氨基化-多壁碳納米管QuEChERS-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定熱帶水果中110 種農(nóng)藥及其代謝物殘留量

潘永波, 張妙宜, 萬 娜, 王 彬*,, 潘燦平

(1.海南省檢驗檢測研究院食品檢驗檢測中心 國家市場監(jiān)管重點實驗室(熱帶果蔬質(zhì)量與安全)，海口 570314；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，?？?571101；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，北京 100193)

熱帶水果在種植過程中由于所處環(huán)境溫度高、濕度大，易受病蟲危害，生產(chǎn)中常采用化學(xué)農(nóng)藥進行防治[1-2]，而其頻繁或不合理使用可能導(dǎo)致農(nóng)藥殘留問題突出，威脅消費者健康和生態(tài)環(huán)境[3-4]。在進行農(nóng)藥殘留檢測時，由于荔枝、龍眼、香蕉中富含糖類物質(zhì)，利用傳統(tǒng)QuEChERS前處理方法處理時易產(chǎn)生糖析現(xiàn)象[5]，造成部分農(nóng)藥損失；此外果實中富含的色素，可以增強大部分農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)[6]，從而影響檢測的準確度。有文獻報道了采用氣液微萃取技術(shù)[7]、微波輔助鹽析萃取技術(shù)[8]和改進的QuEChERS 方法[9]檢測高糖、含有色素的水果、蜂蜜等基質(zhì)中的多農(nóng)藥殘留，但對高糖、含有色素的新鮮熱帶水果檢測多農(nóng)藥殘留報道較少。

Anastassiades 等[10]在2003 年首次提出采用QuEChERS 前處理技術(shù)用于果蔬中多農(nóng)藥殘留的檢測，近些年，學(xué)者在食品中農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、真菌毒素和環(huán)境污染物等方面也展開了相關(guān)研究[11-13]，豐富了QuEChERS 方法應(yīng)用范圍。研究發(fā)現(xiàn)，使用傳統(tǒng)的凈化填料難以滿足復(fù)雜的食品基質(zhì)[14]，對凈化材料的性能提出了更高要求，因此，新型高效的凈化材料已成為QuEChERS 方法發(fā)展的一個重要方向。

近些年，多壁碳納米管 (multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs) 被學(xué)者們廣泛關(guān)注[15-16]。MWCNTs 是由碳原子組成的平面六邊形經(jīng)卷曲形成的一種多孔石墨圓筒狀并具有納米尺度的碳材料，具有比表面積大、吸附能力強、穩(wěn)定耐用等特點[17]。與石墨化碳黑 (graphitized carbon black，GCB) 相比，MWCNTs 對色素、酚類、甾醇類等物質(zhì)的吸附能力更強[17]，但對平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥吸附能力較低。通過對MWCNTs 的官能團進行修飾，可使其具有更好的凈化能力。如彭曉俊等[18-19]對MWCNTs 進行氧化修飾，使其帶有羥基和羧基，用其對陳皮及其制品進行凈化，能有效去除樣品中的雜質(zhì)，基質(zhì)效應(yīng)降低；應(yīng)用氨基化-多壁碳納米管 (NH2-MWCNTs) 對牛奶[20]和菊花[21]進行凈化時發(fā)現(xiàn)， NH2-MWCNTs 能吸附基質(zhì)中的大部分雜質(zhì)，從而減少基質(zhì)對農(nóng)藥多殘留檢測的影響。

本研究在QuEChERS 方法基礎(chǔ)上，參照現(xiàn)行國家標準方法[22]，比較分析了NH2-MWCNTs 及GCB 的凈化效果，通過優(yōu)化NH2-MWCNTs 含量，建立了基于NH2-MWCNTs 改進的QuEChERS凈化法，結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (LC-MS/MS) 測定荔枝、龍眼和香蕉中110 種農(nóng)藥及其代謝物殘留的檢測方法，旨在為熱帶水果中農(nóng)藥多殘留的日常監(jiān)測提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Waters ACQUITY UPLC/Xevo TQ-S 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Waters 公司；ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱，美國Waters 公司；XS204萬分之一天平，瑞士 Mettler Toledo 公司；XW-80A 旋渦混合器，上海精科實業(yè)有限公司；IKA?KS 4000 ic 恒溫搖床，德國IKA 公司；Centrifuge 5804R 冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；Milli-Q超純水機，美國Millipore 公司。

