超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同位素內(nèi)標(biāo)法測定羊肉中33種獸藥殘留

陳旭晉 曹佳 陸宇陽 苑華寧 章雪明 張小剛

摘要 ［目的］建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定羊肉中33種獸藥殘留的方法。［方法］樣品用90%乙腈水（含2.0%甲酸）提取，通過Oasis Prime HLB凈化，濃縮后用流動相定容。采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3 柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）分離。以甲醇和0.1%甲酸水為流動相梯度洗脫，在電噴霧離子源下正、負(fù)離子切換掃描，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式下，結(jié)合保留時間和特征離子信息，利用同位素內(nèi)標(biāo)法定量。［結(jié)果］33種獸藥在0.5～40.0 ng/mL線性關(guān)系良好（r＞0.99），最低檢出濃度在0.08～0.10 ng/mL。加標(biāo)回收率為83.7%～115.0%，RSD為0.58%～11.49%。［結(jié)論］該方法具有處理簡單、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點，滿足羊肉中33種獸藥的定量檢測。

關(guān)鍵詞 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；同位素內(nèi)標(biāo)；羊肉；獸藥殘留

中圖分類號 S851.34+7? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2024）03-0195-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.03.047

Determination of 33 Veterinary Drug Residues in Mutton by Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry with Isotope Internal Standard Method

Abstract ［Objective］To establish a method for the simultaneous determination of 33 kinds of veterinary drug residues in mutton by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. ［Method］The sample was extracted with 90% acetonitrile water （containing 2.0% formic acid）， purified by Oasis Prime HLB， concentrated， and diluted with mobile phase. Then separated by Waters ACQUITY UPLC HSS T3 column（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），using 0.1% formic acid and acetonitrile as mobile phase.Under electrospray ionization source， switching between positive and negative ion modes， in Multiple Reaction Monitoring （MRM） mode， utilizing the isotope internal standard method for quantification by combining retention time and characteristic ion information. ［Result］ The linear relationship of the 33 kinds of veterinary drugs was good in the concentration range of 0.5-40.0 ng/mL（r＞0.99），and the lowest detection concentration was 0.08-0.10 ng/mL.Adding standard recovery rates was 83.7%-115.0%，the RSD was 0.58%-11.49%. ［Conclusion］The method has the simple processing，high sensitivty and good reproducibility，and is suitable for the quantitative detection of 33 kinds of veterinary drug residues in mutton.

Key words UPLC-MS/MS;Isotope internal standard;Mutton;Veterinary drug residues

近年來，我國動物生產(chǎn)和獸藥使用量的增加已引起人們對獸藥殘留問題的廣泛關(guān)注。為控制動物產(chǎn)品中的獸藥殘留水平，我國已實施了多項措施，包括制定相關(guān)法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定了最大殘留限量，并實施了監(jiān)測計劃［1］。同時，對不遵守相關(guān)法規(guī)的個人或單位實施處罰。盡管如此，動物產(chǎn)品中仍然存在違禁獸藥殘留的情況［2-5］，需要持續(xù)加強(qiáng)監(jiān)管和控制措施。

獸藥殘留檢測是發(fā)現(xiàn)動物組織中違禁獸藥殘留的有效手段。獸藥殘留檢測面臨著許多技術(shù)難題，包括受獸藥種類、前處理方法、畜產(chǎn)品基質(zhì)等因素的影響。其中，前處理方法復(fù)雜耗時、檢測效率低以及缺乏多種類藥物殘留聯(lián)檢技術(shù)等問題尤為突出。隨著液質(zhì)聯(lián)用儀的發(fā)展，動物源性產(chǎn)品中多種獸藥殘留的聯(lián)合檢測技術(shù)已成為研究熱點。如徐偉等［6］利用WondaPak QuEChERS多獸藥殘留專用提取包和凈化包對豬肉中125種獸藥進(jìn)行檢測，20 min內(nèi)完成前處理，靈敏度和重現(xiàn)性均滿足日常檢測要求；許均圖等［7］利用Captiva EMR-Lipid凈化檢測雞肉中12種獸藥殘留，檢出限低且可以同時檢測雞肉中多類獸藥殘留；黃澤瑋等［8］采用QuEChERS EMR-Lipid技術(shù)結(jié)合LC-MS/MS對豬肉中55種獸藥殘留進(jìn)行快速的篩查和確證，55種化合物在30 min內(nèi)完成分離，方法快速有效；李永琴等［9］通過Oasis PRIME HLB凈化結(jié)合LC-MS/MS建立了對牛肉中12類80種獸藥及其代謝物的快速檢測方法，方法定量限在2.0～5.0 μg/kg，具有靈敏度高和重復(fù)性好的特點；張建偉等［10］建立了同時測定羊奶和牛奶中8大類43種藥物的殘留方法，樣品經(jīng)氨化乙腈和酸化乙腈水重復(fù)提取，低溫冷凍凈化除脂后，LC-MS/MS檢測，方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好且適用性強(qiáng)。羊肉含有豐富的蛋白質(zhì)、鐵、鋅、維生素B12等營養(yǎng)素，而且含有所有必需氨基酸。由于其獨特的口感和營養(yǎng)價值，羊肉深受消費者的喜愛。目前多殘留檢測技術(shù)在羊肉基質(zhì)上相關(guān)報道較少。

