氯氟醚菊酯對(duì)斑馬魚胚胎及仔魚心臟發(fā)育的毒性及氧化損傷作用

李瑞瑞, 周 寧, 吳夢(mèng)琪, 徐文平, 陶黎明, 張 陽(yáng)

(上海市化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華東理工大學(xué) 藥學(xué)院，上海 200237)

氯氟醚菊酯 (結(jié)構(gòu)式見圖式1) 是一種廣泛使用的擬除蟲菊酯類殺蟲劑[1]。目前，它是市場(chǎng)上家庭用衛(wèi)生殺蟲劑的主要品種之一，常被用作蚊香或蚊香液類產(chǎn)品[2]。伴隨它的大量使用，其環(huán)境暴露風(fēng)險(xiǎn)也受到了越來(lái)越多的關(guān)注。2017 年P(guān)ierre等使用大鼠模型評(píng)價(jià)了氯氟醚菊酯類蚊香的急性毒性，發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)品經(jīng)肺吸收，具有高毒性風(fēng)險(xiǎn)，主要表現(xiàn)為麻木、嗜睡等[3]。2021 年，埃及報(bào)道，吸入氯氟醚菊酯類蚊香煙霧的小白鼠出現(xiàn)細(xì)胞凋亡、組織病理學(xué)改變和生化指標(biāo)的破壞[4]。也有研究表明，含氯氟醚菊酯的蚊香對(duì)人體存在一定的毒性風(fēng)險(xiǎn)，如肺炎[5]、腦損傷[6]、呼吸道黏膜損傷和過(guò)敏[7]等。此處，還有大量研究表明，同類別農(nóng)用擬除蟲菊酯類殺蟲劑 (高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、功夫菊酯等) 的持續(xù)使用會(huì)對(duì)人體和動(dòng)物產(chǎn)生多種毒性，比如神經(jīng)、內(nèi)分泌干擾[8]、發(fā)育及生殖[9]、心臟毒性等。其中溴氰菊酯還可引起斑馬魚的發(fā)育毒性、細(xì)胞凋亡、心血管系統(tǒng)損傷和焦慮樣行為，也會(huì)促進(jìn)谷氨酸能突觸之間的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，導(dǎo)致成年斑馬魚社會(huì)行為的過(guò)度活躍[10]；高效氯氰菊酯可能通過(guò)延緩性腺發(fā)育、干擾性激素分泌和影響HPG 軸基因的表達(dá)而對(duì)斑馬魚的生殖系統(tǒng)產(chǎn)生毒性[11]。

圖式 1 氯氟醚菊酯結(jié)構(gòu)式Scheme 1 The structural formula of meperfluthrin

生物體細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì) (reactive oxygen species，ROS) 的過(guò)量產(chǎn)生與累積會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生，從而打破氧化還原平衡狀態(tài)[12]。氧化應(yīng)激的發(fā)生可能引起DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物分子的氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞功能異常，甚至發(fā)生凋亡或壞死[13]。為了對(duì)抗氧化應(yīng)激產(chǎn)生的有害效應(yīng)，生物體內(nèi)有一套復(fù)雜的抗氧化防御系統(tǒng)，包括抗氧化酶，如超氧化物歧化酶 (SOD)、過(guò)氧化氫酶 (CAT) 及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 (GSH-Px) 等。這些抗氧化物質(zhì)可以中和ROS，從而減輕其對(duì)細(xì)胞的損傷[14-15]。心臟作為推動(dòng)血液循環(huán)的主要器官，對(duì)于動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育乃至存活都具有重要的生命意義。生物體一旦發(fā)生氧化應(yīng)激，對(duì)心臟組織將產(chǎn)生一定的毒害作用，同時(shí)會(huì)引發(fā)生物體的心血管病變等。斑馬魚Danio rerio模型因胎心透明，心臟及血管發(fā)育等表觀形態(tài)易于被觀察研究，目前已被廣泛應(yīng)用到毒理學(xué)研究領(lǐng)域[16]。

