五汁飲褐變抑制工藝優(yōu)化

周瑋玲，李燕燕，邱 菁，趙淋仙，徐純藝，胡慧玲，游 宇

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137）

褐變現(xiàn)象是指產(chǎn)品中的多酚、糖、氨基酸等成分經(jīng)一系列復(fù)雜反應(yīng)后，生成褐色素物質(zhì)的現(xiàn)象，會(huì)嚴(yán)重?fù)p害產(chǎn)品外觀及有效成分含量［1］。因此，抑制褐變、保全產(chǎn)品活性或營(yíng)養(yǎng)成分、控制產(chǎn)品質(zhì)量一直是含鮮品的中藥產(chǎn)品、食品及相關(guān)領(lǐng)域所關(guān)注的重點(diǎn)。

五汁飲源自《溫病條辨》，由梨、荸薺、藕、鮮蘆根、鮮麥冬5 味鮮品組成，具有養(yǎng)陰生津、清熱止渴之功，可解熱、止渴、生津［2-3］，方中多酚、多糖等成分是該方發(fā)揮藥效作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)［4-5］，但目前相關(guān)研究較少［6-8］。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，五汁飲極易發(fā)生褐變現(xiàn)象，其整體顏色變暗并朝紅黃方向演變，推測(cè)其所含的糖類、酚類成分是參與褐變反應(yīng)的關(guān)鍵物質(zhì)，同時(shí)鮮品提取液中難以去除的不溶性組分（果膠等） 對(duì)其也有催化作用［9］，不利于后續(xù)制劑、藥效學(xué)研究，故控制褐變現(xiàn)象、優(yōu)化前期制備工藝對(duì)保護(hù)該方藥效成分、控制其整體質(zhì)量尤為重要。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化五汁飲褐變抑制工藝，以期為該方進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 H/T20M 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）； RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）； Ci7XX0 色差儀［愛(ài)色麗（上海） 色彩科技有限公司］； BSA124S 電子分析天平［萬(wàn)分之一，賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］； PS-100A 超聲清洗機(jī)（深圳潔康超聲波清洗器有限公司）； 煎藥鍋（潮州市一壺百飲電器實(shí)業(yè)有限公司）； UV-3300 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）； JYL-C93T 榨汁攪拌機(jī)（山東九陽(yáng)股份有限公司）。

1.2 試劑與藥物 果膠酶（批號(hào)02220905，酶活性60 000 U/g，食品級(jí)，和氏璧生物科技有限公司）；L-半胱氨酸（批號(hào)20211128，食品級(jí)，河北華陽(yáng)生物科技有限公司）；D-異抗壞血酸鈉（批號(hào)20211120，食品級(jí)，江西省德興市百勤異VC 鈉有限公司）； 植酸（批號(hào)20211206，食品級(jí)，桐鄉(xiāng)鑫洋食品添加劑有限公司）； 氯化鈣 （ 批號(hào)20211217，食品級(jí)，江蘇科倫多食品配料有限公司）； 檸檬酸（批號(hào)20211211，食品級(jí)，濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司）； β-環(huán)糊精（批號(hào)20211228，食品級(jí)，孟州市華興生物化工有限責(zé)任公司）； 山梨酸鉀（批號(hào)20211115，食品級(jí)，山東昆達(dá)生物科技有限公司）。沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)21012903，純度≥99%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司）； 福林酚（生物級(jí)，上海麥克林生化科技有限公司）； 無(wú)水碳酸鈉 （分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）。鮮麥冬 （無(wú)硫） 購(gòu)于四川綿陽(yáng) （批號(hào)20220622），鮮蘆根購(gòu)于河南南陽(yáng) （ 批號(hào)20220614），經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)龍飛副教授鑒定為正品； 藕購(gòu)于湖北洪湖； 荸薺購(gòu)于安徽蕪湖； 皇冠梨購(gòu)于河北。