該研究旨在開發(fā)一種檢測羊肉中多種獸藥殘留的方法，選擇33種典型獸藥，采用通過式的凈化小柱結(jié)合LC-MS/MS技術(shù)進(jìn)行檢測，并通過同位素內(nèi)標(biāo)定量確保方法的準(zhǔn)確性和可靠性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要試劑和耗材。乙腈、甲醇、甲酸、乙酸銨（色譜純，美國霍尼韋爾公司）；試驗用水為 Milli-Q超純水（美國 Millipore）；Oasis Prime HLB 固相萃取柱（200 mg/6 mL，美國Waters公司）；Captiva EMR-Lipid固相萃取柱（300 mg/3 mL，美國Agilent公司）；Anavo HMR-Lipid固相萃取柱（300 mg/3 mL，北京納鷗科技有限公司）。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。喹諾酮類混標(biāo)、酰胺醇類藥物混標(biāo)、金剛烷胺、環(huán)丙沙星-D8、恩諾沙星-D5、氯霉素-D5、鹽酸金剛烷胺-D5（100 μg/mL，1 mL，天津阿爾塔科技有限公司）；磺胺類藥物混標(biāo)、β-受體激動劑藥物混標(biāo)、磺胺類同位素混標(biāo)、β-受體激動劑同位素混標(biāo)（100 μg/mL，1 mL，上海安譜實驗科技股份有限公司）。

1.1.3 主要儀器。QTRAP 5500串聯(lián)四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)（美國SCIEX）；H-Class超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters）；GD 16高速研磨均質(zhì)儀（深圳新銳精儀）；XcelVap自動濃縮工作站（美國Horizon）；5804R高速冷凍離心機(jī)（德國艾本德）。

1.2 試驗方法

1.2.1 前處理方法。

稱取樣品5.00 g于50 mL具塞離心管中，加入適量同位素內(nèi)標(biāo)物，加入90%乙腈水（含2.0%甲酸）9 mL，均質(zhì)提取3 min， 于離心機(jī)中10 000 r/min離心3 min。取3 mL上清液過Oasis Prime HLB 固相萃取柱，收集全部濾出液，渦旋混勻。45 ℃水浴氮吹濃縮至近干，用5%甲醇水溶液（含0.1%甲酸）定容至1 mL，過0.22 μm濾膜后上機(jī)。

1.2.2 液相條件。色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3 柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；流動相A為甲醇，流動相B為0.1%甲酸水；梯度洗脫程序見表1。

1.2.3 質(zhì)譜條件。

離子源為電噴霧離子源（ESI）。多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素為負(fù)離子掃描，其余化合物為正離子掃描。離子化電壓正離子模式為5 500 V，負(fù)離子模式為4 500 V。離子源溫度500 ℃。輔助加熱氣344.74 kPa。氣簾氣344.74 kPa。各化合物詳細(xì)參數(shù)見表2。

1.2.4 基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備。

取 7 份空白羊肉經(jīng)前處理氮吹干后的殘余物，依次加入 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 ng/mL的 33種藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 1 mL，其中內(nèi)標(biāo)濃度為5.0 ng/mL完全溶解后，過0.22 μm濾膜，得到基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的選擇

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的流動相體系一般為有機(jī)相加水相。有機(jī)相一般選擇甲醇和乙腈，乙腈相較于甲醇來說洗脫能力更強(qiáng)，但對目標(biāo)物和雜質(zhì)之間分離效果不如甲醇［11］。水相一般為純水或者添加適量的甲酸、乙酸銨。經(jīng)測試，當(dāng)有機(jī)相為乙腈時，33種獸藥中，西馬特羅有雜峰干擾。當(dāng)有機(jī)相為甲醇時，西馬特羅的目標(biāo)峰和雜峰可以完全分離，因此選擇甲醇為流動相。水相可以選擇純水或加入適量甲酸、乙酸銨，經(jīng)測試，甲酸的加入可以改善喹諾酮類藥物的峰型，而乙酸銨則會抑制部分獸藥的響應(yīng)。最終選擇甲醇-水（含0.1%甲酸）作為流動相，所有33種獸藥都能得到較好的分離。33種獸藥選擇離子流圖如圖1所示。

2.2 提取溶劑的選擇

這些獸藥化合物易溶于乙腈、甲醇等極性溶劑。當(dāng)提取含有較高動物性蛋白、脂肪的樣品時，使用極性強(qiáng)的甲醇提取液可能會導(dǎo)致一些問題，例如提取液渾濁、凈化處理時易堵塞固相萃取柱，以及濃縮后瓶壁上會附著難以溶解的凝結(jié)物，如白色的蛋白質(zhì)和脂肪。相比之下，乙腈對脂肪的溶解度較小，同時對蛋白質(zhì)具有沉淀作用。在這種情況下，乙腈是更好的選擇［12］。乙腈中加入甲酸或乙酸可以使提取環(huán)境呈酸性，有利于某些獸藥在提取過程中的離子化程度，提高它們的溶解度和提取效率。雖然乙腈會使蛋白變性凝聚的效果較好，但同時可能會阻礙目標(biāo)獸藥的提取。因此，在乙腈中加入部分的水輔助提取能取得較好的效果［13］。該試驗測試了不同濃度和不同含甲酸量的提取溶液，并統(tǒng)計了各類獸藥在質(zhì)譜上的平均峰面積。經(jīng)測試發(fā)現(xiàn)（圖2），提取液中水相比例的增加會影響某些獸藥的提取效率，而甲酸的含量同樣會影響各類獸藥的響應(yīng)，最終選擇90%乙腈水（含2.0%甲酸）為提取液。

