ALA協(xié)同PASP強化伴礦景天提取土壤重金屬Cd的研究

蔡光容 蔡汶素 龔燕川 董雪 李志芳

摘要 ［目的］探究5-氨基酮戊酸（ALA）協(xié)同螯合劑聚天冬氨酸（PASP）增強伴礦景天提取土壤Cd的最佳條件。［方法］通過盆栽試驗，伴礦景天種植于Cd污染土壤（總Cd? 0.68 mg/kg）中，且在移栽45 d后開始澆灌不同添加濃度的PASP（3、6、12 g/kg，分別等分為3次使用，2～3次使用的間隔時間分別為15、30 d）；ALA（25 mmol/L）于PASP處理后第3天灌施，按不同的施用次數(shù)（0、1、2、3）處理，間隔時間同PASP處理。分析伴礦景莖長、地上部生物量、Cd含量和Cd提取量，建立各指標之間的相關性并擬合生物量和Cd提取量與PASP施用量、ALA使用次數(shù)的預測模型。［結果］ALA協(xié)同中等劑量（6 g/kg）PASP連續(xù)3次的施用能顯著提高伴礦景天莖長、地上部生物量、地上部分Cd含量和Cd提取量；線性回歸顯示PASP施用量和ALA施用次數(shù)是地上部分生物量和Cd提取量的關鍵影響因子；地上部分Cd提取量在PASP施用量為6 g/kg協(xié)同ALA 3次連續(xù)使用時達到最大，為1.09 g/盆，是CK提取量的2.79倍；地上部分生物量、莖長與ALA施用次數(shù)呈顯著正相關，而與PASP施用量呈顯著負相關。［結論］研究結果揭示了ALA協(xié)同PASP在強化伴礦景天提取土壤Cd具有重要意義，且需選擇合適的配比和施用次數(shù)。

關鍵詞 重金屬；5-氨基戊酮酸；聚天門冬氨酸；伴礦景天；Cd

中圖分類號 X53? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2024）03-0047-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.03.012

Study on Polyaspartic Acid（PASP） and 5-Aminovaleric Acid （ALA） to Enhance Extraction of Heavy Metal Cd from Soil by Sedum plumbizincicola

Abstract ［Objective］To explore the optimal conditions for enhancing the extraction of soil Cd from S. plumbizincicola by synergistic chelating agent polyaspartic acid （PASP） with 5-aminopyruvic acid （ALA）.［Method］ A pot experiment was conducted to plant S. plumbizincicola in Cd contaminated soil （total Cd 0.68 mg/kg）. After 45 d of transplanting， PASP was applied in different doses within 45 days： total application mounts of 3，6 and 12 g/kg （base on a dry soil） were equally divided into 1-3 applications， respectively， and the time intervals of 2-3 applications were 15， 30 days. ALA （25 mmol/L） was applied on the third day after each PASP treatment， and treated according to different application times （0，1，2，3）. The interval time was the same as that of PASP. The stem length， biomass， Cd content and amount of Cd extracted from aboveground part of S. plumbizincicola were analyzed， in addition to the correlation between the indexes was established，and fitted the prediction model of biomass and Cd extraction amount on PASP application rate and ALA use times.［Result］ALA combined with medium dose （6 g/kg） of PASP for three consecutive times could significantly increase the stem length， aboveground biomass， Cd content and extraction amount of S. plumbizincicola.Linear regression showed that PASP application rate and ALA application times were the key influencing factors of aboveground biomass and Cd extraction amount.The highest value of Cd extracted from aboveground part was 1.09 g/por when applying PASP in 6 mg/kg，which was 2.79 times higher than CK when it was used 3 times in combination with ALA.The aboveground biomass and stem length were significantly positively correlated with the application times of ALA， but negatively correlated with the application amount of PASP.［Conclusion］The results reveal that ALA assisted PASP had important significance in enhancing the extraction of soil cadmium by S. plumbizincicola， and it was necessary to choose the appropriate combination mode.

