益智對(duì)TREM2 調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)作用

彭 景，楊云方，張 悅，吳 博，賈 英，顏廷旭

（沈陽(yáng)藥科大學(xué)功能食品與葡萄酒學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016）

小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)性疾病的發(fā)生、發(fā)展和終止過(guò)程中起著重要調(diào)節(jié)作用，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞有M1 型（促炎性） 和M2 型（抗炎型） 2 種表型［1］。M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)誘導(dǎo)腫瘤壞死因子-α （TNF-α）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（iNOS） 等促炎細(xì)胞因子及促炎蛋白釋放量的增加，它們均為M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞激活的標(biāo)記物［2-3］。活化的M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)促進(jìn)抗炎介質(zhì)白細(xì)胞介素-10 （IL-10）、精氨酸酶-1 （Arg-1） 等以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)，從而促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的恢復(fù)和重塑進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)，這些蛋白也均為M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物［4-7］，且這些促炎和抗炎介質(zhì)的水平反應(yīng)了小膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)。在正常生理?xiàng)l件下，小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)一種相對(duì)靜止的監(jiān)測(cè)表型，然而當(dāng)免疫穩(wěn)態(tài)受到干擾或神經(jīng)炎癥發(fā)生時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞就會(huì)進(jìn)行無(wú)數(shù)次涉及細(xì)胞表型的調(diào)節(jié)過(guò)程，并分泌多種細(xì)胞因子以反映腦內(nèi)狀態(tài)［8-10］。研究表明，益智提取物可以通過(guò)抑制神經(jīng)炎癥發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［11-16］。但目前沒(méi)有關(guān)于益智是否可以抑制M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞活化并促進(jìn)M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞激活的相關(guān)研究。故本實(shí)驗(yàn)以益智為研究對(duì)象，探討其對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)作用，以期為其深入研究提供參考。

1 材料

1.1 藥物 益智購(gòu)于北京同仁堂遼寧藥店有限責(zé)任公司，產(chǎn)地海南，生產(chǎn)廠家為亳州市京皖中藥飲片廠，經(jīng)沈陽(yáng)藥科大學(xué)功能食品與葡萄酒學(xué)院賈英教授鑒定為Alpinia oxyphyllaMiq.的干燥成熟果實(shí)。

1.2 細(xì)胞 小鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞BV2 由沈陽(yáng)藥科大學(xué)續(xù)繁星老師提供。

1.3 試劑 DMEM 高糖培養(yǎng)基、BCA 蛋白定量試劑盒、放射性免疫沉淀分析 （RIPA） 裂解液、苯甲基磺酰氯（PMSF） 蛋白酶抑制劑、蛋白磷酸酶抑制劑復(fù)合物（×100）、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）快速配制試劑盒、超敏ECL 發(fā)光劑、BSA、脂多糖（LPS）購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司（批號(hào)MA0212、MA0082、MA0153、MA0001、MB12707-1、MA0159、MA0186、MB4219、MB5198）； 上樣緩沖液（5×） 購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)P0015L）； Arg-1 抗體、磷酸肌醇-3-激酶（PI3K） 抗體、蛋白激酶（Akt） 抗體、磷酸化蛋白激酶 （p-Akt） 抗體購(gòu)自美國(guó)ProteinTech 公司 （批號(hào)66129-1-Ig、67121-1-Ig、60203-2-Ig、66444-1-Ig）； 鈣離子結(jié)合受體分子-1 （Iba-1） 抗體、iNOS 抗體、β-actin 抗體、FITC 山羊抗兔、CY3 山羊抗兔、488 山羊抗兔購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司（批號(hào)ab178846、ab178945、ab8226、ab6717、ab6939、ab150077）； siRNA 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自長(zhǎng)春金傳科技有限公司（批號(hào)R19425015）。