鑒于此，本研究評(píng)估了氯氟醚菊酯對(duì)斑馬魚心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響，包括心房和心室的形成、心臟收縮和泵血功能等；初步探討了氯氟醚菊酯引起心血管毒性的潛在機(jī)制，旨在探究氯氟醚菊酯急性暴露對(duì)斑馬魚胚胎及仔魚發(fā)育時(shí)期心血管發(fā)育的毒性效應(yīng)，為氯氟醚菊酯的安全使用與風(fēng)險(xiǎn)管控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

斑馬魚成魚由國(guó)家斑馬魚資源中心提供。雌、雄斑馬魚(5 月大) 分別飼養(yǎng)，飼養(yǎng)水溫控制在(28 ± 1) ℃，pH 值為7.2，電導(dǎo)率約為500 μS/cm，飼養(yǎng)房?jī)?nèi)光周期設(shè)置光照14 h 和黑暗10 h 交替，每日早、晚喂食鮮活豐年蟲。

1.2 試劑和材料

氯氟醚菊酯 (meperfluthrin，CAS：352271-52-4；純度≥99.5%)，江蘇揚(yáng)農(nóng)化工股份有限公司提供。將氯氟醚菊酯粉末溶于二甲基亞砜 (DMSO)，于4 ℃下保存。2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)、RIPA 裂解緩沖液和吖啶橙 (AO,acridine orange) 染色試劑，均來(lái)自Sigma-Aldrich(美國(guó))。Caspase 兔抗，購(gòu)自生工生物 (中國(guó)上海)。與氧化應(yīng)激有關(guān)的商業(yè)檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。用于mRNA 分析的TRIzol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄酶、SYBR-Green Master Mix 和引物，均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。CFX 96 孔，購(gòu)自Labselect (中國(guó)北京)。磷酸鹽緩沖溶液 (PBS，phosphate buffer saline) 等其他化學(xué)試劑，均購(gòu)自上海泰坦科技有限公司。

A1 HD25 共聚焦顯微鏡 (日本尼康公司)；SMZ745T 體式顯微鏡 (日本尼康公司)；CSW-DZ01倒置熒光顯微鏡 (德國(guó)徠卡公司)；QuantStudio 5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀 (美國(guó)Thermo Fisher 公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 急性毒性測(cè)試 將斑馬魚成魚(雌雄比例1 : 1)在產(chǎn)卵前1 晚置于育種缸中進(jìn)行黑暗處理，第2 天早上抽掉缸中隔板，使其在強(qiáng)光刺激下開始交配。交配后1 h 采集胚胎，用胚胎培養(yǎng)液清洗3 次，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。將受精后6 h 的斑馬魚胚胎分別暴露于質(zhì)量濃度分別為0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 和3.2 μg/mL 的氯氟醚菊酯藥液中后，記錄胚胎暴露72 h 的死亡情況。

將受精后6 h 的斑馬魚胚胎分別暴露于0、0.2、0.4、0.8 μg/mL 的氯氟醚菊酯藥液中，每24 h 記錄心率 (每分鐘跳動(dòng)次數(shù)，bpm)。于48 h 和72 h統(tǒng)計(jì)并計(jì)算孵化率。

1.3.2 心血管毒性評(píng)估 基于本課題組先前的研究，靜脈竇-動(dòng)脈球 (SV-BA) 的間距和心包面積被勾勒出，以測(cè)量心包水腫的嚴(yán)重程度[13]。Tg(kdrl:EGFP)斑馬魚的胚胎分別經(jīng)0、0.2、0.4、0.8 μg/mL的氯氟醚菊酯藥液暴露72 h 后，使用PBS 清洗3 次，并用5 mg/L 的三卡因麻醉，而后在共聚焦顯微鏡下采集圖像，使用NIS 軟件進(jìn)行圖像分析，通過(guò)心臟部位的熒光強(qiáng)度和心房與心室的面積評(píng)估氯氟醚菊酯對(duì)斑馬魚仔魚的心臟毒性；通過(guò)腸下靜脈的血管排列情況評(píng)價(jià)氯氟醚菊酯對(duì)仔魚的血管毒性。