Key words Heavy metals;5-aminol-vulinic acid（ALA）;Polyaspartic acid （PASP）;Sedum plumbizincicola;Cd

隨著“石油”農(nóng)業(yè)的興起和工業(yè)化步伐加快導致我國土壤重金屬污染日趨嚴重，土壤治理技術備受關注。植物修復技術是采用重金屬超富集植物富集、回收土壤中的重金屬，具有成本低、綠色、環(huán)保等優(yōu)勢，該技術已得到廣泛的認可和應用［1］。伴礦景天（Sedum plumbizincicola），一種景天科植物，具有修復不同程度 Zn、Cd 污染土壤的功效，其富集能力強、生長周期短、適于刈割等特性［2-3］ 。單一種植超富集植物修復重金屬污染土壤一般因效率低則需要更長的時間，眾多的研究顯示重金屬富集植物與螯合劑配合使用可大大增加植物對重金屬的富集效率［4-5］，其中螯合劑的施用量是影響富集效率的重要因素，過量的螯合劑不僅不能增效反而對植物是一種環(huán)境脅迫［6-8］，因此如何平衡金屬富集植物與螯合劑之間的矛盾對植物-化學聯(lián)合技術在修復土壤重金屬污染中顯得至關重要。

一些植物生長調(diào)節(jié)劑通過改變植物生理生化過程從而達到調(diào)控植物生長發(fā)育的目的，尤其在逆境脅迫條件下能繼續(xù)保持植物生長發(fā)育是非常有必要的［9］。馬旭東等［10］研究認為聚天冬氨酸錳（Ⅱ）可增強干旱脅迫下小葉苦苣抗氧化能力，從而維持小葉苦苣正常生長發(fā)育；袁江等［11］研究表明可生物降解螯合劑谷氨酸N，N-二乙酸（GLDA）和植物激素可增強植物修復重金屬污染土壤的能力。張熹等［12］研究發(fā)現(xiàn)赤霉素（GA3）和乙二胺四乙酸（EDTA）可協(xié)同促進黑麥草對Cd的提取和富集，同時GA3可在一定程度上緩解EDTA和Cd對黑麥草的傷害。5-氨基酮戊酸（ALA）是一種環(huán)境友好的植物生長促進劑，通過改善植物光合作用、增加抗逆性，強化碳氮積累和生物量。孫陽等［13］揭示葉面噴施適宜濃度的ALA可以緩解低溫脅迫對玉米幼苗的損傷；呂婷婷等［14］研究表明ALA能夠有效緩解鹽脅迫對菘藍種子萌發(fā)及幼苗生長的傷害，提高植株的抗鹽性。農(nóng)業(yè)上聚天冬氨酸（PASP）可作為植物生長調(diào)節(jié)劑、土壤改良劑和金屬螯合劑，增強重金屬從土壤向植物轉移，提高土壤修復效率［15］。張鑫等［16］在盆栽模擬試驗中發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的PASP對玉米修復重金屬污染土壤有明顯的強化作用，過量使用PASP對玉米產(chǎn)生毒害。適量的ALA不僅促進植物生長、增加生物量，還能增加作物的抗逆性，PASP可改變土壤重金屬Cd的形態(tài)從而強化植物對重金屬的吸收，伴礦景天對金屬Cd的富集能力較好，然而ALA-PASP協(xié)同伴礦景天的精準技術還未建立。該試驗擬利用 PASP 強化伴礦景天對Cd的提取，同時用ALA促進生長，從而盡可能保障伴礦景天的最大Cd提取量，為此設計不同PASP施用量和ALA使用次數(shù)作為因變量，考察伴礦景天莖長、地上部分生物量、地上部分Cd提取量等參數(shù)，并擬合生物量和Cd提取量與PASP施用量和ALA使用次數(shù)的預測模型，以期為Cd污染土壤的修復提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