1.4 儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱、生物超凈工作臺(tái)、Spectra Max M2 型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo 公司）； 冷凍離心機(jī)、高壓滅菌鍋（長(zhǎng)沙市湘儀離心機(jī)儀器有限公司）； 轉(zhuǎn)膜裝置、電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 益智提取物制備 取益智粉碎，過(guò)4 號(hào)篩，95%乙醇回流提取3 次（液料比10 ∶1），每次2 h，用八層紗布過(guò)濾提取液，減壓旋蒸、干燥，得益智干燥浸膏，得率16.47%，于涼暗處保存。取適量浸膏溶于無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PBS） 中，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL （生藥量） 的溶液，分裝于0.5 mL EP 管中，－20 ℃避光儲(chǔ)存。取適量LPS 溶于DMSO 中，制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的溶液，分裝于0.5 mL EP 管中，－20 ℃避光保存。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將于－80 ℃或液氮中冷凍保存的BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞復(fù)蘇后，取細(xì)胞培養(yǎng)瓶于顯微鏡下觀察，當(dāng)BV2 細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶底面積的90%時(shí)進(jìn)行傳代，傳代后于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞冷凍保存，條件為4 ℃30 min，－20 ℃1 h，－80 ℃冷凍。以復(fù)蘇后的細(xì)胞作為第一代細(xì)胞，選擇第3 ～15 代BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力 取BV2 細(xì)胞，以1×104/mL 密度接種于無(wú)菌96 孔板中，培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞長(zhǎng)至96 孔板底面積的70%時(shí)，設(shè)置對(duì)照組、模型組和給藥組，每組3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，除對(duì)照組外，每孔均加入5 mg/mL LPS，使其質(zhì)量濃度為1 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，給藥組加入 100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 μg/mL 益智提取物溶液。作用24 h 后每孔均加入20 μL MTT （5 mg/mL） 培養(yǎng)4 h，加入100 μL 由SDS 10 g、異丁醇5 mL、10 mol/L HCl 0.1 mL 配制的溶液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。次日，將96 孔板放在搖床上快速振蕩5 min，待紫色結(jié)晶充分溶解，于570 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.4 Griess 比色法檢測(cè)NO 水平 按“2.3” 項(xiàng)下方法處理并收集細(xì)胞。取每孔細(xì)胞上清液50 μL 轉(zhuǎn)移至另一無(wú)菌96孔板中。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線組，將3×9 個(gè)孔分別加入50 μL 細(xì)胞完全培養(yǎng)液，每孔均加入不同體積的標(biāo)準(zhǔn)液，標(biāo)準(zhǔn)曲線組濃度梯度分別為0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol/L。每孔按順序加入50 μL 2 種顯色液，于540 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。

2.5 Western blot 法檢測(cè)iNOS、Arg-1、Akt、p-Akt、PI3K蛋白表達(dá) 取BV2 細(xì)胞，以5×105/mL 密度接種于無(wú)菌6孔板中，培養(yǎng)24 h。按“2.3” 項(xiàng)下方法處理并收集細(xì)胞，加入RIPA 裂解液，每孔100 μL，收集蛋白上清液，使用BCA 蛋白定量試劑盒將各組蛋白濃度調(diào)整一致，加上樣緩沖液混合均勻，沸水加熱3～5 min 使蛋白變性。將蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)移至NC 膜或PVDF 膜上。5% 脫脂牛奶封閉2 h，加入iNOS （1 ∶1 000）、Arg-1 （1 ∶5 000）、Akt （1 ∶800）、p-Akt （1 ∶800）、PI3K （1 ∶1 000）、βactin （1 ∶2 500） 一抗4 ℃孵育過(guò)夜。TBST 洗滌3 次，加入相應(yīng)二抗室溫孵育1.5 ～2 h，洗滌3 次。顯影、定影、沖洗、晾干，以β-actin 為內(nèi)參，對(duì)各組條帶進(jìn)行分析，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.6 ELISA 法檢測(cè)IL-10、TNF-α 水平 按“2.3” 項(xiàng)下方法處理并收集細(xì)胞，使用BCA 蛋白定量試劑盒定量，按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IL-10、TNF-α 水平。

