáng),用量過(guò)高時(shí)會(huì)影響順應(yīng)性[20],將其用量水平設(shè)定為0.60% ~0.75%。結(jié)果見(jiàn)圖1。
圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results for single factor tests
2.1.3 Plackett-Burman 試驗(yàn) 以L-半胱氨酸(A)、檸檬酸(B)、植酸(C)、氯化鈣(D)、D-異抗壞血酸鈉(E)、β-環(huán)糊精(F) 用量為影響因素,褐變抑制率(Y) 為評(píng)價(jià)指標(biāo),結(jié)果見(jiàn)表1。再采用Design-Expert 8.0.6.1 軟件對(duì)表1 數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,得方程為Y=80.19 +0.50A-0.63B+0.66C+0.44D+0.60E-0.40F,方差分析見(jiàn)表2,可知檸檬酸、D-異抗壞血酸鈉、植酸用量有顯著影響(P<0.05)。
表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.1 Design and results for Plackett-Burman tests
表2 Plackett-Burman 試驗(yàn)方差分析結(jié)果Tab.2 Results for analysis of variance for Plackett-Burman tests
2.1.4 Box-Behnken 響應(yīng)面法 在單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman 試驗(yàn)基礎(chǔ)上結(jié)合 《GB 2760-2014食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[21],采用Design Expert 8.0軟件,以植酸(A)、檸檬酸(B)、D-異抗壞血酸鈉(C) 用量為影響因素,褐變抑制率(Y) 為評(píng)價(jià)指標(biāo),因素水平見(jiàn)表3,結(jié)果見(jiàn)表4。
表3 Box-Behnken 響應(yīng)面法因素水平(Ⅰ)Tab.3 Factors and levels for Box-behnken response surface method (Ⅰ)
表4 Box-Behnken 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)與結(jié)果(Ⅰ)Tab.4 Design and results for Box-Behnken response surface method (Ⅰ)
采用Design Expert 8.0 軟件對(duì)表4 數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,得方程為Y=89.31-0.88A-0.57B+0.94C- 0.078AB- 0.012AC- 0.34BC- 1.73A2+0.15B2-1.75C2,方差分析見(jiàn)表5。由此可知,模型P<0.05,具有高度顯著性; 失擬項(xiàng)P>0.05,表明模型失擬項(xiàng)不顯著; 相關(guān)系數(shù)R2為0.857 8,表明模型能解釋85.78%響應(yīng)值的變化,可用于預(yù)測(cè)分析。
表5 Box-Behnken 響應(yīng)面法方差分析結(jié)果(Ⅰ)Tab.5 Results for analysis of variance for Box-Behnken response surface method (Ⅰ)
響應(yīng)面分析見(jiàn)圖2。由此可知,各因素之間存在一定正向交互作用,表現(xiàn)為簡(jiǎn)單非線性關(guān)系; 因素A、C、A2、C2有顯著影響(P<0.05); 各因素影響程度依次為C>A>B。最終確定,最優(yōu)配比為植酸用量0.015%,檸檬酸用量0.75%,D-異抗壞血酸鈉用量0.34%,預(yù)測(cè)褐變抑制率為90.06%。
圖2 各因素響應(yīng)面圖(Ⅰ)Fig.2 Response surface plots for various factors (Ⅰ)
2.2 酶解澄清工藝優(yōu)化 五汁飲含有大量花青素類成分,在貯存過(guò)程中易受溫度、光照等因素影響形成不溶性沉淀物,高速離心法、醇沉法均不能將其完全去除。課題組前期研究表明,果膠酶可有效去除不溶性組分,故本實(shí)驗(yàn)選擇其作為酶解試劑。
2.2.1 多酚含量測(cè)定 參照文獻(xiàn) [22] 報(bào)道,采用福林酚法。取0.1 mL 樣品,置于10 mL 量瓶中,加入0.5 mL 福林酚試劑、1.5 mL 15%Na2CO3溶液,充分混勻,蒸餾水定容至刻度,75 ℃水浴15 min,在760 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,平行3 次。以吸光度為縱坐標(biāo)(A),對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X) 進(jìn)行回歸,得方程為A=82.607X-0.007 4(R2=0.999 4),在0.000 ~0.007 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2.2.2 出膏率測(cè)定 取20 mL 樣品,放到干燥至恒重的蒸發(fā)皿中,水浴蒸干,置于105 ℃干燥箱中干燥3 h,每隔1 h 稱定質(zhì)量直至恒重,計(jì)算出膏率,公式為出膏率= (干膏質(zhì)量/藥材質(zhì)量×稀釋倍數(shù)) ×100%。