聚天冬氨酸（PASP，98%，分子量4 000 D，分析純）、5-氨基酮戊酸（ALA，98%，分析純）購置于阿拉丁生化科技股份有限公司。

供試重金屬污染土壤采自四川達州郊區(qū)一鋼鐵廠污染區(qū)周邊閑置土，土壤pH為6.18，有機質(zhì)含量為20.6 g/kg，全氮、全磷、全鉀、全鎘含量分別為1.91、0.51、14.30、0.68 g/kg。將采集表層0 ～15 cm的土壤樣品置于自然通風處晾干過2 mm篩，每盆裝土4.5 kg，基肥使用量（以土干重計算）N 200 mg/kg、P2O5 100 mg/kg和K2O 100 mg/kg，施用方式按照比例將CO（NH2）2、（NH4）2HPO4、K2SO4與土充分混合，室溫內(nèi)放置7 d備用。

供試伴礦景天采用扦插分枝育苗，種苗采自四川省達州市郊區(qū)一鐵礦礦區(qū)，于特色植物開發(fā)研究四川省高校重點實驗室植物生長室培養(yǎng)，溫度 25 ℃（光照）/18 ℃（黑暗），相對濕度60%～70%，光照時間16 h，光強為1.5×104 lx。育苗培養(yǎng)基采用蛭石-草炭土混合物（蛭石∶草炭土=1∶2），每隔7 d澆1次Hoagland 營養(yǎng)液，待分枝苗長出 3～4片葉后選擇大小一致、長勢良好的幼苗移栽入盆。

1.2 試驗設計與實施

盆栽試驗于 2020年 3 月至 2021年 7月在特色植物開發(fā)研究四川省高校重點實驗室盆栽場進行。試驗采取完全設計，共13個處理（表1），分別是CK（空白對照組）；45 d 內(nèi)將PASP分3次澆灌到土壤中，PASP低施用量3 g/kg（土壤干基計算），配合ALA使用0～3次，分別為L0～L3；PASP中施用量6 g/kg，配合ALA使用0～3次，分別為M0～M3；PASP高施用量 12 g/kg，配合ALA使用0～3次，分別為H0～H3；所有試驗調(diào)節(jié)劑的濃度均為25 mmol/L，每個處理重復3次，隨機組排列。2020年3月16日移植伴礦景天，每盆種3株，采用三角點布局。

每天澆2次水，早晚各1次，保持土壤持水量為最大持水量的60%～70%，苗移栽后30 d（2020年4月16日）追加一次肥，施用量為基肥的1/3，移栽后45 d左右（2020年5月1日）開始試驗3次處理：PSAP 配成溶液沖施，每次使用PSAP總量的1/3，隨后第3天澆灌ALA，第1次處理后15 d進行處理第2次，第2次處理30 d以后進行處理第3次，每次每盆澆灌500 mL溶液，第3次澆灌后15 d 測量莖長，采集樣品。

1.3 采樣與分析

收獲時用刀沿植株基部割地上部分，同時挖出其根部。地上部分分別用自來水、去離子水各洗滌2～3次，吸干水分，稱量鮮重，隨后將葉和莖分離；根部用超聲波清洗除去表面的泥土、20 mmol/L? EDTA 溶液萃取15 min 除去根表面的離子、隨后用去離子水漂洗2～3次，最后用吸水紙將根表面的水吸干。然后將根、莖、葉置于烘箱內(nèi) 105 ℃，保持30 min 后75 ℃ 烘干至恒重，然后用粉碎機磨碎、過 70 目篩，HNO3-HClO4消化，原子吸收分光光度法測定Cd濃度。

1.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

該研究所涉及的相關參數(shù)計算公式如下：

BCF=Cds /Ct（1）

TI=Cds/Bg（2）

Ecd=Cds×Bds×10-3（3）

式中：BCF 為富集系數(shù)，表示地上部富集土壤 Cd 的能力；TI 是轉移系數(shù)，表示將 Cd 從根部轉移到地上部的能力；Ecd為Cd提取量（g/盆），表示每盆伴礦景天地上部從土壤中提取 Cd 的量；Cds為地上部 Cd含量（mg/kg）；Ct為土壤中總Cd含量（mg/kg）；Bg為根部Cd含量（mg/kg）；Bds為每盆地上部的干重（kg）。