2.7 細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)Iba-1、Arg-1 水平 取BV2 細(xì)胞，以1×105/mL 密度接種于無(wú)菌6 孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至96 孔板底面積的6%時(shí)，按“2.3” 項(xiàng)下方法處理并收集細(xì)胞，去除上清液后每孔加入1 mL PBS，清洗細(xì)胞2 次。4%多聚甲醛透化，PBS 清洗3 次。室溫下加入5%牛血清白蛋白（BSA） 封閉細(xì)胞1 h，每孔加入100 μL Iba-1 （1 ∶300）、Arg-1 （1 ∶400） 抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，清洗3 次。每孔加入100 μL 二抗稀釋液（1 ∶300），室溫作用1 h。在暗室中，載玻片上滴加含DAPI 的抗熒光衰減劑2 滴，取出爬片，倒扣至抗熒光衰減劑上，避光條件下使用正置熒光顯微鏡觀察、拍照。

2.8 髓樣細(xì)胞表達(dá)觸發(fā)受體-2 （TREM2） 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 取BV2 細(xì)胞，以1×105/mL 密度接種于無(wú)菌6 孔板中，每孔加入完全培養(yǎng)基2 mL，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞密度為60%時(shí)，將完全培養(yǎng)液更換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。設(shè)置對(duì)照組、LPS 組、益智組 （益智提取物＋LPS）、轉(zhuǎn)染對(duì)照組（NC＋益智提取物＋LPS）、轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組（5 μL TREM2-siRNA＋益智提取物＋LPS）。按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，培養(yǎng)4 h，加入LPS （5 mg/mL） 使每孔LPS 質(zhì)量濃度為1 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，收集細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.9 RT-qPCR 法檢測(cè)IL-10、Arg-1、TNF-α、Iba-1 mRNA 表達(dá) 按“2.3” 項(xiàng)下方法處理并收集細(xì)胞，益智給藥質(zhì)量濃度為100 μg/mL，每個(gè)濃度設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA 并合成cDNA，反應(yīng)體系為95 ℃35 s，60 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 益智提取物對(duì)BV2 細(xì)胞活力的影響 如圖1 所示，在0～100 μg/mL 范圍內(nèi)，益智提取物對(duì)BV2 細(xì)胞的存活率無(wú)影響。因此，選擇0～100 μg/mL 濃度范圍內(nèi)的益智提取物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 益智提取物對(duì)BV2 細(xì)胞活力的影響（±s，n＝3）

3.2 益智提取物對(duì)LPS 誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞NO 水平的影響 如圖2 所示，與對(duì)照組比較，1 μg/mL LPS 處理的BV2 細(xì)胞中NO 水平升高（P＜0.01）； 與LPS 組比較，3.125 ～25 μg/mL 益智提取物對(duì)LPS 誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞釋放的NO 無(wú)抑制作用，當(dāng)質(zhì)量濃度為50、100 μg/mL 時(shí)，可抑制NO 釋放（P＜0.01），并呈劑量依賴(lài)性。提示益智提取物可抑制LPS 誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞中NO 的釋放。因此，選擇50、100 μg/mL 益智提取物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.3 TREM2-siRNA 序列篩選 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了3 條TREM2-siRNA 序列，分別標(biāo)為251、411、430。通過(guò)RT-qPCR 和Western blot 法檢測(cè)TREM2 mRNA 和蛋白表達(dá)，篩選抑制TREM2 表達(dá)效率最高的序列。如圖3 所示，與對(duì)照組比較，NC 組（一段不會(huì)對(duì)目的基因有影響的si-RNA 序列，是TREM2-siRNA 轉(zhuǎn)染組的對(duì)照組） 并沒(méi)有對(duì)TREM2 mRNA 的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響； 與NC 組比較，在TREM2-siRNA的3 個(gè)序列中，只有siT2-430 組TREM2 mRNA 的轉(zhuǎn)錄被抑制，抑制效率大概為50%； 與對(duì)照組比較，NC 組同樣沒(méi)有對(duì)TREM2 蛋白表達(dá)產(chǎn)生影響（P＞0.05）； 與NC 組比較，siT2-411 組和siT2-430 組TREM2 蛋白的表達(dá)均降低（P＜0.05，P＜0.01），其中siT2-430 更加有效地抑制了TREM2蛋白表達(dá)。因此，將選擇siT2-430 的TREM2-siRNA 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 轉(zhuǎn)染TREM2-siRNA BV2 細(xì)胞的TREM2 表達(dá)（±s，n＝3）

