浙貝母提取液在大鼠尿液、糞便中的原型成分及代謝產(chǎn)物分析

宗 政，胡 揚(yáng)，王 昊，王金宏，楊 波，胡玲玲，程 斌，周愛珍，李文蘭?

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076； 2.浙江藥科職業(yè)大學(xué)中藥學(xué)院，浙江 寧波 315100）

浙貝母為百合科浙貝母FritillariathunbergiiMiq.的干燥鱗莖，名列“浙八味” 之首，是我國傳統(tǒng)的道地藥材之一，常用于治療風(fēng)熱咳嗽、肺癰、乳癰、瘰疬、瘡毒，腫瘤等疾?。?-3］。迄今為止，從浙貝母中已經(jīng)鑒定出數(shù)百種化學(xué)成分［4］。研究表明，浙貝母生物堿類成分為其抗炎、抗氧化及抗腫瘤的潛在活性成分［5-7］，貝母素甲和貝母素乙為浙貝母中的主要活性成分［6-8］。程斌等［9-10］通過譜-效相關(guān)性研究初步篩選出浙貝母9 種與抗炎作用相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)志物，6 種與化痰作用相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)志物。

近年來，鑒定藥物在體內(nèi)化學(xué)成分的方法和技術(shù)不斷發(fā)展，最常用的為超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS） 技術(shù)［11-12］。李榮榮等［13］對(duì)浙貝母主要成分在大鼠血中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，而目前尚未有對(duì)浙貝母在大鼠尿液、糞便中化學(xué)成分的相關(guān)研究。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)灌胃浙貝母后大鼠的尿液和糞便樣品進(jìn)行UPLC-Q-TOF-MS 分析，初步明確其在尿液、糞便中的化學(xué)成分，并追尋主要活性成分貝母素甲、貝母素乙的代謝途徑，以期為后期其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物 雄性Wistar 大鼠，體質(zhì)量（230±20） g，購自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （吉） 2018-0007。單次實(shí)驗(yàn)所用大鼠均為同一批次，自由進(jìn)食飲水，飼養(yǎng)于哈爾濱商業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，設(shè)定溫度為（22±1）℃，相對(duì)濕度為45% ～60%。所有實(shí)驗(yàn)操作均符合哈爾濱商業(yè)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求（審查號(hào)HSDYXY-2020080）。

1.2 試劑與藥物 浙貝母（產(chǎn)地浙江章水） 購自哈爾濱三棵樹藥材市場(chǎng)，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)張德連教授鑒定為正品。貝母素甲（批號(hào)B20080）、貝母素乙（批號(hào)B20081）、西貝素（批號(hào)B21331）、貝母辛（批號(hào)B20082） 對(duì)照品均購自上海源葉生物科技有限公司，純度均＞99.0%。乙腈（質(zhì)譜純）、甲醇（質(zhì)譜純）、甲酸（質(zhì)譜純） 均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司； 甲醇（色譜級(jí)）、氨水（分析純） 均購自天津市天力化學(xué)試劑有限公司； 三氯甲烷（分析純） 購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司； 水為蒸餾水，購自廣州屈臣氏食品有限公司。

1.3 儀器 Xevo G2 Q TOF 質(zhì)譜、Acquity UPLC 色譜儀（美國Waters 公司）； 電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； 干式氮吹儀（北京成萌偉業(yè)科技有限公司）； 快速混勻器（常州國華電器有限公司）； 臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器有限公司）； 超聲清洗器（深圳潔盟清洗設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 提取物制備 稱取已過4 號(hào)篩的浙貝母粉末13 g，加入26 mL 濃氨水浸潤(rùn)1 h，再加入260 mL 三氯甲烷-甲醇混合液（4 ∶1），稱定質(zhì)量后混勻，在80 ℃水浴中加熱回流2 h，自然放冷，濾紙過濾后濃縮成浸膏，即得，置于－20 ℃冰箱保存。

2.2 分組與給藥 將大鼠隨機(jī)分為空白組、浙貝母組，每組6 只。在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定浙貝母灌胃給藥劑量為0.9 g/kg （以生藥計(jì)），空白組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水，每天1 次，連續(xù)7 d。