采用 SPSS 23.0 軟件進行相關數(shù)據(jù)統(tǒng)計，用最小顯著性差異法（LSD）進行差異顯著性分析（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 ALA協(xié)同PASP施用對伴礦景天莖長的影響

自然生長條件下，伴礦景天植株相對較矮小，影響其修復土壤的效率，作為Cd超富集植物，通過增加生物量來增加Cd的提取量是一種收集Cd的有效方法，伴礦景天地上部分主要由葉和莖組成，葉序之間的距離相對固定，因此，伴礦景天莖的長度可作為反映其對土壤重金屬提取能力的重要指標。PASP作為重金屬螯合劑，合理施用有利于增強植物對重金屬的吸收，但大劑量施用也會抑制植物生長發(fā)育，如圖1所示。低劑量（L0，3 g/kg）的PASP對伴礦景天的莖長影響很小，而隨著劑量的繼續(xù)增加伴礦景天莖長受到抑制，中等劑量（M0，6 g/kg）處理伴礦景天的莖長縮短7.01%，與空白對照比較未達到顯著水平，而高劑量（H0，12 g/kg）處理顯著抑制了伴礦景天的伸長生長，莖長僅為對照處理的61%，說明PASP在中、低劑量條件下施用是合適的。ALA可促進植物伸長生長，尤其是在脅迫條件下可緩解逆境帶來的負面影響。如圖1所示，低劑量的PSAP處理，ALA施用（1～3次）時顯著增加了伴礦景天莖長；中劑量PSAP處理對伴礦景天莖長有一定的抑制效應，ALA使用1或2次并不能緩解這種抑制，ALA持續(xù)使用3次時，PASP的這種抑制作用得到完全恢復并進一步促進生長，說明ALA連續(xù)3次使用協(xié)同中等劑量的PASP可以保障伴礦景天莖的生長；同等條件下高劑量PASP處理引起的抑制效應則得不到完全恢復?？傮w來看，ALA協(xié)同處理條件下，PASP在低劑量和中劑量之間差異并不顯著，低劑量與高劑量、中劑量與高劑量之間差異較顯著。由此可見，為了使伴礦景天Cd吸收能力、生物量均提高，PASP中等劑量與ALA連續(xù)3次使用是最理想的搭配。

2.2 ALA協(xié)同PASP施用對伴礦景天生物量的影響

生物量是反映重金屬超富集植物土壤重金屬提取能力的重要指標［13］。該試驗各處理伴礦景天地上部分生物量如圖2 所示。CK生物量為11.6 g/盆，L3和M3的生物量較CK顯著提高（P＜0.05），其中L3的生物量最高，為15.4 g/盆，較CK 提高了32.8%。從CK、L0、M0到H0，PASP用量逐漸增加生物量呈先增加后減少的趨勢。低、中劑量PASP有利于伴礦景天生長，中劑量略促進，與CK相比較，未達到顯著水平；高劑量PASP有一定的抑制作用，較CK生物量減少29.5%。與陽性對照（L0、M0、H0）相比，ALA對所有處理生物量均具有強化作用，尤其是在使用次數(shù)達到3次時促進作用達到同等條件的最大值；高劑量PSAP的處理條件下（H0），ALA 連續(xù)3次使用后生物量可以部分恢復。這些試驗結果說明ALA配合中等用量的PSAP施用可以保障生物量不減少的同時最大限度地使用螯合劑PASP。