2 方法與結(jié)果

2.1 復(fù)合褐變抑制劑配比優(yōu)化

2.1.1 褐變抑制率測(cè)定 前期實(shí)驗(yàn)研究表明，五汁飲在第7 天后褐變反應(yīng)趨于平穩(wěn)，故本實(shí)驗(yàn)考察抑制劑在7 d 內(nèi)對(duì)整體顏色的保護(hù)作用。根據(jù)課題組前期研究結(jié)果制備五汁飲，選取新鮮、大小均勻、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械損傷的梨70 g、荸薺30 g、藕20 g，去皮，切塊，榨汁，過(guò)濾，4 ℃、5 000 r/min 離心20 min，取上清液； 取麥冬5 g、蘆根8 g，加入10 倍量蒸餾水浸泡30 min 后武火煮沸，再用文火煎煮60 min，合并3 次濾液，濃縮，冷卻至室溫，將上清液和濾液合并，純水定容至100 mL，即得，在4 ℃下放置7 d。選擇25 mm 孔徑板、透射模式對(duì)Ci7XX0 色差儀進(jìn)行黑白校準(zhǔn)，測(cè)定亮度值（L?）、紅綠值（a?）、黃藍(lán)值（b?），計(jì)算褐變指數(shù)、褐變抑制率［10-11］，公式分別為褐變指數(shù)＝ ［（X－0.31） ×100］ /0.172 ［X＝ （a?＋1.75×L?） /（5.645×L?＋a?－3.012×b?） ］、褐變抑制率＝ ［（BIX1－BIX2） /（BIX1－BIX0） ］ ×100% （BIX0、BIX1、BIX2分別為對(duì)照品第0 天、對(duì)照品第7 天、樣品第7 天的褐變指數(shù)）。

2.1.2 單因素試驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)［12-14］ 報(bào)道及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇檸檬酸、氯化鈣、D-異抗壞血酸鈉、β-環(huán)糊精、植酸、L-半胱氨酸作為抑制劑，以褐變抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)考察其抑制作用。其中，L-半胱氨酸屬于天然抗酶促褐變物質(zhì)，對(duì)褐變反應(yīng)有較強(qiáng)的抑制作用［15］，將其用量水平設(shè)定為0.30% ～0.50%； 植酸具有抗氧化功能，可清除活性氧，同時(shí)螯合易于催化氧化反應(yīng)的二價(jià)陽(yáng)離子（Fe2＋、Cu2＋等）［16］，將其用量水平設(shè)定為0.1% ～0.3%； 氯化鈣是多酚氧化酶（PPO） 活性抑制劑，其所含的鈣離子與PPO 結(jié)合后可降低后者活性，從而抑制酶促褐變［17］，將其用量水平設(shè)定為0.01% ～0.05%；D-異抗壞血酸鈉用量水平設(shè)定為0.25% ～0.45%； β-環(huán)糊精是PPO 活性抑制劑，其內(nèi)部空腔會(huì)與底物形成包合物組織酶后發(fā)生反應(yīng)，從而發(fā)揮抑制作用［18］，將其用量水平設(shè)定為0.20% ～0.40%； 檸檬酸有3 個(gè)羧基，能有效絡(luò)合體系中的Fe2＋、Cu2＋等金屬離子，控制其催化氧化反應(yīng)［19］，但其酸性較強(qiáng)，用量過(guò)高時(shí)會(huì)影響順應(yīng)性［20］，將其用量水平設(shè)定為0.60% ～0.75%。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results for single factor tests

2.1.3 Plackett-Burman 試驗(yàn) 以L-半胱氨酸（A）、檸檬酸（B）、植酸（C）、氯化鈣（D）、D-異抗壞血酸鈉（E）、β-環(huán)糊精（F） 用量為影響因素，褐變抑制率（Y） 為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表1。再采用Design-Expert 8.0.6.1 軟件對(duì)表1 數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得方程為Y＝80.19 ＋0.50A－0.63B＋0.66C＋0.44D＋0.60E－0.40F，方差分析見(jiàn)表2，可知檸檬酸、D-異抗壞血酸鈉、植酸用量有顯著影響（P＜0.05）。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.1 Design and results for Plackett-Burman tests

表2 Plackett-Burman 試驗(yàn)方差分析結(jié)果Tab.2 Results for analysis of variance for Plackett-Burman tests

