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    ‘黔核7號’去皮種仁多酚含量、抗氧化活性與多酚代謝關(guān)鍵酶活性的關(guān)系分析

    2024-03-10 11:24:36潘學(xué)軍洪艷陽史斌斌張文娥
    食品科學(xué) 2024年4期
    關(guān)鍵詞:種仁酚類硬核

    姜 熠,潘學(xué)軍,洪艷陽,史斌斌,2,李 雪,張文娥,

    (1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院,貴州省果樹工程技術(shù)研究中心,貴州 貴陽 550025;2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹科學(xué)研究所,貴州 貴陽 550025)

    泡核桃(Juglans sigillataDode)是我國西南地區(qū)原產(chǎn)的堅果樹種,因其果實飽滿、口感鮮美,在西南山區(qū)經(jīng)濟發(fā)展中占有重要地位。泡核桃全株酚類物質(zhì)含量豐富,尤其以單寧、蘆丁、鞣花酸、山柰酚等含量較高,這些酚類物質(zhì)不僅增加了泡核桃的抗逆能力,還為人類提供了優(yōu)質(zhì)的抗氧化食品資源[1-2]。種仁作為核桃主要的食用器官,因其多酚類物質(zhì)含量豐富、抗氧化能力較強而備受人們青睞。研究表明核桃仁中總多酚含量約是榛子的2 倍,是杏仁的4~6 倍[3];且抗氧化能力與自由基清除能力均較強[4]。在醫(yī)藥領(lǐng)域,核桃種仁中高多酚類物質(zhì)及不飽和脂肪酸可起到抗菌、抗炎、抗衰老、抗癌及神經(jīng)保護等多重作用[5-7];食用核桃仁有助于降低低密度脂蛋白、血清總膽固醇含量,能改善心血管疾病和降低心血管疾病風(fēng)險,對人類健康具有重要意義[8-9]。在營養(yǎng)學(xué)方面,核桃仁中高多酚含量能夠促進蛋白質(zhì)的溶解,有利于形成更多的氨基酸[10];同時作為天然抗氧化劑,能保護核仁中油脂的理化性質(zhì)及氧化穩(wěn)定性,起到重要的保健作用[11]。

    多酚類化合物作為重要的次生代謝物,主要通過苯丙氨酸和莽草酸途徑形成如黃酮類、單寧和酚酸等多種不同的多酚類物質(zhì),其合成受到多種相關(guān)酶的特異性調(diào)控[12-13]。研究表明,在中國野生稻和菠菜發(fā)芽過程中,苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase,PAL)、查耳酮合酶(chalcone synthase,CHS)和查耳酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase,CHI)活性升高有利于酚酸物質(zhì)的合成[14-15]。高PAL、4-香豆酸-CoA連接酶(4-coumarate coenzyme A ligase,4CL)、肉桂酸4-羥化酶(cinnamate 4-hydroxylase,C4H)活性能促進綠原酸、對香豆酸、蘆丁、咖啡酸的合成[16]。在梨果實中,酚類物質(zhì)含量與PAL活性均呈極顯著正相關(guān)[17]。紅核桃種皮中花青素的積累與種仁充實期PAL、花青素還原酶(anthocyanidin synthase,ANS)的高活性具有密切聯(lián)系[18]。泡核桃種皮中總酚含量與PAL活性呈極顯著正相關(guān)[19]。此外,在核桃的不同發(fā)育階段,酚類物質(zhì)合成與相關(guān)途徑中酶活性也有所差異[18,20]。在泡核桃青皮中,果實發(fā)育后期CHS活性的增加促進了楊梅素的合成[21];果實硬核期,種皮中丁香酸、蘆丁的高效積累離不開分支酸變位酶(chorismate mutase,CM)、C4H、4CL的作用,而在成熟期,PAL、CHS則發(fā)揮更重要的作用[19]。由于種皮中多酚物質(zhì)是苦澀味的重要來源,一直影響核桃仁的色澤和食用口感,一直以來鮮食核桃以去皮種仁為主要食用部位[22],但目前對泡核桃去皮種仁中酚類物質(zhì)含量、抗氧化能力與多酚代謝關(guān)鍵酶活性三者之間的關(guān)系還不甚了解,因此探究三者之間的關(guān)系對核桃品質(zhì)的調(diào)控有很大的價值。