1.3.3 與氧化應(yīng)激相關(guān)的酶活性檢測(cè) 為了評(píng)估分別暴露于0、0.2、0.4、0.8 μg/mL 氯氟醚菊酯藥液72 h 胚胎的氧化應(yīng)激水平，檢測(cè)了與氧化應(yīng)激有關(guān)的抗氧化酶 (SOD、CAT、GSH-Px) 活性以及丙二醛 (MDA) 和ROS 的含量水平，通過(guò)檢測(cè)心臟部位的熒光強(qiáng)度評(píng)價(jià)藥物對(duì)胚胎心臟的毒性效應(yīng)。

每組收集30 枚胚胎，隨機(jī)取樣，在暴露72 h后用PBS 清洗3 次，并在冰上勻漿，根據(jù)先前的研究報(bào)告，使用試劑盒測(cè)定SOD、CAT、GSH-Px的酶活性和MDA 的含量水平，使用DCFH-DA 探針檢測(cè)在藥液中暴露72 h 后斑馬魚仔魚的活性氧水平[17]。經(jīng)不同濃度的氯氟醚菊酯藥液處理斑馬魚胚胎72 h 后，用PBS 洗滌3 次，之后用5 mL ROS 檢測(cè)液 (20 μmol/L DCFH-DA) 在28 ℃黑暗條件下孵育30 min。隨后，用PBS 清洗仔魚3 次。最后，使用倒置熒光顯微鏡捕捉整個(gè)仔魚的實(shí)時(shí)圖像。

1.3.4 病理學(xué)切片 為了評(píng)估斑馬魚心臟的組織病理學(xué)變化，進(jìn)行了蘇木精伊紅 (hematoxylin-eosin,HE) 染色。將暴露于0、0.2、0.4、0.8 μg/mL 的氯氟醚菊酯藥液72 h 的野生型AB 斑馬魚仔魚在4%多聚甲醛溶液、4 ℃環(huán)境下固定過(guò)夜。然后用HE染色進(jìn)行組織學(xué)觀察。于體式顯微鏡下采集圖像。

1.3.5 RNA 提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 用TRIzol試劑提取0、0.2、0.4、0.8 μg/mL 的72 hpf (hours post fertiliation， 受精后小時(shí))仔魚 (每組約30 尾)的總RNA。通過(guò)qRT-PCR 檢測(cè)凋亡基因的表達(dá)水平，包括心肌蛋白標(biāo)記基因myl7、心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子myh6和心室早期發(fā)育標(biāo)記基因vmhc。

引物由賽維爾公司合成，引物序列如表1 所示。qRT-PCR 反應(yīng)體系根據(jù)2 × Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒(G3326)開展，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀的反應(yīng)運(yùn)行程序?yàn)椋孩?5 ℃預(yù)變性30 s；②95 ℃變性15 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)；③熔解曲線程序：95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，20 s，步進(jìn)0.15 ℃/s。以β-actin為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的表達(dá)水平[13]。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)以3 個(gè)重復(fù)為單位，采用SPSS 25.0 計(jì)算機(jī)程序 (IBM 公司，美國(guó)紐約) 進(jìn)行。分析結(jié)果以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差(SD) 表示。顯著性概率水平設(shè)定為顯著差異*，P≤ 0.05；極顯著差異**，P≤ 0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性

根據(jù)不同濃度檢測(cè)終點(diǎn)統(tǒng)計(jì)到的死亡率數(shù)據(jù)，利用OriginPro 2023b 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件繪制了“濃度-致死率”效應(yīng)曲線，如圖1 所示，并擬合得到了氯氟醚菊酯對(duì)斑馬魚的72 h-LC50值為0.756 μg/mL，95%置信區(qū)間為0.724～1.003 μg/mL。根據(jù)急性毒性結(jié)果，選擇LC50值作為最高濃度，故將藥液暴露質(zhì)量濃度設(shè)置為0、0.2、0.4、0.8 μg/mL。