2.1.4 Box-Behnken 響應(yīng)面法 在單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman 試驗(yàn)基礎(chǔ)上結(jié)合 《GB 2760-2014食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》［21］，采用Design Expert 8.0軟件，以植酸（A）、檸檬酸（B）、D-異抗壞血酸鈉（C） 用量為影響因素，褐變抑制率（Y） 為評(píng)價(jià)指標(biāo)，因素水平見(jiàn)表3，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 Box-Behnken 響應(yīng)面法因素水平（Ⅰ）Tab.3 Factors and levels for Box-behnken response surface method （Ⅰ）

表4 Box-Behnken 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)與結(jié)果（Ⅰ）Tab.4 Design and results for Box-Behnken response surface method （Ⅰ）

采用Design Expert 8.0 軟件對(duì)表4 數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得方程為Y＝89.31－0.88A－0.57B＋0.94C－ 0.078AB－ 0.012AC－ 0.34BC－ 1.73A2＋0.15B2－1.75C2，方差分析見(jiàn)表5。由此可知，模型P＜0.05，具有高度顯著性； 失擬項(xiàng)P＞0.05，表明模型失擬項(xiàng)不顯著； 相關(guān)系數(shù)R2為0.857 8，表明模型能解釋85.78%響應(yīng)值的變化，可用于預(yù)測(cè)分析。

表5 Box-Behnken 響應(yīng)面法方差分析結(jié)果（Ⅰ）Tab.5 Results for analysis of variance for Box-Behnken response surface method （Ⅰ）

響應(yīng)面分析見(jiàn)圖2。由此可知，各因素之間存在一定正向交互作用，表現(xiàn)為簡(jiǎn)單非線性關(guān)系； 因素A、C、A2、C2有顯著影響（P＜0.05）； 各因素影響程度依次為C＞A＞B。最終確定，最優(yōu)配比為植酸用量0.015%，檸檬酸用量0.75%，D-異抗壞血酸鈉用量0.34%，預(yù)測(cè)褐變抑制率為90.06%。

圖2 各因素響應(yīng)面圖（Ⅰ）Fig.2 Response surface plots for various factors （Ⅰ）

2.2 酶解澄清工藝優(yōu)化 五汁飲含有大量花青素類成分，在貯存過(guò)程中易受溫度、光照等因素影響形成不溶性沉淀物，高速離心法、醇沉法均不能將其完全去除。課題組前期研究表明，果膠酶可有效去除不溶性組分，故本實(shí)驗(yàn)選擇其作為酶解試劑。

2.2.1 多酚含量測(cè)定 參照文獻(xiàn) ［22］ 報(bào)道，采用福林酚法。取0.1 mL 樣品，置于10 mL 量瓶中，加入0.5 mL 福林酚試劑、1.5 mL 15%Na2CO3溶液，充分混勻，蒸餾水定容至刻度，75 ℃水浴15 min，在760 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，平行3 次。以吸光度為縱坐標(biāo)（A），對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行回歸，得方程為A＝82.607X－0.007 4（R2＝0.999 4），在0.000 ～0.007 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 出膏率測(cè)定 取20 mL 樣品，放到干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置于105 ℃干燥箱中干燥3 h，每隔1 h 稱定質(zhì)量直至恒重，計(jì)算出膏率，公式為出膏率＝ （干膏質(zhì)量/藥材質(zhì)量×稀釋倍數(shù)） ×100%。

2.2.3 澄清度測(cè)定 參考文獻(xiàn)［23］ 報(bào)道，以蒸餾水為空白凋零，取澄清后樣品，在680 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A，計(jì)算透光率T（即澄清度），公式為A＝－lgT。

2.2.4 Box-Behnken 響應(yīng)面法 采用Design Expert 8.0 軟件，以果膠酶用量（A）、酶解溫度（B）、酶解時(shí)間（C） 為影響因素，綜合評(píng)分（Y） 為評(píng)價(jià)指標(biāo)，因素水平見(jiàn)表6，結(jié)果見(jiàn)表7。

表6 Box-Behnken 響應(yīng)面法因素水平（Ⅱ）Tab.6 Factors and levels for Box-behnken response surface method （Ⅱ）