    本實驗以不同發(fā)育時期‘黔核7號’果實為研究材料,采用動態(tài)取樣的方法,對泡核桃果實發(fā)育期的種仁總酚含量、主要單體酚種類和含量、抗氧化活性進行測定,探究泡核桃種仁中酚類物質(zhì)積累及抗氧化活性的變化規(guī)律,以期為調(diào)控種仁品質(zhì)和確定最佳采收期、促進泡核桃功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    以盛果期的泡核桃優(yōu)良品種‘黔核7號’(J.sigillataDode cv.‘Qianhe 7’)的果實為研究材料,選擇樹冠中部外圍核桃果實,分別于硬核期(1/7~15/7(日期/月份,下同))、種仁充實期(1/8~15/8)、成熟期(1/9~10/9)3 個時期取樣,用冰盒帶回實驗室,去除青皮和硬殼后,將種皮與種仁分離,按測定指標(biāo)分樣液氮冷凍,-70 ℃冰箱保存。

    2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)、1,1-二苯基-2-苦肼基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)上海源葉生物科技有限公司;丁香酸、咖啡酸、阿魏酸、兒茶素、沒食子酸、蘆丁、對香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司;Folin-Ciocalteu試劑 北京萊寶科技有限公司;酶聯(lián)免疫試劑盒 深圳子科生物科技有限公司;甲醇為國產(chǎn)色譜純,其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    LC-15C高效液相色譜儀、UV-2550型紫外-可見分光光度計 日本島津公司;TDL-4型離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;Elx808型酶標(biāo)儀 美國賽默飛世爾科技有限公司;KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 泡核桃多酚類物質(zhì)提取

    取新鮮種仁0.5 g(3 次重復(fù)),加入5 mL 50%甲醇溶液充分研磨,在50 ℃下40 kHz超聲提取40 min,重復(fù)2 次,合并提取液。提取液8000 r/min離心10 min,減壓濃縮至膏狀,加入50%甲醇溶液定容至5 mL,并置于4 ℃冷藏備用。

    1.3.2 總酚和總黃酮含量測定

    總酚含量參考Conde-Hernández等[23]所用Folin-Ciocalteu法測定。將不同質(zhì)量濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液(0.2 mL)與0.4 mL Folin-Ciocalteu試劑、2.5 mL 200 mg/mL Na2CO3溶液混合,定容至10 mL,25 ℃下水浴2 h后,使用紫外-可見分光光度計檢測765 nm波長處吸光度,繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=11.925x-0.0765,R2=0.9995。將上述方法中沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液換成多酚提取液,765 nm波長處測定吸光度,按照上述得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出多酚提取液中總酚的含量,結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量表示(以鮮質(zhì)量計),單位為mg/g。

    總黃酮含量測定參考Feng Simin等[24]的方法。將不同質(zhì)量濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液(0.3 mL)與1 mL 50 mg/mL NaNO2混合,6 min后加入1 mL 100 mg/mL Al(NO3)3溶液,6 min后加入3 mL 1 mol/L NaOH溶液,定容至10 mL,25 ℃水浴15 min后,使用紫外-可見分光光度計檢測510 nm波長處吸光度,繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=0.0945x+0.0276,R2=0.9986。將上述方法中蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液換成多酚提取液,510 nm波長處測定吸光度,按照上述得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出多酚提取液中總黃酮的含量,結(jié)果以蘆丁當(dāng)量表示(以鮮質(zhì)量計),單位為mg/g。

    1.3.3 高效液相色譜分析

    多酚組分的測定采用LC-15C高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)系統(tǒng),用0.22 μm濾膜過濾提取液,自動進樣器進樣。色譜條件:C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱溫25 ℃,進樣量10 μL,流速0.9 mL/min。流動相A為0.8%乙酸溶液,B為色譜純甲醇。采用兩種洗脫梯度:1)0~10 min,90%~80% A、10%~20% B;10~25 min,80%~50% A、20%~50% B;25~35 min,50% A、50% B;35~40 min,50%~90% A、50%~10% B。在280 nm波長處檢測兒茶素、丁香酸、丁香醛、沒食子酸、綠原酸、對香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、表兒茶素。2)0~10 min,90%~60% A、10%~40% B;10~25 min,60%~40% A、40%~60% B;25~30 min,40%~30% A、60%~70% B;35~40 min,30%~90% A、70%~10% B。在251 nm波長處檢測胡桃醌、鞣花酸、蘆丁、楊梅素、槲皮素。

    1.3.4 抗氧化活性測定

    參照Benzie等[25]的方法測定鐵離子還原能力(ferric ion reducing antioxidant power,F(xiàn)RAP)。以1.0 mmol/L FeSO4溶液為標(biāo)準(zhǔn),樣品的FRAP以達到相同吸光度所需FeSO4物質(zhì)的量表示,單位為mmol/g。DPPH自由基清除能力的測定參照Ao Changwei等[26]的方法;ABTS陽離子自由基清除能力的測定參照J(rèn)un等[27]的方法,結(jié)果均用半清除濃度(half-maximal inhibitory concentration,IC50)表示。