圖1 氯氟醚菊酯對(duì)斑馬魚胚胎-仔魚的致死率(72 h)Fig.1 Mortality of meperfluthrin to zebrafish embryo-larvae (72 h)

2.2 氯氟醚菊酯對(duì)斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性

2.2.1 氯氟醚菊酯誘導(dǎo)斑馬魚胚胎的發(fā)育畸形

將6 hpf 的斑馬魚胚胎在不同質(zhì)量濃度的氯氟醚菊酯中急性暴露72 h，每24 h 進(jìn)行一次表型觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，斑馬魚胚胎從24 h 開始出現(xiàn)不同程度的畸形特征，包括脊柱彎曲、尾部彎曲、心包水腫或卵黃囊腫大 (圖2A)，其中0.4 和0.8 μg/mL劑量暴露組的致畸率顯著，卵黃囊腫大的畸形占比最高 (圖2B)。

圖2 A.氯氟醚菊酯誘導(dǎo)斑馬魚產(chǎn)生脊柱彎曲 (SC)、尾部彎曲 (TC)、卵黃囊腫大 (YSE)和心包水腫 (PCE) 等畸形現(xiàn)象；B.氯氟醚菊酯對(duì)斑馬魚的畸形率統(tǒng)計(jì)Fig.2 A.Meperfluthrin induced malformations including spinal curvature (SC), tail curvature (TC), yolk sac edema (YSE),and pericardial edema (PCE) in zebrafish; B.Statistical analysis of malformation rate in zebrafish induced by meperfluthrin

2.2.2 氯氟醚菊酯對(duì)斑馬魚胚胎及仔魚的發(fā)育毒性 斑馬魚胚胎暴露于梯度質(zhì)量濃度的氯氟醚菊酯24、48 和72 h 后，其心率與對(duì)照組相比被顯著抑制 (圖3A)，其中48 h 的心率最高。如圖3B 所示，0.2 μg/mL 的氯氟醚菊酯對(duì)斑馬魚胚胎的孵化率沒有影響，但在0.4 和0.8 μg/mL 劑量暴露組中，48 hpf 的斑馬魚胚胎孵化顯著延遲，72 hpf 的胚胎孵化不受暴露液質(zhì)量濃度的影響，這可能是因?yàn)?8 hpf 的胚胎各項(xiàng)機(jī)能發(fā)育不完善，免疫力較弱，難以抵御藥劑的作用。由圖3C 可以看出，0.4 和0.8 μg/mL 的劑量組，斑馬魚仔魚的體長(zhǎng)明顯縮短。此外，隨著氯氟醚菊酯質(zhì)量濃度的增大，斑馬魚仔魚眼部和頭部面積出現(xiàn)顯著減小(圖3D、3E)。說(shuō)明氯氟醚菊酯的暴露延緩了斑馬魚胚胎的早期發(fā)育。

圖3 氯氟醚菊酯誘導(dǎo)斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性Fig.3 Developmental toxicity induced by meperfluthrin in zebrafish embryos

2.3 氯氟醚菊酯對(duì)斑馬魚仔魚的心臟毒性

2.3.1 氯氟醚菊酯誘導(dǎo)斑馬魚仔魚心臟線性化采用HE 染色觀察斑馬魚仔魚心臟的組織病理學(xué)變化，結(jié)果 (圖4) 表明，與對(duì)照相比，0.2、0.4 和0.8 μg/mL 的氯氟醚菊酯處理使斑馬魚仔魚心臟的心室擴(kuò)大和線性化 (白色箭頭指示)，說(shuō)明氯氟醚菊酯損害了斑馬魚仔魚心臟的發(fā)育形態(tài)。