2.2.3 澄清度測(cè)定 參考文獻(xiàn)[23] 報(bào)道,以蒸餾水為空白凋零,取澄清后樣品,在680 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A,計(jì)算透光率T(即澄清度),公式為A=-lgT。
2.2.4 Box-Behnken 響應(yīng)面法 采用Design Expert 8.0 軟件,以果膠酶用量(A)、酶解溫度(B)、酶解時(shí)間(C) 為影響因素,綜合評(píng)分(Y) 為評(píng)價(jià)指標(biāo),因素水平見(jiàn)表6,結(jié)果見(jiàn)表7。
表6 Box-Behnken 響應(yīng)面法因素水平(Ⅱ)Tab.6 Factors and levels for Box-behnken response surface method (Ⅱ)
表7 Box-Behnken 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)與結(jié)果(Ⅱ)Tab.7 Design and results for Box-Behnken response surface method (Ⅱ)
采用Design Expert8.0 軟件對(duì)表7 數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,得方程為Y=89.41-0.42A+2.59B+0.27C+0.79AB+1.15AC+0.48BC-0.64A2-1.18B2-0.17C2,方差分析見(jiàn)表8。由此可知,模型P<0.01,具有高度顯著性; 失擬項(xiàng)P>0.05,表明模型失擬項(xiàng)不顯著; 相關(guān)系數(shù)R2為0.919 2,表明模型能解釋91.92% 響應(yīng)值的變化,可用于預(yù)測(cè)分析。
表8 Box-Behnken 響應(yīng)面法方差分析結(jié)果(Ⅱ)Tab.8 Results for analysis of variance for Box-Behnken response surface method (Ⅱ)
響應(yīng)面分析見(jiàn)圖3。由此可知,各因素之間存在一定正向交互作用,其中B、B2、AC有顯著影響(P<0.05); 各因素影響程度依次為B>A>C。最終確定,最優(yōu)工藝為果膠酶用量0.23%,酶解溫度54.13 ℃,酶解時(shí)間135 min,預(yù)測(cè)澄清度為80.95%,出膏率為8.11%,多酚含量為0.389 5 mg/mL,綜合評(píng)分為91.28 分。
圖3 各因素響應(yīng)面圖(Ⅱ)Fig.3 Response surface plots for various factors (Ⅱ)
2.2.5 權(quán)重系數(shù)確定
2.2.5.1 AHP 法 將澄清度、多酚含量、出膏率作為指標(biāo),結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)[24] 報(bào)道擬定其重要性依次為澄清度>多酚含量=出膏率,構(gòu)建優(yōu)先判斷矩陣,見(jiàn)表9。結(jié)果,上述指標(biāo)權(quán)重系數(shù)分別為0.448 15、0.294 44、0.257 41,CR =0.018<0.10,表明三者權(quán)重具有一致性。
表9 各指標(biāo)優(yōu)先判斷矩陣Tab.9 Priority judgment matrices for various indices
2.2.5.2 CRITIC 法 將數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)量綱化處理,即X′ij= (Xj-Xmin) /(Xmax-Xmin),并按如下公式計(jì)算指標(biāo)權(quán)重,結(jié)果見(jiàn)表10。
表10 CRITIC 權(quán)重計(jì)算結(jié)果Tab.10 Results for CRITIC weight calculation
2.2.5.3 AHP-CRITIC 復(fù)合加權(quán)法 在“2.2.5.1”“2.2.5.2” 項(xiàng)基礎(chǔ)上計(jì)算綜合權(quán)重W綜合ij[25],公式為。結(jié)果,澄清度、多酚含量、出膏率綜合權(quán)重分別為0.428 6、0.363 5、0.207 9。
2.2.5.4 綜合評(píng)價(jià) 分別采用AHP 法、CRITIC法、AHP-CRITIC 復(fù)合加權(quán)法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),結(jié)果見(jiàn)表11,可知3 種賦權(quán)方法所得綜合評(píng)分接近。再采用SPSS 26.0 軟件對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析,測(cè)得AHP 法與AHP-CRITIC 復(fù)合加權(quán)法之間的相關(guān)系數(shù)為0.978,CRITIC 法與AHP-CRITIC 復(fù)合加權(quán)法之間的相關(guān)系數(shù)為0.936,AHP 法與CRITIC 法之間的相關(guān)系數(shù)為0.853,均有顯著性差異(P<0.05),但在權(quán)重系數(shù)方面,AHP 法與CRITIC 法之間的相關(guān)系數(shù)為-0.316,無(wú)顯著差異(P>0.05),表明兩者所展示的信息無(wú)疊加,即AHP-CRITIC 復(fù)合加權(quán)法更科學(xué)合理。