    1.3.5 多酚代謝關(guān)鍵酶活性測定

    PAL和CHI活性測定參照Lister等[28]的方法;4CL活性測定參考陳建業(yè)[29]的方法;使用酶聯(lián)免疫試劑盒測定分支酸合成酶(chorismate synthase,CS)、CM、CHS、C4H活性。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同發(fā)育時期泡核桃種仁總酚、總黃酮含量變化規(guī)律

    如圖1所示,與核桃果實青皮和種皮內(nèi)多酚含量相比,核桃種仁中的總酚含量偏低,平均為0.04 mg/g。隨著果實的不斷發(fā)育,種仁內(nèi)總酚含量整體呈現(xiàn)不斷上升的趨勢。在硬核期至種仁充實期(1/7~15/8)總酚含量上升速度較快,增幅較大,從種仁充實期到成熟期(15/8~10/9)總酚含量變化較為平緩,至成熟期(10/9)達到最大值(0.05 mg/g)。種仁中總黃酮含量峰值也出現(xiàn)在成熟期(10/9),可達到0.03 mg/g,其在硬核期至成熟初期(1/7~1/9)均未檢測到,僅在成熟后期(10/9)進行快速積累。

    圖1 泡核桃去皮種仁發(fā)育過程中種仁的總酚、總黃酮含量變化Fig.1 Changes in the contents of total phenols and total flavonoidsduring the development process of J.sigillata Dode kernels

    2.2 泡核桃多酚組成及含量

    參照14 種單體酚標(biāo)準(zhǔn)品在280 nm和251 nm波長處的HPLC圖譜,鑒定出泡核桃‘黔核7號’種仁中含有苯甲酸類(沒食子酸、丁香酸)、肉桂酸類(咖啡酸、阿魏酸、對香豆酸)、黃酮醇類(蘆丁、槲皮素)、黃烷-3-醇類(兒茶素)共8 種單體酚。如表1所示,各單體酚在去皮種仁發(fā)育過程中變化規(guī)律差異較大,丁香酸含量最多,平均含量在1.0 mg/100 g(鮮質(zhì)量計,下同)以上;其次為兒茶素、沒食子酸和蘆丁,平均含量在0.5~1.0 mg/100 g;再次是槲皮素和咖啡酸,平均含量均在0.2~0.5 mg/100 g;對香豆酸和阿魏酸平均含量低于0.1 mg/100 g。沒食子酸在硬核前期(1/7)含量最低,于硬核后期至種仁充實前期(15/7~15/8)趨于穩(wěn)定,成熟期略有下降;兒茶素含量在硬核前期(1/7)達到最高,之后逐漸下降,在種仁充實后期含量最低,至成熟期(1/9~10/9)略有上升;丁香酸從硬核期到種仁充實期含量總體逐漸上升,在種仁充實后期(15/8)含量最高,成熟期顯著下降至最低;蘆丁在硬核后期(15/7)大量合成并達到最高值,隨后有所下降。此外,在種仁硬核前期,咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、槲皮素含量極低,無法檢測,但隨著種仁發(fā)育,咖啡酸、對香豆酸含量于硬核后期(15/7),阿魏酸和槲皮素含量于種仁充實前期(1/8)出現(xiàn)上升,除對香豆酸在種仁充實前期(1/8)達到峰值,其余3 種多酚類物質(zhì)均在成熟前期(1/9)達到峰值。

    表1 泡核桃種仁中單體酚含量動態(tài)變化Table 1 Dynamic changes in the contents of monomeric phenols in J.sigillata Dode kernels mg/100 g

    2.3 泡核桃抗氧化活性

    隨著果實發(fā)育,去皮種仁FRAP 不斷增強,說明抗氧化活性提高,F(xiàn)RAP在成熟期達到最強,為0.019 mmol/g,是硬核前期(1/7)的1.9 倍(圖2A)。由圖2B、C可知,ABTS陽離子自由基和DPPH自由基的IC50隨著果實發(fā)育不斷降低,表明去皮種仁的自由基清除能力不斷增強,至果實成熟期(10/9)達到峰值,分別為16.86 mg/mL和43.57 mg/mL。

    圖2 不同發(fā)育時期泡核桃中FRAP(A)、DPPH自由基清除能力(B)、ABTS陽離子自由基清除能力(C)變化Fig.2 Changes in FRAP (A),DPPH radical scavenging capacity (B),and ABTS cation radical scavenging capacity (C) in J.sigillata Dode kernels during different development periods