圖4 氯氟醚菊酯對(duì)斑馬魚心臟組織的影響(72 h)Fig.4 Effects of meperfluthrin on zebrafish heart tissue (72 h)

2.3.2 氯氟醚菊酯對(duì)斑馬魚仔魚心臟SV-BA 間距的影響 測(cè)量藥物暴露后的斑馬魚仔魚的SVBA 間距和心包面積發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，暴露于0.2、0.4 和0.8 μg/mL 的氯氟醚菊酯的仔魚呈現(xiàn)SV-BA間距顯著加寬 (圖5B) 和心包面積增大 (圖5C) 的現(xiàn)象，并具有濃度依賴性。

圖5 氯氟醚菊酯對(duì)斑馬魚仔魚心臟的SV-BA 間距 (B) 和心包面積 (C) 的影響(72 h)Fig.5 Effect of meperfluthrin on cardic SV-BA spacing (B) and pericardial area (C) on zebrafish larvae (72 h)

2.3.3 氯氟醚菊酯誘導(dǎo)斑馬魚心臟的心房心室分化 斑馬魚的心臟是脊椎動(dòng)物胚胎中第一個(gè)發(fā)育成熟并具有生理功能的器官，由心房和心室兩個(gè)腔室組成[18-19]。若心臟受到影響，心房和心室的位置將發(fā)生改變，SV-BA 距離也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)3 個(gè)劑量的氯氟醚菊酯處理72 h，斑馬魚仔魚的心房和心室發(fā)生分化 (圖6)，并且隨著藥劑質(zhì)量濃度的增加，心房和心室間距較未處理組相比加大，這正好驗(yàn)證了HE 染色和SV-BA 的結(jié)果。

圖6 氯氟醚菊酯暴露對(duì)斑馬魚仔魚心房心室位置的影響(72 h)Fig.6 Effect of meperfluthrin exposure on the position of the atria and ventricles of zebrafish larvae hearts (72 h)

2.3.4 氯氟醚菊酯誘導(dǎo)斑馬魚心臟的基因表達(dá)失調(diào)myl7在斑馬魚的心房和心室中表達(dá)，與其心肌細(xì)胞增殖等生理過(guò)程密切相關(guān)；myh6是與斑馬魚心臟發(fā)育有關(guān)的重要基因；vmhc是最早標(biāo)記心室的標(biāo)記基因[20]。如圖7 所示，斑馬魚胚胎暴露于3 個(gè)氯氟醚菊酯處理組72 h 后，與對(duì)照相比，myl7、myh6和vmhc的表達(dá)量均隨著藥劑質(zhì)量濃度的增加而顯著降低。說(shuō)明氯氟醚菊酯可能通過(guò)降低myl7、myh6和vmhc基因的表達(dá)而損傷心肌細(xì)胞的功能，從而產(chǎn)生對(duì)斑馬魚心臟的毒性。

圖7 暴露于氯氟醚菊酯的斑馬魚心臟發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)水平(72 h)Fig.7 Expression levels of genes associated with cardiac development in zebrafish exposed to meperfluthrin (72 h)

2.4 氯氟醚菊酯對(duì)斑馬魚仔魚血管的毒性

2.4.1 氯氟醚菊酯對(duì)斑馬魚心臟部位血管發(fā)育的影響 采用6 hpf 的轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎進(jìn)行藥劑暴露，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，經(jīng)0.2、0.4 和0.8 μg/mL 的氯氟醚菊酯處理的斑馬魚仔魚心臟部位的血管發(fā)育不完全 (圖8)，說(shuō)明氯氟醚菊酯會(huì)導(dǎo)致斑馬魚仔魚心臟的血管出現(xiàn)發(fā)育缺陷。

圖8 氯氟醚菊酯暴露對(duì)斑馬魚仔魚心臟血管發(fā)育的影響Fig.8 Effect of meperfluthrin exposure on zebrafish larvae cardiac vascular development