2.3 尿液、糞便收集及預(yù)處理

2.3.1 尿液 給藥7 d 后，將浙貝母組大鼠置于代謝籠中，禁食不禁水12 h，收集0～12 h 含藥尿液，3 500 r/min離心15 min，取上清液2 mL，加入4 倍量乙腈渦旋混勻2 min，13 000 r/min 離心10 min，取上清液，N2吹干，加入2 倍量乙腈渦旋混勻2 min，13 000 r/min 離心10 min，取上清液，N2吹干，0.4 mL 甲醇復(fù)溶，0.22 μm 微孔濾膜過濾，同法制備空白尿液供試品溶液，4 ℃保存。

2.3.2 糞便 給藥7 d 后，將浙貝母給藥組大鼠置于代謝籠中，禁食不禁水12 h，收集0～12 h 含藥糞便，研缽搗碎研磨后稱取0.5 g，加入4 倍量乙腈超聲提取30 min，13 000 r/min 離心10 min，取上清液，N2吹干，加入2 倍量乙腈，渦旋混勻2 min，13 000 r/min 離心5 min，取上清液，N2吹干，0.4 mL 甲醇復(fù)溶，0.22 μm 微孔濾膜過濾，同法制備空白糞便供試品溶液，在4 ℃下保存。

2.4 UPLC-Q-TOF-MS 分析條件

2.4.1 色譜 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）； 流動(dòng)相乙腈 （A） -0.1% 甲酸（B），梯度洗脫 （0 ～5 min，2% ～25% A； 5 ～12 min，25% ～45% A； 12 ～15 min，45% ～80% A； 15 ～18 min，80% ～86%A； 18 ～25 min，86% ～94% A）； 體積流量0.4 mL/min； 柱溫30 ℃； 進(jìn)樣量2 μL。

2.4.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源（ESI），正負(fù)離子掃描； 質(zhì)量掃描范圍m/z50 ～1 200； 噴霧電壓3.0 kV； 離子源溫度100 ℃； 去溶劑氣溫度400 ℃，體積流量800 L/h； 錐孔氣體積流量50 L/h； 碰撞能量20～45 mV。

2.5 數(shù)據(jù)處理 通過PubMed、CNKI、Chemspider、中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)（TCMSP） 等數(shù)據(jù)庫，收集整理關(guān)于浙貝母化學(xué)成分及其代謝物的信息，采用Waters Masslynx 4.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，根據(jù)分子量、分子式、碎片離子質(zhì)譜圖、同類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律和相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。

3 結(jié)果

3.1 成分鑒定及分析 尿液、糞便在正負(fù)離子模式下的基峰色譜圖分別見圖1～2。

圖1 大鼠糞便、尿液正離子模式基峰色譜圖

圖2 大鼠糞便、尿液負(fù)離子模式基峰色譜圖

正離子模式下，尿液中共檢測(cè)到15 種原型成分、9 種代謝產(chǎn)物； 而負(fù)離子模式下共檢測(cè)到5 種原型成分，去除重復(fù)后共檢測(cè)到28 種，包括19 種原型成分、9 種代謝產(chǎn)物。正離子模式下，糞便中共檢測(cè)到16 種原型成分、14 種代謝產(chǎn)物； 而負(fù)離子模式下共檢測(cè)到23 種原型成分、5 種代謝產(chǎn)物，去除重復(fù)后共檢測(cè)到53 種化學(xué)成分，包括37種原型成分、16 種代謝產(chǎn)物。除去不同生物樣品中的重復(fù)成分后，共檢測(cè)出66 種化學(xué)成分，包括45 種原型成分、21 種代謝產(chǎn)物，其中共有原型成分24 種，糞便中獨(dú)有成分15 種，尿液中獨(dú)有成分6 種； 共有代謝成分有6 種，糞便中獨(dú)有成分11 種，尿液中獨(dú)有成分4 種，具體見表1～2。