2.3 固相萃取柱的選擇

該試驗研究了3種通過式凈化固相萃取小柱，即Oasis PRIME HLB、Captiva EMR-Lipid和Anavo HMR-Lipid。Oasis PRIME HLB可以有效吸附非極性干擾物，例如食品中的脂肪和磷脂，不需要活化和平衡步驟，直接可用于后續(xù)處理。Captiva EMR-Lipid和Anavo HMR-Lipid都能高效吸附脂類等雜質(zhì)，不需要活化和平衡步驟，直接可用于后續(xù)處理。通過對3種固相萃取小柱的凈化效果進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖3），Anavo HMR-Lipid對喹諾酮類藥物的吸附性較強(qiáng)，不適合試驗需求；Oasis PRIME HLB和Captiva EMR-Lipid的回收率均能滿足要求?？紤]到以90%乙腈水（含2.0%甲酸）為提取溶液時，Oasis PRIME HLB的過柱速度更快，且凈化效果更好，因此選擇Oasis PRIME HLB小柱。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)評價

在藥物殘留檢測中，采用質(zhì)譜技術(shù)可以提高檢測的靈敏度和選擇性，但在實際檢測中，基質(zhì)效應(yīng)（ME）是常見的影響檢測準(zhǔn)確性的干擾因素［14］?；|(zhì)效應(yīng)是指待檢測物質(zhì)以外的其他物質(zhì)共存時，對待檢測物質(zhì)的離子化效率、離子信號強(qiáng)度、碎片豐度等方面的影響，從而導(dǎo)致檢測結(jié)果偏高或偏低。同位素內(nèi)標(biāo)法是一種有效消除基質(zhì)效應(yīng)的方法，它不僅能抵消質(zhì)譜離子化時的基質(zhì)效應(yīng)，還能消除樣品前處理過程中的差異［15］。該研究使用羊肉樣品的空白基質(zhì)液和溶劑分別配制標(biāo)準(zhǔn)溶液并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過計算標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值來評價33種獸藥在羊肉中的基質(zhì)效應(yīng)（ME）。

ME為正值代表存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，ME為負(fù)值則代表存在基質(zhì)減弱效應(yīng)，當(dāng)ME的絕對值大于20%時，則代表基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)，應(yīng)采取措施減弱［16］。

從圖4～5可以看出，使用外標(biāo)法檢測時，除了少數(shù)獸藥外，其他獸藥存在強(qiáng)烈的基質(zhì)效應(yīng)，而羊肉基質(zhì)的復(fù)雜性和高蛋白含量會進(jìn)一步影響離子化效率。雖然使用內(nèi)標(biāo)法后仍有部分獸藥的ME絕對值大于20%，但相對于外標(biāo)法，其基質(zhì)效應(yīng)已明顯減弱。盡管內(nèi)標(biāo)法使用時，少數(shù)獸藥的基質(zhì)效應(yīng)有所增強(qiáng)，但為了提高定量準(zhǔn)確性，仍然建議使用內(nèi)標(biāo)校正方法。在考慮凈化過程中部分物質(zhì)損失的情況下，這仍是最佳選擇。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與靈敏度

以各獸藥化合物的質(zhì)量濃度（X， ng/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積與對應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y）， 得到各獸藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表3可知，33種獸藥在0.5～40.0 ng/mL線性關(guān)系良好（r>0.99）。在信噪比（S/N）為3時，最低檢出濃度在0.08～0.10 ng/mL。

2.6 準(zhǔn)確度和精密度

使用18個空白樣品，按照3個不同的加標(biāo)梯度和6個平行樣品的方式進(jìn)行加標(biāo)，然后經(jīng)過前處理和上機(jī)檢測，得出每種獸藥在不同加標(biāo)梯度下的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果表明，33種獸藥的平均回收率為83.7%～115.0%，RSD為0.58%～11.49%，符合GB/T 27404—2008的要求。

3 結(jié)論

該研究通過優(yōu)化前處理條件和儀器方法，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定羊肉中多種獸藥殘留的方法。通過90%乙腈水（含2.0%甲酸）提取，提取液經(jīng)Oasis Prime HLB凈化小柱凈化，同時采用了同位素內(nèi)標(biāo)和基質(zhì)配標(biāo)的方式來減少基質(zhì)效應(yīng)、消除試驗誤差，提高結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度。通過方法學(xué)驗證，該方法具有處理簡單、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點，滿足羊肉中同時測定多種獸藥殘留的需要。

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