2.3 ALA協(xié)同PASP施用對伴礦景天富集和轉移Cd的影響

伴礦景天各部位Cd含量體現(xiàn)不同器官對Cd富集能力的差異，Cd在植物不同器官之間的富集和轉移系數(shù)則反映植物整個系統(tǒng)富集和轉移分布特征［16］。由表2可知，低、中劑量的PASP顯著促進了伴礦景天根、莖、葉對Cd的吸收。尤其是低劑量處理（L0），根、莖、葉分別是對照（CK）的1.66倍、1.89倍和1.71倍。高劑量PASP（H0）對伴礦景天各部分Cd水平均有抑制趨勢，可能是因為高劑量的PASP對伴礦景天根有一定的毒害，根部木質(zhì)化比較嚴重，影響了物質(zhì)的吸收，導致根、莖和葉分別較CK降低了42.9%、16.2%、25.0%。ALA對低、中劑量的PASP處理的伴礦景天各器官Cd水平影響較小；對高劑量PASP處理有一定的促進Cd吸收的作用，且與ALA使用的次數(shù)呈正相關，當ALA連續(xù)使用3次（H3）時，與H0相比，根、莖、葉中的Cd提高了 18.8%、12.9%和27.8%。L0、M0的BCF值均顯著高于CK，說明PASP低、中劑量施用能提高地上部分對Cd的富集能力，ALA在PASP低、中、高劑量條件下均能提高Cd的富集能力。CK的TI為0.48，L0、M0、H0分別為0.56、0.72、0.84，均顯著高于CK，說明施用PASP能促進根部Cd向地上部轉移；ALA處理，L1～L3、M1～M3、H1～H3的TI平均值分別為0.53、0.72和0.81，與對應的陽性對照L0、M0、H0相當；可見ALA配合PASP使用對TI的影響是積極的。

2.4 ALA協(xié)同PASP施用對伴礦景天地上部分Cd提取量的影響

伴礦景天的根較地上部分莖纖細、量少，不便于收獲，因此人們利用它對Cd的富集主要集中到地上部分。由圖3可知，CK的Cd提取量為0.39 mg/盆，L0、M0、H0處理的提取量分別為0.68、0.81、0.19 mg/盆，低、中劑量PASP顯著增強了伴礦景天地上部分Cd提取量，當PASP在高劑量時顯著抑制了伴礦景天地上部分Cd提取量，抑制率為48.7%。說明適量施用PASP有利于伴礦景天對Cd的富集，過量施用PASP適得其反。L0～L3、M0～M3、H0～H3處理的Cd提取量分別為0.68～0.88、0.81～1.09、0.19～0.28 mg/盆，3組處理均呈依次遞增的趨勢，且在PASP施用量為6 g/kg協(xié)同ALA 3次連續(xù)使用（M3）時地上部分Cd提取量達到最大，為1.09 mg/盆，是CK提取量的2.79倍。這些結果說明調(diào)節(jié)劑ALA在強化伴礦景天Cd提取量方面發(fā)揮重要作用。

2.5 影響伴礦景天莖長、地上部分生物量、Cd 含量和 Cd 提取量的因素

為了探究影響伴礦景天莖長、地上部分生物量、Cd含量和Cd 提取量的因素，將其與PASP施用量和ALA使用次數(shù)進行相關性分析，結果如表3所示。從表3可以看出，伴礦景天地上部分Cd提取量與莖長、生物量、Cd 含量存在極顯著正相關關系（P＜0.01），相關系數(shù)分別為0.870、0.830、0.877，三者相當。說明用ALA協(xié)同PASP強化伴礦景天提取土壤Cd時，莖長、Cd含量和生物量提高都是關鍵因子。這與植株較大的象草提取Cd的影響因子Cd含量大于生物量的結果存在一定的差異［16］，可能是因為這2種作物Cd提取量限制因子不同所導致，象草植株相對較高大，株高（對應伴礦景天莖長）、生物量不是象草作為Cd提取量的主要限制因素，提高Cd提取量主要取決于Cd含量的高低；對于植物矮小、生物量相對較低的伴礦景天限制Cd提取量除了Cd含量，生物量、莖長也是關鍵的限制因素。

Cd含量與PASP施用量存在極顯著負相關關系（P＜0.01），相關系數(shù)為-0.725，結合表2可知，低、中劑量的PASP能強化伴礦景天對Cd富集，但是過量的PASP可能對伴礦景天生長產(chǎn)生脅迫，致使對Cd的富集能力減弱，這與張鑫等［16］和許偉偉等［17］的研究結果一致。因此，控制好PASP施用量對提高伴礦景天地上部分Cd含量是非常必要的。