表1 正離子模式下大鼠尿液、糞便中浙貝母原型成分及代謝產(chǎn)物

表2 負(fù)離子模式下大鼠尿液、糞便中浙貝母原型成分及代謝產(chǎn)物

3.2 原型成分代謝途徑分析

3.2.1 貝母素甲 該成分可能會(huì)發(fā)生I 相代謝反應(yīng)，即羥基化反應(yīng)、氧化脫氫反應(yīng)，以及Ⅱ相代謝反應(yīng)，即硫酸化反應(yīng)，其代謝途徑見圖3A。

圖3 貝母素甲（A）、貝母素乙（B） 代謝途徑

A15 號(hào)峰保留時(shí)間9.84 min，分子量431.339 9，m/z432.349 9 ［M ＋H］＋，失去一分子水形成m/z414.321 2［M＋H-H2O］＋，碎片離子m/z431.335 5、430.331 4 與對(duì)照品碎片離子一致，推測(cè)為貝母素甲。

A16 號(hào)峰保留時(shí)間10.03 min，分子量429.324 3，m/z430.332 8 ［M＋H］＋，與貝母素甲準(zhǔn)分子離子峰相差2，可能為貝母素甲氧化脫氫產(chǎn)物，二級(jí)碎片離子m/z428.311 3［M＋H-H2］＋，m/z412.321 7 ［M＋H-H2O］＋，與文獻(xiàn)［15］報(bào)道一致，推測(cè)為貝母素甲代謝物M1。

C12 號(hào)峰保留時(shí)間7.28 min，分子量427.308 6，m/z428.316 0 ［M＋H］＋，與貝母素甲代謝物M1 準(zhǔn)分子離子峰相差2，可能為貝母素甲代謝物M1 進(jìn)一步氧化脫氫產(chǎn)物，二級(jí)碎片m/z410.305 ［M＋H-H2O］＋為失去一分子水形成，m/z256.206 9、148.111 8 碎片離子與文獻(xiàn)［16］ 報(bào)道一致，推測(cè)為貝母素甲代謝物M2。

C2 號(hào)峰保留時(shí)間7.44 min，分子量443.303 6，m/z444.311 4 ［M＋H］＋，與貝母素甲代謝物M2 準(zhǔn)分子離子峰相差16，可能為貝母素甲代謝物M2 進(jìn)一步羥基化產(chǎn)物，脫氧形成二級(jí)碎片離子m/z428.315 9 ［M＋H-O］＋，進(jìn)一步失去一分子水形成m/z410.305 8 ［M＋H-O-H2O］＋碎片離子與文獻(xiàn)［15-16］ 報(bào)道一致，推測(cè)為貝母素甲代謝物M3。

A4 號(hào)峰保留時(shí)間7.24 min，分子量445.319 2，m/z446.327 6 ［M＋H］＋，與貝母素甲代謝物M1 準(zhǔn)分子離子峰相差16，可能為貝母素甲代謝物M1 進(jìn)一步羥基化產(chǎn)物，失去一分子水形成m/z428.315 9 ［M＋H-H2O］＋碎片離子，進(jìn)一步失去一分子水產(chǎn)生m/z410.305 2 ［M＋H-H2O-H2O］＋碎片離子，此過程與文獻(xiàn)［16］ 報(bào)道一致，推測(cè)為貝母甲素代謝物M4。

G6 號(hào)峰保留時(shí)間5.96 min，分子量525.276，m/z524.268 8 ［M-H］－，與貝母素甲代謝物M4 準(zhǔn)分子離子峰相差80，可能為貝母素甲代謝物M4 進(jìn)一步硫酸化產(chǎn)物，失去一分子水形成m/z506.257 3 ［M-H-H2O］－的碎片離子，與文獻(xiàn)［15］ 報(bào)道一致，推測(cè)為貝母甲素代謝物M5。

C15 號(hào)峰保留時(shí)間6.86 min，分子量509.281 1，m/z510.288 5 ［M＋H］＋，與貝母素甲代謝物M1 準(zhǔn)分子離子峰相差80，可能為貝母素甲代謝物M1 進(jìn)一步硫酸化產(chǎn)物，碎片離子m/z430.330 8 為貝母素甲特征峰，它和m/z412.320 6 ［M＋H-H2O-SO3］＋與文獻(xiàn)［15］ 報(bào)道一致，推測(cè)為貝母素甲代謝物M6。