表11 3 種賦權(quán)方法綜合評(píng)分(分)Tab.11 Comprehensive scores for three weighting methods (score)
2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)
2.3.1 復(fù)合褐變抑制劑配比 按“2.1.1” 項(xiàng)下方法制備3 批樣品,按“2.1.4” 項(xiàng)下優(yōu)化配比添加復(fù)合褐變抑制劑,在4 ℃下放置7 d 后測(cè)定褐變抑制率,結(jié)果見(jiàn)表12。由此可知,平均褐變抑制率為89.54%,與預(yù)測(cè)值90.06% 接近(相對(duì)偏差為0.52%),表明該配方穩(wěn)定可靠,可有效抑制褐變。
表12 復(fù)合褐變抑制劑配比驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Tab.12 Results for verification tests for proportion of composite browning inhibitors (n=3)
2.3.2 酶解澄清工藝 按“2.1.1” 項(xiàng)下方法制備3 批樣品,按“2.2.4” 項(xiàng)下優(yōu)化工藝酶解澄清,測(cè)定多酚含量、出膏率、澄清度,計(jì)算綜合評(píng)分,結(jié)果見(jiàn)表13。由此可知,平均綜合評(píng)分為91.42 分,與預(yù)測(cè)值91.28 分接近(相對(duì)偏差為0.77%),表明該工藝穩(wěn)定可靠,可有效去除不溶物,并保留有效成分。
表13 酶解澄清工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Tab.13 Results for verification tests for enzymatic hydrolysis and clarification process (n=3)
2.3.3 整體工藝評(píng)價(jià) 僅添加復(fù)合褐變抑制劑時(shí),樣品在貯存后第2 天即出現(xiàn)大量沉淀,搖之不散;在酶解澄清前不添加復(fù)合褐變抑制劑時(shí),樣品酶解后褐變指數(shù)顯著升高,樣品整體上呈棕褐色; 先添加復(fù)合褐變抑制劑再酶解澄清時(shí),樣品顏色均一穩(wěn)定,室溫下放置72 h 無(wú)沉淀,褐變指數(shù)未明顯升高,表明兩者共同發(fā)揮抑制褐變的作用。
3.1 復(fù)合褐變抑制劑篩選 研究表明,天然植物和真菌提取物具有抑制褐變的潛力[26-29],但其制備工藝復(fù)雜,難以應(yīng)用于工業(yè)化大生產(chǎn)。目前,控制產(chǎn)品褐變的常用方法為添加復(fù)合褐變抑制劑,可針對(duì)褐變反應(yīng)不同機(jī)制發(fā)揮單一或復(fù)合的抑制作用[12-19]。本實(shí)驗(yàn)在前期文獻(xiàn)查閱、市場(chǎng)調(diào)研的基礎(chǔ)上結(jié)合藥品、食品相關(guān)法規(guī)要求,采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合抑制劑配伍,得到最優(yōu)組成為0.015%植酸,0.75%檸檬酸,0.34%D-異抗壞血酸鈉,可有效緩解五汁飲褐變。
3.2 澄清工藝篩選 研究表明,不溶性組分對(duì)褐變反應(yīng)進(jìn)程具有促進(jìn)作用[9]。課題組前期發(fā)現(xiàn),合適的澄清工藝對(duì)阻止褐變進(jìn)程具有積極意義,而果膠酶可有效去除五汁飲中不溶性成分; 本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上,采用AHP-CRITIC 復(fù)合加權(quán)法結(jié)合Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解澄清工藝,得到最優(yōu)工藝為0.23%果膠酶,酶解時(shí)間135 min,酶解溫度55 ℃,可有效去除五汁飲中的不溶物,與復(fù)合褐變抑制劑共同抑制褐變反應(yīng)進(jìn)程。
本實(shí)驗(yàn)首先采用Box-Behnken 響應(yīng)面法對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行建模,對(duì)因素不同水平進(jìn)行分析,再通過(guò)AHP-CRITIC 復(fù)合加權(quán)法進(jìn)行權(quán)重設(shè)計(jì),篩選復(fù)合褐變抑制劑配方,優(yōu)化酶解澄清工藝參數(shù),最終得到最優(yōu)五汁飲褐變抑制工藝。驗(yàn)證試驗(yàn)表明,所得結(jié)果真實(shí)可靠,工藝穩(wěn)定可行,可為后續(xù)相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。