不同被毛顏色成年斯布牦牛生長性能比較及分子育種潛力分析

朱 勇， 阮鵬程， 俄廣鑫， 信金偉， 張 強(qiáng)， 陳曉英，曹涵文， 姜 輝， 鮮莉莉， 陸東祥， 張成福

（1.省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點實驗室，西藏拉薩 850002；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部青藏高原畜禽遺傳育種重點實驗室，西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏拉薩 850009；3.西南大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，重慶 400716）

斯布牦牛是青藏高原型牦牛的地方類群之一，其主產(chǎn)區(qū)為西藏自治區(qū)拉薩市墨竹工卡縣，群體數(shù)量1 萬余頭（姜輝等，20221）。 斯布牦牛被毛以黑褐色為主，少有棕色和灰色，是西藏地區(qū)公認(rèn)的三大優(yōu)良牦牛品種之一（姬秋梅等，2000）。 當(dāng)今， 斯布牦牛仍是產(chǎn)區(qū)牧民重要的資源和生產(chǎn)資料， 對牧區(qū)百姓脫貧增收和牦牛產(chǎn)業(yè)的提質(zhì)增效具有十分重要的意義。

近些年， 相關(guān)科研單位對斯布牦牛種質(zhì)利用與健康養(yǎng)殖開展了系列研究。 廖陽慈等（2018）研究發(fā)現(xiàn)， 斯布牦牛全舍飼條件下補(bǔ)飼可顯著提高冬春季牦牛的日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率。另外，姜輝等（2021） 利用安格斯與斯布牦牛進(jìn)行雜交生產(chǎn)F1 代安犏且雜種優(yōu)勢明顯， 特別是在F1 代6 ~12 月齡體重上顯著高于斯布牦牛。 然而F1 代犢牛哺乳能力不佳、 毛絨質(zhì)量差等不適于高海拔天然放牧飼養(yǎng)。 這說明雜交改良雖有助于提高后代生長性能， 但無法穩(wěn)定遺傳親本中牦牛良好的高原生態(tài)適應(yīng)力。所以，充分發(fā)揮牦牛在產(chǎn)區(qū)獨有的環(huán)境適應(yīng)性優(yōu)勢基礎(chǔ)上， 加快本品種選育步伐是我國牦牛產(chǎn)業(yè)提質(zhì)的關(guān)鍵。

當(dāng)前針對斯布牦牛，主要聚焦于飼養(yǎng)管理（鄧由飛等，2013）、營養(yǎng)需求（廖陽慈等，2018）、絨毛品質(zhì) （姬秋梅等，2004）、 肉品質(zhì)特征 （?，B等，2017）與屠宰副產(chǎn)物活性物質(zhì)（張玉卿等，2015）研究等。然而，對斯布牦牛生物學(xué)特性及育種潛力挖掘尚不充分。 本研究擬以墨竹工卡縣斯布牦牛核心選育場（保種）群體為研究對象，開展不同被毛顏色（黑色和棕色）類群成年生長性能分析，描述斯布牦牛種群生長曲線，同時，鑒定已明確與牦牛重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)遺傳標(biāo)記在斯布牦牛群體內(nèi)的優(yōu)勢基因型頻率， 為今后探索斯布牦牛適時出欄技術(shù)， 評估其分子育種潛力并為后續(xù)斯布牦牛分子選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 生長性能測定與分析 斯布牦牛生長性能測定在西藏自治區(qū)拉薩市墨竹工卡縣斯布牦牛選育場（東經(jīng)91°71’70”，北緯29°60’26”）開展。 以91 頭全棕色及60 頭黑色斯布牦牛為測定對象，測定前24 h 禁食，6 h 禁水。

依據(jù)《斯布牦?！罚―B54/T0071-2013）標(biāo)準(zhǔn)對成年斯布牦牛進(jìn)行生長性能測定， 測定指標(biāo)包括體重、體高、體斜長、胸圍及管圍。 測定數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間單因素方差分析檢驗利用SPSS 軟件計算，P＜0.05 和P＜0.01 為顯著性及極顯著性差異判定閾值。

1.2 重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)遺傳標(biāo)記基因型檢測于斯布牦牛選育場， 利用真空采血針分別采集棕色斯布牦牛96 頭及黑色斯布牦牛60 頭尾靜脈全血樣本，每頭約5 mL。全基因組DNA 利用吉恩生物DNA 提取試劑盒（吉恩生物，中國）提取，1%瓊脂糖凝膠電泳用于檢測基因組DNA 提取質(zhì)量，Nan0-400A （美國） 超微量核酸分析儀用于檢測DNA 提取濃度。