乙腈、甲醇(色譜純)，德國MERCK 公司；甲酸、乙酸(色譜純)，美國ACS 恩科化學(xué)；乙酸銨(色譜純)，美國Thermo Fisher 公司；EN.15662萃取緩沖體系QuEChERS 鹽包(含4 g MgSO4、1 g氯化鈉、0.5 g 檸檬酸氫二鈉和1 g 檸檬酸鈉)，美國Agilent 公司；多壁碳納米管(NH2-MWCNTs，粒徑10～20 nm，顆粒長度5～15 μm)，北京科德諾思技術(shù)有限公司；石墨化碳黑(GCB)，天津博納艾杰爾科技有限公司；N-丙基乙二胺(PSA，粒徑40～60 μm，平均孔徑6 nm，天津博納艾杰爾科技有限公司；荔枝、龍眼和香蕉，購自海南省海口市、澄邁縣、東方市、昌江市等地的農(nóng)貿(mào)市場及超市。

110 種農(nóng)藥標準品 (純度≥95.0%)，分別購自德國Dr.Ehrenstorfer 公司、美國CATO 公司和中國計量科學(xué)研究院。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 準確稱取10 mg (精確至0.1 mg) 各農(nóng)藥標準品，根據(jù)標準品的溶解性分別選擇乙腈或甲醇為溶劑，配制成1000 mg/L 的標準品儲備液，于 -18 ℃及以下保存；根據(jù)需要，移取適量標準品儲備液用乙腈稀釋，配制成所需濃度的標準工作液，于4 ℃保存，備用。

1.2.2 樣品前處理 樣品制備：按照GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[23]方法，取供試水果待測部位，用組織搗碎機勻漿后，放入聚乙烯瓶中，于 -18 ℃及以下保存。

提?。悍Q取10 g (精確至0.01g) 均質(zhì)樣品于50 mL 離心管中，加入20 mL 乙腈，渦旋混勻1 min后，加入EN.15662 萃取緩沖體系QuEChERS鹽包，振搖1 min，以8000 r/min 離心5 min。

凈化：移取6 mL 上清液，加入到含有900 mg MgSO4、150 mg PSA 及15 mg MWCNTs 的15 mL離心管中，渦旋1 min 后，以8000 r/min 離心5 min；取上清液過0.22 μm 有機濾膜，待測。

1.2.3 檢測條件 色譜條件：采用 ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱 (1.8 μm，2.1 mm × 100 mm)分離；流動相A 相為0.01%甲酸水溶液 (含2 mmol/L乙酸銨)，B 相為甲醇；流速0.4 mL/min； 柱溫40 ℃； 進樣量1 μL；梯度洗脫程序：0～0.5 min，98% A；＞0.5～3.5 min，2.0% A；＞3.5～4.5 min，2.0% A；＞4.5～4.6 min，98% A；＞4.6～6.0 min，95% A。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源 (ESI 離子化模式)，正離子和負離子同時掃描；多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)；碰撞氣為氬氣 (Ar)；毛細管電壓1.00 kV(ESI+)、2.5 kV (ESI-)；離子源溫度120 ℃；錐孔氣流量150 L/h；脫溶劑氣溫度400 ℃；脫溶劑氣流量800 L/h。其他質(zhì)譜條件詳見表1。

表1 110 種農(nóng)藥質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of 110 pesticides

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Waters MassLynx 工作軟件建立方法、數(shù)據(jù)采集及定量處理，導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)后采用WPS Office 進行數(shù)據(jù)整理、分析和表格、柱狀圖繪制。前處理和分析條件優(yōu)化中的回收率均采用3 個平行樣品取平均值計算，精密度選擇低、中、高3 個濃度，每個濃度梯度連續(xù)采集6 次數(shù)據(jù)的峰面積進行相對標準偏差 (RSD) 的計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

為了實現(xiàn)110 種化合物有較好的色譜行為，實驗首先考察了乙腈-水、甲醇-水在HSS T3 色譜柱上相同洗脫梯度條件下各化合物的響應(yīng)和分離度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在只有純水和有機相下，大多數(shù)農(nóng)藥響應(yīng)較差，甚至沒有出峰，因此在水相中添加一定濃度的甲酸或乙酸銨，觀察各化合物的響應(yīng)及出峰時間的變化。實驗發(fā)現(xiàn)，在水相中加入一定濃度的甲酸，有機磷類等農(nóng)藥的響應(yīng)值顯著增加，說明甲酸可以增強該類農(nóng)藥的電離；當加入乙酸銨時，有機氯及擬除蟲菊酯類等農(nóng)藥有較好的峰形和響應(yīng)值，這是因為該類農(nóng)藥離子化時，銨鹽促進了[M + NH4]+峰的形成，容易在流動相中分散和傳遞[24-25]。進一步考察了在水相中分別添加體積分數(shù)為0.01%、0.05%、0.1%和0.2%的甲酸及濃度單位為1、2、5 和10 mmol/L 乙酸銨，觀察對各化合物的影響。結(jié)果表明，當甲酸濃度增加時，甲胺磷基線噪音增大，影響峰形；當乙酸銨濃度增加到5 mmol/L 時，甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、多殺菌素等峰形變寬，出峰時間延遲。為了使各化合物有更好的分析，水相選擇加入0.01%甲酸和2 mmol/L 乙酸銨。由于甲醇為質(zhì)子溶劑，與親核基形成氫鍵，對分離酸堿或電負性強的化合物有較強的選擇性[26]，因此有機相選擇甲醇。最終選擇2 mmol/L 乙酸銨的水相 (含有0.01%甲酸) 與甲醇為流動相。