2.4.2 氯氟醚菊酯誘導(dǎo)斑馬魚腸下靜脈發(fā)育缺陷

將經(jīng)藥劑處理72 h 的斑馬魚仔魚置于玻璃皿中，于共聚焦顯微鏡下采集圖像。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，處理組的腸下靜脈排列雜亂，分布不均勻 (圖9)。說(shuō)明0.2、0.4 和0.8 μg/mL 的氯氟醚菊酯處理胚胎72 h 后引起了斑馬魚腸下靜脈發(fā)育異常。

圖9 氯氟醚菊酯誘導(dǎo)對(duì)斑馬魚腸下靜脈的影響(72 h)Fig.9 Effect of meperfluthrin induction on zebrafish subintestinal veins (72 h)

2.5 氯氟醚菊酯對(duì)斑馬魚的氧化應(yīng)激效應(yīng)

2.5.1 氯氟醚菊酯誘導(dǎo)斑馬魚心臟產(chǎn)生ROS 本研究結(jié)果表明，與對(duì)照相比，氯氟醚菊酯處理組誘導(dǎo)了斑馬魚仔魚心臟處ROS 產(chǎn)生，并且這種現(xiàn)象呈現(xiàn)劑量依賴性 (圖10A 和10B)，說(shuō)明氯氟醚菊酯誘導(dǎo)斑馬魚的心臟毒性可能是通過(guò)氧化應(yīng)激這一途徑。

圖10 氯氟醚菊酯對(duì)斑馬魚氧化應(yīng)激的影響(72 h)Fig.10 Effect of meperfluthrin on oxidative stress in zebrafish (72 h)

2.5.2 氯氟醚菊酯對(duì)MDA 含量的影響 6 hpf 的斑馬魚胚胎在不同質(zhì)量濃度的氯氟醚菊酯中暴露72 h 后，與對(duì)照組相比，0.2、0.4、0.8 μg/mL 的暴露組中斑馬魚仔魚的MDA 含量均顯著增加(P均≤0.05) (圖10C)，說(shuō)明氯氟醚菊酯促進(jìn)了斑馬魚體內(nèi)MDA 的產(chǎn)生，可能引起其的氧化應(yīng)激效應(yīng)。

2.5.3 氯氟醚菊酯對(duì)抗氧化防御系統(tǒng)相關(guān)酶的影響 經(jīng)過(guò)72 h 的氯氟醚菊酯暴露后，與對(duì)照組相比，0.4 和0.8 μg/mL 的暴露組中3 種酶的活性均顯著下降，其中最高濃度處理組的SOD 和GSHPx 的酶活性分別僅占對(duì)照組的29.87%和44.36%(圖10D)，說(shuō)明氯氟醚菊酯暴露引起了斑馬魚抗氧化防御系統(tǒng)的崩潰，使得過(guò)量的ROS 無(wú)法被清除而導(dǎo)致氧化損傷。

3 結(jié)論與討論

氯氟醚菊酯是目前市場(chǎng)上銷量最大的衛(wèi)生用殺蟲劑品種之一，它的環(huán)境安全風(fēng)險(xiǎn)受到了廣泛關(guān)注。本研究通過(guò)研究氯氟醚菊酯急性暴露對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響，尤其是對(duì)其心血管系統(tǒng)發(fā)育的影響，評(píng)價(jià)了氯氟醚菊酯的環(huán)境安全風(fēng)險(xiǎn)和毒理學(xué)特征。