生物量與ALA施用次數(shù)存在極顯著正相關關系（P＜0.01），相關系數(shù)為0.831，結合圖2可知ALA是增加伴礦景天生物量的關鍵影響因素。低劑量（3 g/kg）、中劑量（6 g/kg）的PASP本身對伴礦景天的生物量有一定的提高，這與前人研究的結果是一致的［18］。有研究顯示，適量的PASP能通過提高植物葉綠素的含量從而提高植物的光合能力，最終增加干物質(zhì)的積累［19］。高劑量（12 g/kg）的PASP本身對伴礦景天的生長有一定的抑制作用，此時配合3次ALA連續(xù)使用，既能強化Cd的吸收，又能部分緩解PASP帶來的脅迫。這與袁江等［11］的試驗結果相似，在 Cd 污染土壤中施加過量的金屬螯合劑 GLDA（6 mmol/kg）不利于龍葵 （Solanum nigrum L.）生長，產(chǎn)生脅迫作用，如同時協(xié)同植物生長促進劑IAA使用可緩解部分脅迫，顯著提高龍葵生物量和土壤 Cd 的提取能力。因此，推測低、中劑量的PASP提高了伴礦景天營養(yǎng)吸收、增強了植株光合能力的提高；高劑量的PASP抑制伴礦景天生物量的積累可能是因為PASP抑制了葉綠素合成以及大量元素吸收相關的酶的活性。同時該研究也觀察到高劑量的PASP處理伴礦景天根系顏色更深、木質(zhì)化較嚴重，這些因素都可能影響了伴礦景天對土壤中物質(zhì)的吸收，最終生物量降低，Cd的吸收也受到一定的影響。

莖長與ALA施用次數(shù)、地上部分生物量和地上部分Cd含量呈極顯著正相關，而與PASP施用量呈極顯著負相關，其相關系數(shù)分別為0.702、0.574、0.705和-0.834。結合圖1和圖2可見，莖長與生物量具有相似的變化趨勢。ALA連續(xù)使用促進了伴礦景天莖長的同時也提高了生物量，即使在高劑量的PASP處理條件下，這種趨勢依然存在，因此ALA提高生物量部分原因可能是因為促進莖長所致。

由此可見，在施加PSAP強化伴礦景天提取土壤Cd時需選擇中、低劑量比較合適，當存在抑制作用時可配合ALA使用來緩解PSAP帶來的負面調(diào)節(jié)，從而強化PSAP的效果。

2.6 伴礦景天地上部分生物量和地上部分Cd提取量的預測模型

建立預測模型為今后利用PASP和ALA輔助伴礦景天修復Cd污染土壤提供理論依據(jù)。伴礦景天地上部分Cd提取量是由其生物量和Cd含量所決定，地上部分生物量又與PASP施用量和ALA施用次數(shù)相關。該研究對地上部分生物量和Cd提取量分別擬合其與PASP施用量（a）和ALA施用次數(shù)（b）的線性回歸方程，結果如表4所示。地上部分生物量和地上部分Cd提取量的回歸模型的決定系數(shù)（R2）分別為0.790、0.785，解釋百分比相對較高；2個模型的德賓-沃森值（DW）分別為1.406和1.078，均接近于1，表明殘差項之間為較弱的正相關；F值均小于0.05，說明所建模型有效；方差膨脹因子（VIF）均接近1，說明PASP施加量和ALA使用次數(shù)之間共線性極弱。由此可見，PASP施加量和ALA使用次數(shù)很好地擬合了伴礦景天地上部分生物量和Cd提取量。

3 結論

（1）PASP施用量為3和6 g/kg時可明顯提高伴礦景天各器官中Cd 含量，同時也不會影響生物量的積累，PASP促進了Cd 吸收從而提高伴礦景天的 Cd 提取量；高劑量（12 g/kg）PASP 對伴礦景天生物量、Cd 吸收均呈現(xiàn)出不同程度抑制作用，最終降低了 Cd 提取量。

（2）25 mmol/L的ALA灌施可正向調(diào)控伴礦景天莖長、生物量，從而保障Cd提取量。尤其是在PASP 使用量為6 g/kg，ALA連續(xù)3次使用對伴礦景天Cd提取量的提高起到關鍵性的作用。

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