表7 Box-Behnken 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)與結(jié)果（Ⅱ）Tab.7 Design and results for Box-Behnken response surface method （Ⅱ）

采用Design Expert8.0 軟件對(duì)表7 數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得方程為Y＝89.41－0.42A＋2.59B＋0.27C＋0.79AB＋1.15AC＋0.48BC－0.64A2－1.18B2－0.17C2，方差分析見(jiàn)表8。由此可知，模型P＜0.01，具有高度顯著性； 失擬項(xiàng)P＞0.05，表明模型失擬項(xiàng)不顯著； 相關(guān)系數(shù)R2為0.919 2，表明模型能解釋91.92% 響應(yīng)值的變化，可用于預(yù)測(cè)分析。

表8 Box-Behnken 響應(yīng)面法方差分析結(jié)果（Ⅱ）Tab.8 Results for analysis of variance for Box-Behnken response surface method （Ⅱ）

響應(yīng)面分析見(jiàn)圖3。由此可知，各因素之間存在一定正向交互作用，其中B、B2、AC有顯著影響（P＜0.05）； 各因素影響程度依次為B＞A＞C。最終確定，最優(yōu)工藝為果膠酶用量0.23%，酶解溫度54.13 ℃，酶解時(shí)間135 min，預(yù)測(cè)澄清度為80.95%，出膏率為8.11%，多酚含量為0.389 5 mg/mL，綜合評(píng)分為91.28 分。

圖3 各因素響應(yīng)面圖（Ⅱ）Fig.3 Response surface plots for various factors （Ⅱ）

2.2.5 權(quán)重系數(shù)確定

2.2.5.1 AHP 法 將澄清度、多酚含量、出膏率作為指標(biāo)，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)［24］ 報(bào)道擬定其重要性依次為澄清度＞多酚含量＝出膏率，構(gòu)建優(yōu)先判斷矩陣，見(jiàn)表9。結(jié)果，上述指標(biāo)權(quán)重系數(shù)分別為0.448 15、0.294 44、0.257 41，CR ＝0.018＜0.10，表明三者權(quán)重具有一致性。

表9 各指標(biāo)優(yōu)先判斷矩陣Tab.9 Priority judgment matrices for various indices

2.2.5.2 CRITIC 法 將數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)量綱化處理，即X′ij＝ （Xj－Xmin） /（Xmax－Xmin），并按如下公式計(jì)算指標(biāo)權(quán)重，結(jié)果見(jiàn)表10。

表10 CRITIC 權(quán)重計(jì)算結(jié)果Tab.10 Results for CRITIC weight calculation

2.2.5.3 AHP-CRITIC 復(fù)合加權(quán)法 在“2.2.5.1”“2.2.5.2” 項(xiàng)基礎(chǔ)上計(jì)算綜合權(quán)重W綜合ij［25］，公式為。結(jié)果，澄清度、多酚含量、出膏率綜合權(quán)重分別為0.428 6、0.363 5、0.207 9。

2.2.5.4 綜合評(píng)價(jià) 分別采用AHP 法、CRITIC法、AHP-CRITIC 復(fù)合加權(quán)法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表11，可知3 種賦權(quán)方法所得綜合評(píng)分接近。再采用SPSS 26.0 軟件對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，測(cè)得AHP 法與AHP-CRITIC 復(fù)合加權(quán)法之間的相關(guān)系數(shù)為0.978，CRITIC 法與AHP-CRITIC 復(fù)合加權(quán)法之間的相關(guān)系數(shù)為0.936，AHP 法與CRITIC 法之間的相關(guān)系數(shù)為0.853，均有顯著性差異（P＜0.05），但在權(quán)重系數(shù)方面，AHP 法與CRITIC 法之間的相關(guān)系數(shù)為－0.316，無(wú)顯著差異（P＞0.05），表明兩者所展示的信息無(wú)疊加，即AHP-CRITIC 復(fù)合加權(quán)法更科學(xué)合理。

表11 3 種賦權(quán)方法綜合評(píng)分（分）Tab.11 Comprehensive scores for three weighting methods （score）