斑馬魚的胚胎期是其生命周期中最重要的時(shí)期之一，早期發(fā)育過(guò)程相對(duì)快速且容易觀察[21]。將斑馬魚胚胎暴露于四溴菊酯，發(fā)現(xiàn)四溴菊酯會(huì)導(dǎo)致斑馬魚的心血管發(fā)育異常和紅細(xì)胞生成障礙等，同時(shí)胚胎還發(fā)生了氧化應(yīng)激現(xiàn)象[22]。本研究結(jié)果表明，暴露于氯氟醚菊酯的斑馬魚胚胎出現(xiàn)了不同程度的畸形 (圖2A)，在0.4 和0.8 μg/mL的氯氟醚菊酯下暴露72 h 的斑馬魚畸形特征尤為顯著，并且卵黃囊水腫的畸形率最高 (圖2B)。這可能是因?yàn)槁腰S囊是由蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組成的透明囊泡，是為斑馬魚的早期發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)和支持的，其在受精卵形成后不久就開始退化變薄，蛋白質(zhì)和脂質(zhì)逐漸被胚胎吸收和利用，此時(shí)卵黃囊對(duì)外界污染物的抵抗能力下降，更易遭受氯氟醚菊酯的脅迫。此外，氯氟醚菊酯的暴露會(huì)造成斑馬魚胚胎及仔魚的早期發(fā)育毒性，如心率變化、體長(zhǎng)變短、頭眼發(fā)育缺陷等，這可能導(dǎo)致斑馬魚對(duì)外界刺激的反應(yīng)受損。

斑馬魚已被廣泛用作研究心臟發(fā)育、評(píng)估心臟結(jié)構(gòu)和功能、探索毒性機(jī)制以及進(jìn)行藥物篩選等研究的可信賴的模式生物[23]。Park 等的研究表明，衛(wèi)生用菊酯類殺蟲劑聯(lián)苯菊酯對(duì)斑馬魚胚胎最顯著的病理誘導(dǎo)特征是心臟水腫[24]。SV-BA 間距可反映斑馬魚心房和心室的位置變化，通過(guò)在體式顯微鏡下測(cè)量SV-BA 間距可判斷受試化合物對(duì)心臟的影響[25]。與對(duì)照相比，暴露于氯氟醚菊酯72 h 的斑馬魚仔魚心臟的SV-BA 間距顯著增大，心房心室出現(xiàn)明顯分化，這可能是由于氯氟醚菊酯誘導(dǎo)斑馬魚心臟發(fā)育異常，導(dǎo)致心腔變形，從而引起壓力改變，使得SV-BA 間距受到影響。心臟形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，暴露于氯氟醚菊酯的斑馬魚仔魚的心包面積與對(duì)照相比也顯著增加(圖4、圖5B)。myl7、myh6、vmhc分別調(diào)節(jié)心肌收縮、維持心肌結(jié)構(gòu)和推動(dòng)血液泵出，共同確保斑馬魚心臟的正常功能和循環(huán)系統(tǒng)的穩(wěn)定[26]。在心臟分化過(guò)程中，早在14 節(jié)段期就可以在前側(cè)板中胚層中觀察到肌球蛋白基因的表達(dá)，并且在少數(shù)細(xì)胞中開始表達(dá)myl7，它與肌球蛋白重鏈 (如myh6) 相互作用，形成心肌纖維的骨架[27]。vmhc主要參與心肌的收縮過(guò)程，推動(dòng)血液從心室排出[28]。這3 種基因的表達(dá)失調(diào)說(shuō)明斑馬魚的心肌細(xì)胞在氯氟醚菊酯誘導(dǎo)后功能受損 (圖7)，這可能與觀察到的心臟缺陷和心包水腫有關(guān)。這些結(jié)果表明，氯氟醚菊酯分別從發(fā)育、結(jié)構(gòu)和功能等方面對(duì)斑馬魚的心臟造成了嚴(yán)重?fù)p傷。