    2.4 泡核桃種仁莽草酸途徑關(guān)鍵酶活性

    CS與CM作為莽草酸途徑中重要的代謝酶,能影響果實酚類物質(zhì)的積累。如圖3所示,‘黔核7號’去皮種仁莽草酸途徑CS、CM活性變化趨勢相似。其中,CS活性在硬核期(1/7~1/8)持續(xù)上升,在種仁充實期(1/8~15/8)維持較高的活性,約達到0.160 U/mg,隨后開始逐漸下降,在成熟后期(10/9)降至0.061 U/mg;CM活性在硬核期至種仁充實前期(1/7~1/8)平穩(wěn)上升,于種仁充實后期(15/8)活性突然增大并達到最大值0.131 U/mg,隨后逐漸下降。

    圖3 泡核桃種仁中莽草酸生物途徑CS、CM活性變化Fig.3 Changes in CS and CM activities in the shikimic acid biosynthesis pathway in J.sigillata Dode kernels

    2.5 泡核桃種仁苯丙烷-類黃酮合成途徑關(guān)鍵酶活性

    如圖4所示,隨著果實的發(fā)育,‘黔核7號’去皮種仁中PAL活性先快速上升,在種仁充實后期(15/8)達到最大值(0.186 U/mg),隨后開始下降;C4H活性呈“N”字型變化趨勢,最高峰值出現(xiàn)在果實成熟后期(10/9),達到0.52 U/mg;4CL、CHS和CHI活性變化趨勢相同,總體呈先迅速下降后略有上升的趨勢,在成熟后期(10/9)分別回升至0.055、0.242、0.023 U/mg,活性較硬核前期分別降低了77.6%、67.4%、59.6%。結(jié)果表明,不同發(fā)育時期酶活性變化存在的較大差異,可能是不同酶側(cè)重合成的物質(zhì)不同所導(dǎo)致。

    圖4 泡核桃種仁發(fā)育過程中PAL、C4H、4CL、CHS、CHI活性變化Fig.4 Changes in PAL,C4H,4CL,CHS and CHI activities during the development process of J.sigillata Dode kernels

    2.6 種仁抗氧化活性與多酚含量相關(guān)性

    如圖5所示,種仁總酚含量與FRAP呈顯著正相關(guān),與DPPH自由基、ABTS陽離子自由基IC50呈極顯著負(fù)相關(guān)。咖啡酸含量和阿魏酸含量同抗氧化活性的相關(guān)性規(guī)律相似,均與DPPH自由基、ABTS陽離子自由基IC50呈負(fù)相關(guān);兒茶素、丁香酸、蘆丁含量同抗氧化活性的相關(guān)性規(guī)律相似,均與FRAP呈負(fù)相關(guān),與DPPH自由基、ABTS陽離子自由基IC50呈正相關(guān);沒食子酸、對香豆酸、槲皮素含量與FRAP呈正相關(guān),與DPPH自由基、ABTS陽離子自由基IC50呈負(fù)相關(guān),但均未達到顯著水平。

    圖5 泡核桃種仁多酚類物質(zhì)含量及抗氧化活性之間的相關(guān)性Fig.5 Correlation between phenol contents and antioxidant activity in J.sigillata kernels

    2.7 種仁多酚代謝關(guān)鍵酶活性與多酚含量的相關(guān)性

    圖6為多酚代謝關(guān)鍵酶活性與多酚組分含量的相關(guān)性。在莽草酸合成途徑中,種仁總酚、咖啡酸、阿魏酸、槲皮素的積累均與CS活性呈負(fù)相關(guān),與CM活性呈正相關(guān),其中槲皮素的積累與CM活性達顯著正相關(guān);沒食子酸、丁香酸、對香豆酸含量與CS、CM活性均呈正相關(guān),其中丁香酸積累與CS活性相關(guān)性達極顯著水平。在苯丙烷合成途徑中,種仁總酚的積累與PAL、C4H活性呈正相關(guān),其中與C4H活性呈顯著正相關(guān),與4CL、CHI活性呈顯著負(fù)相關(guān),與總酚含量和代謝關(guān)鍵酶活性相關(guān)性趨勢相同的還有沒食子酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸和槲皮素,而兒茶素與之相反;兒茶素的積累與4CL、CHS、CHI活性呈正相關(guān),與PAL和C4H活性呈負(fù)相關(guān);丁香酸的積累與PAL、4CL活性呈正相關(guān);蘆丁的積累與C4H活性呈負(fù)相關(guān),但與PAL、4CL、CHS、CHI活性均呈正相關(guān)。