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

2.3.1 復(fù)合褐變抑制劑配比 按“2.1.1” 項(xiàng)下方法制備3 批樣品，按“2.1.4” 項(xiàng)下優(yōu)化配比添加復(fù)合褐變抑制劑，在4 ℃下放置7 d 后測(cè)定褐變抑制率，結(jié)果見(jiàn)表12。由此可知，平均褐變抑制率為89.54%，與預(yù)測(cè)值90.06% 接近（相對(duì)偏差為0.52%），表明該配方穩(wěn)定可靠，可有效抑制褐變。

表12 復(fù)合褐變抑制劑配比驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab.12 Results for verification tests for proportion of composite browning inhibitors （n＝3）

2.3.2 酶解澄清工藝 按“2.1.1” 項(xiàng)下方法制備3 批樣品，按“2.2.4” 項(xiàng)下優(yōu)化工藝酶解澄清，測(cè)定多酚含量、出膏率、澄清度，計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)表13。由此可知，平均綜合評(píng)分為91.42 分，與預(yù)測(cè)值91.28 分接近（相對(duì)偏差為0.77%），表明該工藝穩(wěn)定可靠，可有效去除不溶物，并保留有效成分。

表13 酶解澄清工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab.13 Results for verification tests for enzymatic hydrolysis and clarification process （n＝3）

2.3.3 整體工藝評(píng)價(jià) 僅添加復(fù)合褐變抑制劑時(shí)，樣品在貯存后第2 天即出現(xiàn)大量沉淀，搖之不散；在酶解澄清前不添加復(fù)合褐變抑制劑時(shí)，樣品酶解后褐變指數(shù)顯著升高，樣品整體上呈棕褐色； 先添加復(fù)合褐變抑制劑再酶解澄清時(shí)，樣品顏色均一穩(wěn)定，室溫下放置72 h 無(wú)沉淀，褐變指數(shù)未明顯升高，表明兩者共同發(fā)揮抑制褐變的作用。

3 討論

3.1 復(fù)合褐變抑制劑篩選 研究表明，天然植物和真菌提取物具有抑制褐變的潛力［26-29］，但其制備工藝復(fù)雜，難以應(yīng)用于工業(yè)化大生產(chǎn)。目前，控制產(chǎn)品褐變的常用方法為添加復(fù)合褐變抑制劑，可針對(duì)褐變反應(yīng)不同機(jī)制發(fā)揮單一或復(fù)合的抑制作用［12-19］。本實(shí)驗(yàn)在前期文獻(xiàn)查閱、市場(chǎng)調(diào)研的基礎(chǔ)上結(jié)合藥品、食品相關(guān)法規(guī)要求，采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合抑制劑配伍，得到最優(yōu)組成為0.015%植酸，0.75%檸檬酸，0.34%D-異抗壞血酸鈉，可有效緩解五汁飲褐變。

3.2 澄清工藝篩選 研究表明，不溶性組分對(duì)褐變反應(yīng)進(jìn)程具有促進(jìn)作用［9］。課題組前期發(fā)現(xiàn)，合適的澄清工藝對(duì)阻止褐變進(jìn)程具有積極意義，而果膠酶可有效去除五汁飲中不溶性成分； 本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，采用AHP-CRITIC 復(fù)合加權(quán)法結(jié)合Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解澄清工藝，得到最優(yōu)工藝為0.23%果膠酶，酶解時(shí)間135 min，酶解溫度55 ℃，可有效去除五汁飲中的不溶物，與復(fù)合褐變抑制劑共同抑制褐變反應(yīng)進(jìn)程。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首先采用Box-Behnken 響應(yīng)面法對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行建模，對(duì)因素不同水平進(jìn)行分析，再通過(guò)AHP-CRITIC 復(fù)合加權(quán)法進(jìn)行權(quán)重設(shè)計(jì)，篩選復(fù)合褐變抑制劑配方，優(yōu)化酶解澄清工藝參數(shù)，最終得到最優(yōu)五汁飲褐變抑制工藝。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，所得結(jié)果真實(shí)可靠，工藝穩(wěn)定可行，可為后續(xù)相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。