有研究表明，聯(lián)苯菊酯可通過(guò)抑制斑馬魚胚胎發(fā)育過(guò)程中的血管生成而抑制器官發(fā)育，其機(jī)制可能與腸道氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)[24]。本研究結(jié)果表明，氯氟醚菊酯可誘導(dǎo)斑馬魚心臟部位的血管發(fā)育異常 (圖8)，這說(shuō)明氯氟醚菊酯暴露可能影響了斑馬魚血管的運(yùn)輸功能，導(dǎo)致心臟無(wú)法正常供血，進(jìn)而影響心臟發(fā)育。這可能也是氯氟醚菊酯引起斑馬魚心臟毒性的原因之一，并且這一毒性可能是通過(guò)氧化應(yīng)激實(shí)現(xiàn)的。斑馬魚的腸下靜脈在胚胎發(fā)育中涉及到血液循環(huán)、營(yíng)養(yǎng)吸收、免疫功能和器官發(fā)育等功能，氯氟醚菊酯的暴露影響了腸下靜脈的均勻排列，與對(duì)照相比靜脈血管出現(xiàn)分支，排列雜亂 (圖9)，說(shuō)明氯氟醚菊酯誘導(dǎo)斑馬魚產(chǎn)生了不可逆的血管毒性，對(duì)其進(jìn)行研究有助于深入了解與斑馬魚胚胎發(fā)育相關(guān)的疾病和畸形的形成機(jī)制[29]。

擬除蟲菊酯類殺蟲劑，如氯氰菊酯可能會(huì)增加活性氧的產(chǎn)生，影響抗氧化酶的活性，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激，引起細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致代謝紊亂等[30-31]。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致機(jī)體組織產(chǎn)生病理表現(xiàn)的關(guān)鍵因素，心血管、肝臟等疾病都與活性氧 (ROS) 密切相關(guān)[32]。ROS 是重要的細(xì)胞信號(hào)分子，但過(guò)量的ROS 產(chǎn)生可能會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激和細(xì)胞損傷，導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞凋亡和死亡[33]。同時(shí)氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，破壞細(xì)胞膜的完整性，產(chǎn)生具有高活性的MDA[34]，這可能影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和DNA 損傷等不良效應(yīng)[35]，而魚類的抗氧化防御機(jī)制用來(lái)對(duì)抗氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化。有研究稱，家用菊酯類殺蟲劑炔丙菊酯和四氟苯菊酯等均能誘導(dǎo)斑馬魚抗氧化酶的變化，增加脂質(zhì)過(guò)氧化和氫過(guò)氧化物[36]。本研究也表明，氯氟醚菊酯誘導(dǎo)斑馬魚心臟部位產(chǎn)生了過(guò)量的ROS (圖10A)，同時(shí)SOD、CAT、GSH-Px 等抗氧化酶的活性也因藥物作用而減少 (圖10B)，MDA 含量顯著增加(圖10C)，這導(dǎo)致了氧化應(yīng)激的加劇，使細(xì)胞遭受不可逆轉(zhuǎn)的損傷，最終影響器官和組織的功能。

本研究使用斑馬魚為模型對(duì)氯氟醚菊酯的毒理學(xué)效應(yīng)進(jìn)行了探究。結(jié)果表明，氯氟醚菊酯對(duì)斑馬魚胚胎的72 h-LC50值為0.756 μg/mL；氯氟醚菊酯急性暴露引起了斑馬魚胚胎及仔魚的發(fā)育毒性 (心率變緩、孵化率降低、頭眼發(fā)育缺陷、體長(zhǎng)縮短) 和器官畸形 (心包水腫、卵黃囊腫大、脊柱和尾部彎曲)；心血管毒性 (心臟線性化、SVBA 間距增大、心房和心室分化、血管發(fā)育不完全) 和氧化應(yīng)激效應(yīng) (ROS 產(chǎn)生過(guò)量，MDA 含量增加，抗氧化酶活性降低)。本研究揭示了衛(wèi)生殺蟲劑氯氟醚菊酯的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)及毒性效應(yīng)，初步闡明了氯氟醚菊酯誘導(dǎo)斑馬魚胚胎及仔魚心臟毒性發(fā)生的潛在機(jī)制；研究結(jié)果增進(jìn)了氯氟醚菊酯的毒理學(xué)認(rèn)識(shí)，有利于促進(jìn)環(huán)境友好型衛(wèi)生殺蟲劑的開發(fā)和使用。