2.2 前處理條件優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑優(yōu)化 參照GB 23200.121—2021《食品安全國家標準 植物源性食品中331 種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定》，分別選擇乙腈及含有體積分數(shù)為1%乙酸的乙腈作為提取溶劑，在荔枝空白基質(zhì)中添加供試目標農(nóng)藥標準品，添加水平為0.02 mg/kg。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種提取溶劑對應(yīng)各目標農(nóng)藥的回收率分別為51.7% 和56.7%，說明仍有大量的農(nóng)藥未被提取出來，可能是因為荔枝中含有大量的糖類物質(zhì)，導(dǎo)致出現(xiàn)糖析現(xiàn)象，降低了農(nóng)藥的提取效率。

稱取10 g 荔枝空白基質(zhì)，比較了不同提取溶劑用量 (10、15、20、25 mL) 對各目標農(nóng)藥提取回收率的影響 (圖1)。結(jié)果表明，隨著提取劑體積增加，目標農(nóng)藥回收率不斷提升，當提取劑含量達到20 mL 時，各目標農(nóng)藥回收率超過60%。考慮提取體積過大，會造成試劑浪費及降低目標農(nóng)藥的靈敏度，選擇在10 g 樣品中添加20 mL乙腈。

圖1 不同提取體積對回收率的影響Fig.1 Influence of different extraction volume on recovery rate

2.2.2 凈化劑優(yōu)化 在荔枝空白基質(zhì)中添加0.02 mg/kg 的目標農(nóng)藥，加入20 mL 乙腈提取，加入EN.15662 萃取緩沖體系QuEChERS 鹽包分層后，取2 mL 上清液，分別添加各2.5 mg/mL GCB 和NH2-MWCNTs 填料，考察對樣品凈化效果及農(nóng)藥回收率的影響。結(jié)果 (圖2) 發(fā)現(xiàn)：GCB對噻菌靈、氯吡脲、滅幼脲和噻苯隆等農(nóng)藥的吸附性較強，農(nóng)藥回收率低于60%，而MWCNTs對各目標農(nóng)藥的回收率均大于60%，因此選擇NH2-MWCNTs 為凈化劑填料。

圖2 不同凈化劑對4 種農(nóng)藥回收率的影響Fig.2 Influence of different purification materials on recovery rate of 4 pesticides

進一步對NH2-MWCNTs 的用量進行了優(yōu)化，將2 mL 提取液分別加入含有2、4、5、8 和10 mg NH2-MWCNTs 的凈化管中，以回收率考察其凈化效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有目標農(nóng)藥的平均回收率均大于87%，且隨著NH2-MWCNTs 用量的增加，樣品中色澤亮度增大，但噻菌靈、噻苯隆、氯吡脲和滅幼脲等農(nóng)藥的平均回收率也隨之降低 (圖2)。因此確定NH2-MWCNTs 用量為2.5 mg/mL (2 mL 提取液中含5 mg NH2-MWCNTs)。

2.3 方法學(xué)評價

2.3.1 線性范圍及定量限 分別向荔枝、龍眼和香蕉空白基質(zhì)溶液中添加一定量的標準溶液，配制成質(zhì)量濃度分別為0.002、0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.10 和0.20 mg/L 的基質(zhì)標準工作溶液，以目標化合物質(zhì)量濃度為橫坐標，各化合物的定量離子對的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。方法定量限 (LOQ) 的評價以最低添加濃度且可準確定量為依據(jù)。結(jié)果表明，各農(nóng)藥在0.002～0.2 mg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，決定系數(shù) (R2) 均大于0.9902，LOQ 在0.005 ～ 0.05 mg/kg 之間。

2.3.2 正確度與精密度 分別向荔枝、龍眼和香蕉空白基質(zhì)溶液中添加LOQ、2LOQ 和10LOQ 3 個水平的標準混合溶液，各農(nóng)藥的回收率在61%～120%，相對標準偏差0.30%～15% (表2)。表明該方法可用于荔枝、龍眼和香蕉中多農(nóng)藥殘留的篩查和檢測。

表2 110 種農(nóng)藥定量限、決定系數(shù)、添加平均回收率和相對標準偏差( n = 6)Table 2 Limit of quantification(LOQ), determination coefficients, the average recoveries and relative standard deviations(RSD) of 110 pesticides ( n = 6)