參考張強(qiáng)等（2022）報道的5 個已知牦牛重要經(jīng)濟(jì)性狀顯著相關(guān)遺傳標(biāo)記的分型引物信息，由武漢天一華煜基因科技有限公司（武漢，中國）合成引物。 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增體系包括：5 μL BioMed 2iTaq PCR Mix（北京博邁德基因技術(shù)有限公司， 北京），1.0 μL 的上下游引物混合液，全基因組DNA 50 ng，超純水補(bǔ)足至10 μL。 PCR擴(kuò)增程序為：96 ℃預(yù)變性7 min；95 ℃變性40 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸80 s，35 個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。 PCR 產(chǎn)物交由武漢天一華煜基因科技有限公司（武漢）完成后續(xù)SNaPshot 反應(yīng)，并使用ABI3130XL（美國）測序平臺開展基因分型。

利用Microsatellite Toolkit 宏文件執(zhí)行各遺傳標(biāo)記基因型數(shù)據(jù)編輯及相關(guān)遺傳參數(shù)統(tǒng)計， 包括多態(tài)信息含量（PIC）、觀察雜合度（HO）和期望雜合度（HE）等。 群體內(nèi)各位點的哈代溫伯格平衡（HWE）檢驗利用Arlequin 3.5 軟件評估（Schneider，2010）。

2 研究結(jié)果

2.1 不同被毛顏色斯布牦牛成年生長性能 由表1 可知， 斯布牦牛在5 ～7 歲齡其黑色與棕色群體在體重、體斜長與胸圍之間無顯著差異（P＞0.05）。 黑色群體在6、7 歲齡的體高極顯著 （P＜0.01）高于棕色群體，尤其是黑色群體的管圍在這三個年齡階段均顯著 （P＜0.05） 或極顯著 （P＜0.01）高于棕色斯布牦牛。 值得注意的是，盡管黑色群體的各項體尺指標(biāo)優(yōu)于棕色群體且體重?zé)o顯著差異， 但棕色群體在三個歲齡的體重均值均高于黑色群體，5、6、7 歲棕色與黑色斯布牦牛體重比分別為106.1%、108.5%、108.2%。

表1 不同被毛顏色斯布牦牛成年生長性能比較

2.2 不同被毛顏色斯布牦牛群體內(nèi)重要經(jīng)濟(jì)性狀候選標(biāo)記基因型頻率

2.2.1 黑色斯布牦牛群體內(nèi)5 個牦牛重要經(jīng)濟(jì)性狀候選標(biāo)記基因型頻率 由表2 可知， 黑色斯布牦牛群體中ACSL1-A2079T 位點基因型T/T 的頻率最高 （70.0000%）， 基因型A/A 的頻率最低（1.6667%）， 等位基因A 和T 的頻率分別為15.83%和84.17%。 而棕色群體內(nèi)ACSL1-A2079T位點基因型A/A 的頻率最高（60.4167%），基因型T/T 的頻率最低（6.2500%），等位基因A 和T 的頻率分別為77.08%和22.92%。 其次，ACSL1-G2409A 位點G/G 基因型在兩個群體內(nèi)均為最高，分別為81.6667%（黑色）和68.7500%（棕色）。MyoD1-C1710T 位點的雜合基因型G/A 在黑色（56.6667%）與棕色群體（46.8750%）內(nèi)均為最高頻率基因型。兩個群體內(nèi)的TMEM-18-C1267T 和TMEM-18-C4447T 位點的G/G 基因型頻率均為最高， 分別為70.0000%（黑色） 及70.8333%（棕色），而A/A 型頻率最低。

表2 黑色斯布牦牛群體內(nèi)5 個牦牛重要經(jīng)濟(jì)性狀候選標(biāo)記基因型頻率

2.2.2 棕色斯布牦牛群體內(nèi)5 個牦牛重要經(jīng)濟(jì)性狀候選標(biāo)記基因型頻率 由表3 可知， 兩個群體中各位點遺傳多樣性分析結(jié)果顯示，MyoD1-C1710T 在所有位點中期望雜合度最高， 分別為0.5020（黑色）和0.4960（棕色），而最低為黑色群體的ACSL1-G2409A （0.1679） 和棕色群體的TMEM-18-C4447T （0.2651）。 在兩個群體中PIC指標(biāo)最高的是MyoD1-C1710T，分別為0.3739（黑色） 和0.3717 （棕色）。 其中ACSL1-G2409A、TMEM-18-C1267T 和TMEM-18-C4447T 在兩個群體內(nèi)均為低度多態(tài)位點 （PIC＜0.25），MyoD1-C1710T 在兩個群體內(nèi)均為中度多態(tài)位點（0.25≤PIC＜0.5）。 HWE 分析結(jié)果顯示，各位點在兩個斯布牦牛類群中均為發(fā)生哈代溫伯格平衡顯著偏離（P＜0.05）。