    圖6 泡核桃種仁多酚類物質(zhì)含量與其合成代謝關(guān)鍵酶活性間的相關(guān)性Fig.6 Correlation between phenol contents and the activities of key enzymes involved in phenol synthesis and metabolism in J.sigillata Dode kernels

    3 討論

    酚類物質(zhì)是植物生長發(fā)育和抗逆生理中不可或缺的次生代謝物,同時也是構(gòu)成園藝作物品質(zhì)的重要風(fēng)味物質(zhì)[30]。已有研究表明,核桃中的多酚類物質(zhì)含量和種類在不同器官中的差異很大[31]。在核桃葉片[23]、青皮[32]、枝條[31]等器官中都已證明有大量酚類物質(zhì)積累。在果實中,總酚含量從高到低依次為種皮、青皮、種仁和分心木[33-34];也有研究表明核桃分心木中多酚含量最高,這與品種有很大關(guān)系[11]。而總黃酮含量從高到低依次分心木、種皮、青皮、種仁[11,19,35]。種皮中鑒定到20 種以上的多酚類物質(zhì),胡桃醌、丁香酸和鞣花酸的濃度高出種仁20 倍[36],原花青素高達15 種[13];青皮中鑒定出13 種酚類化合物,以胡桃苷含量最高[37];核桃分心木中鑒定出7 種類黃酮化合物,以兒茶素含量最高[34]。本研究在泡核桃‘黔核7號’種仁中檢測到兒茶素、丁香酸等8 種單體酚,平均含量以丁香酸最高,兒茶素次之,阿魏酸最低;各單體酚組分變化規(guī)律雖不同,但總體來看隨著果實成熟先升高后降低。與種皮、青皮相比,去皮種仁中總酚、總黃酮含量雖然也較低[38-39],但與種皮一同食用能降低澀味,口感清香、略帶回甜,同時種仁中蛋白與多酚相互作用,能夠促進多酚在胃腸道中的釋放和吸收[40-41]。

    多酚物質(zhì)在果實不同部位中的抗氧化性能也有所不同[42-43]。前人研究指出,青皮中自由基清除能力在硬核后期達到最高,隨后降低[35]。果實中種皮的DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力及FRAP最強,自由基清除能力隨果實的成熟而增加[19,44]。由于黃酮類物質(zhì)的存在使得核桃分心木具有較強的還原力和DPPH自由基清除能力[45]。本研究結(jié)果顯示,抗氧化能力與自由基清除能力都隨果實的發(fā)育而不斷增強,均在果實成熟期達到峰值??偡印⒖Х人?、沒食子酸、槲皮素、阿魏酸含量與FRAP呈正相關(guān);自由基IC50與兒茶素、蘆丁、丁香酸含量呈正相關(guān)。表明不同的單體酚在抗氧化和自由基清除能力上有不同程度的偏向性,可能存在相互協(xié)同及拮抗作用,這種關(guān)系不僅取決于酚類物質(zhì)含量,還取決于不同酚類物質(zhì)的特性及其化學(xué)結(jié)構(gòu),其中游離態(tài)多酚物質(zhì)更能在抗氧化中發(fā)揮作用[46]。

    核桃中苯丙烷-類黃酮合成途徑代謝酶活性與酚類物質(zhì)合成密切相關(guān)。在本研究中,‘黔核7號’去皮種仁發(fā)育前期沒食子酸、兒茶素、丁香酸和蘆丁最先開始合成,相關(guān)合成途徑中4CL、CHS、CHI活性最高,隨著果實的發(fā)育,CM、PAL、C4H活性開始增加,沒食子酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、槲皮素大量合成;在種仁充實期CS、CM、PAL活性更高,在成熟期C4H活性最高。進一步表明酚類物質(zhì)的合成運輸有偏向性,與酶活性、發(fā)育時期有關(guān)[47-48]。CM、PAL、C4H在種仁酚類物質(zhì)的積累上起到重要的作用,其調(diào)控著種仁中多酚物質(zhì)的合成,以維持其中高抗氧化活性[19,44]。此外,種仁中多酚還能有效抑制核桃油脂氧化,提供含有生物活性多酚的富集油,從而可通過膳食獲得適宜攝入量的多酚[49-50]。采收時期直接影響果實的產(chǎn)量和品質(zhì),本研究中,隨著果實的成熟,完熟期‘黔核7號’去皮種仁總酚、總黃酮含量、抗氧化活性均處于發(fā)育時期的較高水平,同時,研究表明鮮食去皮核桃的開發(fā)能延長貨架期[51],還能在保證較高營養(yǎng)價值的的基礎(chǔ)上,提高食用口感。

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