2.3.3 基質(zhì)效應(yīng) 帶有羧基、氨基、酰胺基、羥基等基團的農(nóng)藥易發(fā)生基質(zhì)增強或抑制效應(yīng)[27]，通常通過空白樣品基質(zhì)中標準曲線的斜率A 與溶劑中標準曲線的斜率B 評價基質(zhì)效應(yīng) (ME)[28]，即：ME/% = (A-B)/B × 100。當ME ＜ 0，為基質(zhì)抑制效應(yīng)；ME ＞ 0，為基質(zhì)增強效應(yīng)；|ME| ＜ 20%，為弱基質(zhì)效應(yīng)；20% ≤ |ME| ≤ 50%，為中等基質(zhì)效應(yīng)；|ME| ＞ 50%，為強基質(zhì)效應(yīng)。

按照本實驗建立的方法與GB 23200.121—2021《食品安全國家標準 植物源性食品中331 種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定》方法建立基質(zhì)標準曲線，分別考察了荔枝、龍眼和香蕉3 種基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，荔枝、龍眼和香蕉中弱基質(zhì)效應(yīng)農(nóng)藥比例分別為50.9%、40%和61.8%，較GB 23200.121—2021 方法的弱基質(zhì)效應(yīng)農(nóng)藥比例分別增加28.2%、20.0%和16.4%；而強基質(zhì)效應(yīng)農(nóng)藥均下降至8.2% (表3)。因此，在定量分析中根據(jù)樣品種類選擇相應(yīng)的空白基質(zhì)，采用基質(zhì)匹配標準曲線校正，降低基質(zhì)效應(yīng)。

表3 不同方法測定3 種基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)對應(yīng)的農(nóng)藥數(shù)量Table 3 The number of pesticides within different matrix effect ranges in three matrices by different methods

2.4 實際樣品檢測

利用建立的檢測方法，測定市售的39 份樣品(包括14 份龍眼、10 份荔枝、15 份香蕉)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在28 份樣品中檢出農(nóng)藥殘留，檢出農(nóng)藥19 種，檢出農(nóng)藥以殺蟲劑和殺菌劑為主，單個樣品檢出農(nóng)藥種類1～8 種。檢出頻率較高的農(nóng)藥有：吡唑醚菌酯 (22 份)、多菌靈 (15 份)、吡蟲啉(9 份)、聯(lián)苯菊酯 (5 份)、霜霉威 (4 份)。

對檢測結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn)，有22 份樣品檢出吡唑醚菌酯，包括荔枝8 份，最大殘留值為0.084 mg/kg，低于我國食品安全國家標準[23](0.1 mg/kg)；香蕉8 份，最大殘留值為0.10 mg/kg；龍眼6 份，最大殘留值為0.12 mg/kg，均符合食品安全國家標準要求。15 份樣品檢出多菌靈，其中龍眼7 份，最大殘留值為0.33 mg/kg，遠低于食品安全國家標準要求 (10 mg/kg)；荔枝和香蕉分別為4 份，最大殘留值分別為0.30、0.20 mg/kg，符合食品安全國家標準要求 (荔枝0.5 mg/kg、香蕉2 mg/kg)。在香蕉中有4 份樣品檢出吡蟲啉，最大殘留值為0.024 mg/kg，符合食品安全國家標準要求 (香蕉0.05 mg/kg)，荔枝和龍眼中也有檢出，分別為2 份和3 份，最大殘留值分別為0.052、0.024 mg/kg，但我國尚未制定最大殘留限量值 (其中，日本規(guī)定在其他水果中殘留限量值為4 mg/kg[29])。荔枝中聯(lián)苯菊酯和霜霉威的殘留量分別為0.20～0.24 mg/kg和0.039～0.30 mg/kg，而我國尚未制定其最大殘留限量值。目前，日本規(guī)定在其他水果中殘留限量值為0.3 mg/kg[29]，未查詢到霜霉威在荔枝、龍眼、香蕉中的最大殘留限量值。

3 結(jié)論

本研究基于QuEChERS 前處理技術(shù)結(jié)合LCMS/MS 建立了同時檢測熱帶水果中110 種農(nóng)藥的分析方法，采用增加提取溶劑乙腈的體積，消除糖析現(xiàn)象，選擇和優(yōu)化了NH2-MWCNTs 為凈化材料的用量，確定15 mg 的NH2-MWCNTs 與900 mg MgSO4、150 mg PSA 結(jié)合的QuEChERS基質(zhì)分散凈化劑對熱帶水果荔枝、龍眼、香蕉進行有效的凈化，與現(xiàn)有標準方法比較，本研究建立的方法能夠有效的降低基質(zhì)效應(yīng)，提高了準確性，為熱帶特色水果中多農(nóng)藥殘留檢測及確證分析提供技術(shù)支持。