表3 棕色斯布牦牛群體內(nèi)5 個牦牛重要經(jīng)濟(jì)性狀候選標(biāo)記基因型頻率

3 討論

毛進(jìn)彬等（2020）研究證實，牦牛從出生到成年其個體的體尺與體重變化隨年齡的增長遵循“前快后慢”的發(fā)育規(guī)律。 本研究通過對兩種不同被毛顏色的斯布牦牛成年個體的各階段體尺與體重比較發(fā)現(xiàn)， 盡管黑色群體較棕色個體的體尺指標(biāo)在某些階段略佳， 但棕色牦牛的體重卻更有優(yōu)勢。 Keys 等（2014）研究表明，體重指標(biāo)比體高等體尺指標(biāo)更加優(yōu)先適合于判定肥胖程度。 陳玲等（2023）、董靜超等（2021）、王志明等（2016）均從事關(guān)于家養(yǎng)動物體尺與體重的通徑分析及最優(yōu)回歸模型建立研究。然而，諸多結(jié)果顯示最終推演的體重-體尺最優(yōu)回歸模型差別迥異， 這可能不僅由于畜種及品種不同， 而且受到體尺和體重測定方法與指標(biāo)類別差異的影響。特別是，在同一品種及技術(shù)指標(biāo)基本一致條件下，裴杰等（2017）、劉更壽等（2016）、羅海青等（2016）、王偉（2012）的研究結(jié)論存在差異。 這可能是手動測定體尺數(shù)據(jù)受人為及動物體態(tài)等諸多因素影響而難以保證統(tǒng)一性和準(zhǔn)確性。本研究發(fā)現(xiàn)，棕色牦牛成年各階段體重平均值略優(yōu)于黑色類群，并未與體尺呈正相關(guān)，提示不同被毛顏色的牦牛群體可能不僅是外觀表型的差異，同時存在體型上不同的結(jié)構(gòu)發(fā)育特征。后續(xù)將通過屠宰性能測定等多方面研究加以明確棕色斯布牦牛成年體重優(yōu)勢特征的生理基礎(chǔ)。

本研究通過對5 個已明確與牦牛重要經(jīng)濟(jì)性狀顯著相關(guān)SNP 標(biāo)記在不同被毛顏色斯布牦牛種群的優(yōu)勢基因型分布進(jìn)行鑒定， 明確該系列標(biāo)記中多個位點在兩個斯布牦牛種群內(nèi)存在高比例優(yōu)勢基因型。 首先，作為肌肉調(diào)節(jié)因子（MRFS）家族重要成員，MyoD1 被廣泛證實參與骨骼肌生成調(diào)控，研究表明，其能夠通過促進(jìn)非肌細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧〖?xì)胞，調(diào)控肌細(xì)胞的融合，誘導(dǎo)成肌細(xì)胞分化為肌管， 進(jìn)而融合形成肌纖維 （Rovito 等，2021；Hodge 等，2019； Lee 等，2004）。 Dong 等（2019）和Liu 等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，MyoD1 基因的遺傳變異與家養(yǎng)動物的生長和肉品質(zhì)經(jīng)濟(jì)性狀存在顯著相關(guān)，朱春紅等（2016）發(fā)現(xiàn)，位于MyoD1 基因內(nèi)含子1 區(qū)的位點突變（T→A）與高郵鴨49 日齡的體重、胸肌重、胸肌橫截面積、胸肌纖維直徑以及胸肌纖維密度均顯著相關(guān)（P＜0.05），Wu 等（2012）發(fā)現(xiàn)，第2 內(nèi)含子1 個位點突變（A359T）與鴨8周齡體重顯著相關(guān)（P＜0.05）。 Du 等（2013）研究發(fā)現(xiàn)， 在MyoD1 的外顯子1 中的G782A 基因座（MyoD1 BglI）與包括牛西門塔爾及秦川黃等多個品種的腰肌面積顯著相關(guān)。在兔上，何樺（2013）研究證實，MyoD1 基因外顯子4 的同義突變SNP（c.783 GA）與天府黑兔、伊拉兔和香檳兔的全凈膛重、半凈膛重存在顯著相關(guān)（P＜0.05）。另外，黃興等（2019）已研究證實，申扎牦牛MyoD1 基因外顯子3 的SNP（MyoD1_C1710T）座位基因型與體尺性狀顯著（P＜0.05）關(guān)聯(lián)，且雜合的C/T 型為優(yōu)勢基因型。 本研究發(fā)現(xiàn)，該位點優(yōu)勢基因型（C/T）在黑色和棕色牦牛群體中較高，分別為56.6667%和46.8750%，暗示MyoD1_C1710T 標(biāo)記可作為斯布牦牛分子選育的重要標(biāo)記。