C14 號(hào)峰保留時(shí)間7.43 min，分子量511.296 7，m/z512.304 6 ［M＋H］＋，與貝母素甲準(zhǔn)分子離子峰相差80，可能為貝母素甲硫酸化產(chǎn)物，二級(jí)碎片離子m/z414.337 4［M＋H-H2O-SO3］＋、m/z396.328 7 ［M＋H-2H2O-SO3］＋與文獻(xiàn)［15-16］ 報(bào)道一致，推測(cè)為貝母素甲代謝物M7。

A3 號(hào)峰保留時(shí)間9.20 min，分子量447.334 9，m/z448.342 3 ［M＋H］＋，與貝母素甲準(zhǔn)分子離子峰相差16，可能為貝母素甲羥基化產(chǎn)物，失去一分子水形成m/z410.036 5［M＋H-H2O］＋碎片離子，與文獻(xiàn)［16］ 報(bào)道一致，推測(cè)為貝母素甲代謝物M8。

G5 號(hào)峰保留時(shí)間5.66 min，分子量527.291 7，m/z526.284 ［M-H］－，與貝母素甲代謝物M3 準(zhǔn)分子離子峰相差80，可能為貝母素甲代謝物M3 進(jìn)一步硫酸化產(chǎn)物，失去一分子水形成m/z508.276 2 ［M-H-H2O］－的碎片離子，與文獻(xiàn)［15］ 報(bào)道一致，推測(cè)為貝母素甲代謝物M9。

3.2.2 貝母素乙 該成分可能發(fā)生Ι 相代謝反應(yīng)，即羥基化反應(yīng)、還原加氫反應(yīng)、氧化脫氫反應(yīng)，以及Ⅱ相代謝反應(yīng)，即硫酸化反應(yīng)，其代謝途徑見圖3B。

A12 號(hào)峰保留時(shí)間8.70 min，分子量429.324 3，m/z430.337 3 ［M ＋H］＋，失去一分子水形成m/z412.326 1［M＋H-H2O］＋碎片離子，與對(duì)照品二級(jí)碎片信息一致，推測(cè)為貝母素乙。

C9 號(hào)峰保留時(shí)間6.86 min，分子量509.281 1，m/z510.291 3 ［M＋H］＋，與貝母素乙準(zhǔn)分子離子峰相差80，可能為貝母素甲硫酸化產(chǎn)物，碎片離子m/z412.320 6 ［M＋HH2O-SO3］＋、m/z430.331 9 ［M＋H-SO3］＋與貝母素乙碎片離子及文獻(xiàn)［17］ 報(bào)道一致，推測(cè)為貝母素乙代謝物M1。

A9 號(hào)峰保留時(shí)間8.25 min，分子量431.339 9，m/z432.350 2 ［M＋H］＋，與貝母素乙準(zhǔn)分子離子峰相差2，可能為貝母素乙還原加氫產(chǎn)物，其加氫得到m/z430.331 6［M＋H-H2］＋碎片離子，失去一分子水形成m/z412.320 8［M＋H-H2O］＋碎片離子，與文獻(xiàn)［15，17］ 報(bào)道一致，推測(cè)為貝母素乙代謝物M2。

A5 號(hào)峰保留時(shí)間7.28 min，分子量445.319 2，m/z446.327 9 ［M＋H］＋，與貝母素乙準(zhǔn)分子離子峰相差16，可能為貝母素乙羥基化產(chǎn)物，失去一分子水形成m/z428.325 9 ［M＋H-H2O］＋碎片離子，進(jìn)一步失去一分子水形成m/z410.305 8 ［M ＋H-H2O-H2O］＋碎片離子，與文獻(xiàn)［15］ 報(bào)道一致，推測(cè)為貝母素乙代謝物M3。

G6 號(hào)峰保留時(shí)間5.96 min，分子量525.276，m/z524.268 8 ［M-H］－，與貝母素乙代謝物M3 準(zhǔn)分子離子峰相差80，可能為貝母素乙代謝物M3 進(jìn)一步硫酸化產(chǎn)物，失去一水分子形成m/z506.257 3 ［M-H-H2O］－碎片離子，與文獻(xiàn)［15-17］ 報(bào)道一致，推測(cè)為貝母素乙代謝物M4。