3.4 益智對(duì)LPS 誘導(dǎo)的TREM2-siRNA BV2 細(xì)胞M1 和M2型標(biāo)記物mRNA 表達(dá)的影響 如圖4 所示，與對(duì)照組比較，LPS 組BV2 細(xì)胞IL-10、Arg-1 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01），TNF-α、Iba-1 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01）； 與LPS 組比較，益智組BV2 細(xì)胞IL-10、Arg-1 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01），TNF-α、Iba-1 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01）； 與轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組BV2 細(xì)胞IL-10、Arg-1 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），TNF-αmRNA 表達(dá)升高（P＜0.01）。

圖4 益智提取物對(duì)LPS 誘導(dǎo)的TREM2-siRNA BV2 細(xì)胞TNF-α、IL-10、Arg-1、Iba-1 mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝7）

3.5 益智對(duì)LPS 誘導(dǎo)的TREM2-siRNA BV2 細(xì)胞M1 和M2型標(biāo)記蛋白表達(dá)的影響 如圖5 所示，與對(duì)照組比較，LPS組Iba-1 蛋白表達(dá)增加，Arg-1 蛋白的表達(dá)無(wú)影響； 與轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組對(duì)Iba-1 蛋白表達(dá)的抑制作用和對(duì)Arg-1 蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用均被部分抑制。如圖6 所示，與對(duì)照組比較，LPS 組BV2 細(xì)胞IL-10、Arg-1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），M1 型標(biāo)記蛋白TNF-α、iNOS 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）； 與LPS 組比較，益智組BV2 細(xì)胞IL-10、Arg-1蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），TNF-α、iNOS 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）； 與轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組BV2細(xì)胞IL-10、Arg-1 蛋白表達(dá)降低 （P＜0.05，P＜0.01），TNF-α、iNOS 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 益智提取物對(duì)LPS 誘導(dǎo)的TREM2-siRNA BV2 細(xì)胞Arg-1、Iba-1 蛋白表達(dá)的影響

圖6 益智提取物對(duì)LPS 誘導(dǎo)的TREM2-siRNA BV2 細(xì)胞TNF-α、IL-10、iNOS、Arg-1 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝7）

3.6 益智對(duì)LPS 誘導(dǎo)的TREM2-siRNA BV2 細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路的影響 如圖7 所示，與對(duì)照組比較，LPS 組BV2細(xì)胞PI3K、p-Akt/Akt 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）； 與LPS 組比較，益智組BV2 細(xì)胞PI3K、p-Akt/Akt 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）； 與轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組BV2 細(xì)胞PI3K、p-Akt/Akt 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），表明益智可通過(guò)TREM2 膜蛋白，激活PI3K/Akt 信號(hào)通路以調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。

圖7 益智提取物對(duì)LPS 誘導(dǎo)的TREM2-siRNA BV2 細(xì)胞PI3K、p-Akt、Akt 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）

4 討論

小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的巨噬細(xì)胞，對(duì)神經(jīng)炎癥具有調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，益智可以改變M1 和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白的表達(dá)以調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞表型。有研究表明，TREM2 是一種細(xì)胞跨膜蛋白，并且該蛋白高度表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞中［17］。小膠質(zhì)細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化在很大程度上依賴(lài)于TREM2 受體蛋白，該蛋白表達(dá)提高后的抗炎作用已經(jīng)在幾種不同的細(xì)胞系和組織中得到證實(shí)。

通過(guò)TREM2-siRNA 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)益智對(duì)不同表型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Arg-1、Iba-1、TNF-α、IL-10 mRNA 表達(dá)以及小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明M1 向M2型小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化是由TREM2 蛋白調(diào)控的。TREM2 可以激活PI3K/Akt 通路，促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化［18-19］。進(jìn)一步對(duì)PI3K/Akt 通路的蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)益智可能介導(dǎo)TREM2 蛋白進(jìn)而激活PI3K/Akt 信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。

益智為四大南藥之一，主要分布于廣東和海南。益智含有多種化合物，包括萜類(lèi)、庚烷類(lèi)、甾醇類(lèi)以及具有抗炎生物活性的黃酮類(lèi)成分，如白楊素和楊芽黃素等［20］。有研究表明，白楊素通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用［21-22］，由此猜測(cè)白楊素可能是益智中主要調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化的主要成分。但是白楊素是否具有這種作用還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。