Ryu 等（2019）發(fā)現(xiàn)，跨膜蛋白家族是維持細(xì)胞各項生理與生物過程的重要組成成分。 Jurvansuu 等 （2008） 研究表明， 跨膜蛋白18（TEME18）可影響癌細(xì)胞的代謝和調(diào)節(jié)并參與神經(jīng)元干細(xì)胞的遷移。Marx 等（2020）和Landgraf 等（2020） 發(fā)現(xiàn)，TEME18 基因可通過神經(jīng)調(diào)節(jié)參與脂肪細(xì)胞分化， 從而影響機(jī)體肥胖程度。 Rask-Andersen 等 （2012）、Larder 等（2017）、Zlatohlavek等（2018）關(guān)于人與小鼠的研究證實，TMEM18 基因的表達(dá)水平及其遺傳變異與動物食欲及生長發(fā)育緊密相關(guān)。 畜牧領(lǐng)域上，Crispim（2015）、林平（2013）、馬偉（2017）有關(guān)研究報道稱，TMEM18 基因上多個SNP 變異與豬和牛的多項體格生長經(jīng)濟(jì)性狀存在顯著相關(guān)。當(dāng)前，張歡等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，2 個位于TMEM18 基因區(qū)域的SNP 標(biāo)記與牦牛體重、 屠宰率及多項體尺表型顯著相關(guān)， 包括TMEM18_C4447T 和TMEM18_ C1267T 座位。 尤其研究發(fā)現(xiàn)TMEM18_C4447T 位點的C（G）/T（A）和C（G）/C（G）基因型個體均比T（A）/T（A）型個體在胸圍、管圍及體斜長指標(biāo)上更具優(yōu)勢。本研究發(fā)現(xiàn)兩種被毛顏色斯布牦牛群體內(nèi)該座位的優(yōu)勢基因型比例均達(dá)98%以上。

Ma 等（2021）和Stierwalt 等（2021）已證實，長鏈酰基輔酶A 合成酶1（ACSL1）廣泛參與甘油三酯、 磷脂、 膽固醇酯的合成及脂肪酸氧化作用。Chen 等（2019）和Huh 等（2020）研究表明，肝臟細(xì)胞及脂肪細(xì)胞中過表達(dá)ACSL1 可增加長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)化為甘油三酯。 研究發(fā)現(xiàn)，ACSL1 表達(dá)水平及該基因的大量DNA 遺傳變異與奶牛及水牛泌乳量等經(jīng)濟(jì)性狀顯著相關(guān) （Lin 等，2022；Lee 等，2017；Lian 等，2016）。 牦牛上，李鈺璨等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，麥洼牦牛的泌乳期產(chǎn)乳量與ACSL1 等脂肪合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)水平有關(guān)。另外，趙志東等（2019）發(fā)現(xiàn)，ACSL1 基因啟動子區(qū)存在2 個SNP位點（ACSL1_A2079T 和ACSL1_G2409A）被證實與甘南牦牛的乳蛋白率及總固體物質(zhì)含量、 乳脂率等指標(biāo)顯著相關(guān)（P＜0.05），且ACSL1-A2079T的T/A 基因型為乳白蛋白率優(yōu)勢基因型，ACSL1_G2409A 位點的A/A 型為乳脂率和總固體含量指標(biāo)優(yōu)勢基因型。事實上，隨著牦牛產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，其相關(guān)乳制品的市場需求也日益旺盛（張藍(lán)月等，2022；王博等，2021）。 明確優(yōu)異牦牛類群泌乳性狀重要候選標(biāo)記的優(yōu)勢基因型頻率將有助于加速牦牛乳相關(guān)性狀的選育進(jìn)程， 提高牦牛產(chǎn)業(yè)的肉乳并行健康發(fā)展。 最后，本研究結(jié)果顯示全部5個遺傳標(biāo)記位點在兩種被毛顏色斯布牦牛種群中均未顯著偏離哈代溫伯格平衡（P＜0.05），表明斯布牦牛群體在歷史上應(yīng)該沒有經(jīng)歷關(guān)于生長及泌乳性能的強(qiáng)烈人工選擇。