A13 號(hào)峰保留時(shí)間9.20 min，分子量427.308 6，m/z428.316 ［M＋H］＋，與貝母素乙準(zhǔn)分子離子峰相差2，可能為氧化脫氫產(chǎn)物，失去一分子水形成m/z410.036 5 碎片離子，與文獻(xiàn)［15］ 報(bào)道一致，推測(cè)為貝母素乙代謝物M5。

A6 號(hào)峰保留時(shí)間7.44 min，分子量443.303 6，m/z444.311 4 ［M＋H］＋，與貝母素乙代謝物M2 準(zhǔn)分子離子峰相差16，可能為貝母素乙代謝物M2 進(jìn)一步羥基化產(chǎn)物，脫去一個(gè)氧形成m/z428.315 9 ［M＋H-O］＋碎片離子，進(jìn)一步失去一分子水形成m/z410.305 8 ［M＋H-O-H2O］＋碎片離子，與文獻(xiàn)［17］ 報(bào)道一致，推測(cè)為貝母素乙代謝物M6。

4 討論

中藥及其復(fù)方的有效組分研究和體內(nèi)代謝產(chǎn)物、代謝過程的研究為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供強(qiáng)有力的支撐，推動(dòng)中藥及其復(fù)方的現(xiàn)代化。由于中藥化學(xué)成分多而復(fù)雜，在體內(nèi)代謝產(chǎn)物、代謝路徑存在不可預(yù)知性，如何在數(shù)量龐大的生物樣本信息中辨識(shí)目標(biāo)組分，是目前對(duì)中藥體內(nèi)代謝研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，故本實(shí)驗(yàn)采用UPLC/Q-TOF-MS 技術(shù)對(duì)灌胃浙貝母提取物后大鼠的尿液與糞便進(jìn)行定性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在大鼠尿液中共檢測(cè)出化學(xué)成分28 種，其中原型成分19 種，代謝產(chǎn)物9 種； 在大鼠糞便中共檢測(cè)出化學(xué)成分53 種，其中原型成分37 種，代謝產(chǎn)物16 種，去除重復(fù)后，共檢測(cè)出化學(xué)成分66 種，其中原型成分45 種，代謝產(chǎn)物21 種； 糞便、尿液中共有原型成分24 種，糞便中獨(dú)有成分15 種，尿液中獨(dú)有成分6 種； 糞便、尿液中共有代謝成分6 種，糞便中獨(dú)有成分11 種，尿液中獨(dú)有成分4 種。

浙貝母中的有效活性成分主要是異甾型生物堿，其極性較小，多以原型被吸收［32］。本實(shí)驗(yàn)在尿液和糞便中共計(jì)檢測(cè)出47 種原型成分，這些原型成分排泄途徑大多不一致，一些原型藥物代謝后主要通過腎臟，由尿液排泄； 一些原型藥物可能未被吸收，或吸收經(jīng)膽汁分泌進(jìn)入腸道，最后通過糞便排泄［33］。而貝母素甲、貝母素乙、去氫鄂貝定堿、紫鄂貝堿、鄂貝定堿、coriolic acid 等原型藥物存在尿液、糞便共有現(xiàn)象，推測(cè)這些成分可能經(jīng)胃腸道吸收后，一部分進(jìn)入體循環(huán)后隨尿液排出，一部分經(jīng)膽汁分泌進(jìn)入小腸隨糞便排出。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)尿液、糞便的成分研究發(fā)現(xiàn)，主要發(fā)生生物轉(zhuǎn)化的活性成分是生物堿類成分，本實(shí)驗(yàn)在推測(cè)灌胃浙貝母后尿液、糞便化學(xué)成分的基礎(chǔ)上，分析了其主要生物堿活性成分貝母素甲、貝母素乙的代謝途徑，結(jié)果表明其主要通過Ι 相代謝（羥基化、氧化脫氫、還原加氫）、Ⅱ相代謝（硫酸化） 等，可為后期進(jìn)一步研究浙貝母的體內(nèi)代謝過程和作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。