腦絡通顆粒對腦缺血再灌注損傷大鼠凋亡及PRMT5、p53 的影響*

馬莉，董園振，李良勇

1 安徽中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院 安徽合肥 230011

2 上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院安徽醫(yī)院 安徽合肥 230000

3 安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031

腦梗死是由于各種原因導致腦血流供應障礙，引發(fā)腦組織缺血、缺氧，從而形成的一系列神經功能缺損的臨床綜合征[1]。急性腦梗死早期注重靜脈溶栓及血管內治療[2]，能在腦血流阻斷后快速恢復腦組織血液供應，在腦組織血流重新恢復的同時，再灌注的血流同樣也會造成血腦屏障的破壞、加重腦細胞的凋亡，出現腦出血、腦水腫等并發(fā)癥[3]，此現象稱為腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）。研究表明，腦絡通顆粒對腦梗死有顯著的療效，可明顯改善患者的神經功能和側枝循環(huán)等，但對腦缺血再灌注損傷目前尚無相應的研究[4]。細胞凋亡參與了腦缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展的過程，是其重要的發(fā)病機制，及時阻止神經細胞凋亡程序的啟動能夠有效的保護神經功能[5]。本研究旨在探討腦絡通顆粒對大鼠腦缺血再灌注損傷及其神經細胞凋亡是否有神經保護作用，并進一步發(fā)掘其作用機制，同時為中醫(yī)藥在臨床中治療腦缺血再灌注損傷提供更多的實驗依據。

材料與方法

1 實驗動物

健康成年SPF 級雄性SD 大鼠36 只，體重250 ～280 g。采用隨機數字表法將所有大鼠分成假手術組（Sham）、模型組（MCAO/R）和腦絡通組（NLT）。在室溫20 ～ 25℃和相對濕度50 ～ 60%的環(huán)境下飼養(yǎng)大鼠，飼養(yǎng)籠保持清潔，實驗動物于造模前適應性飼養(yǎng)7 天。本研究獲得安徽中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審核批準。

2 主要藥物與試劑

腦絡通顆粒（黃芪 20g，當歸 10g，赤芍 10g，川芎6g，葛根 15g，石菖蒲 10g，地龍 10g，熟地黃 6g），所有藥物由安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房提供。Caspase-3（批號：9661T，CST），p53（批號：60283-2-IG，proteintech），PRMT5（批號：79998S，CST），Bcl-2（批號：AF6139，Affinity），β-actin（批號：WL01372，購自沈陽萬類生物科技有限公司），TUNEL 試劑盒（貨號：G002-1-2，購自南京建成生物科技有限公司），TTC 染色試劑（貨號：G3005，索萊寶）。

3 主要儀器

實驗方法臺式高速冷凍離心機（H1650R，上海盧湘儀），臺式低速離心機（TDZ6B-WS，上海盧湘儀），電動玻璃勻漿機（DY89-Ⅱ，寧波新芝生物科技股份有限公司），微量加樣器（Bio-DL），酶標儀（SPECTRA max Plus 384，Molecular Devices 公司），電泳系統(tǒng)（Mini-Proten Tetra System，Bio-RAD 公司），凝膠成像儀（ChemiDoc XRS+ System，Bio-RAD 公司），倒置熒光顯微鏡（Nikon Eclipse Ti-SR，日本尼康）。

4 動物造模與給藥

采用大鼠腦缺血再灌注損傷模型（Middle Cerebral Artery Occlusion / Reperfusion， MCAO/R）制備方法[6]，各組大鼠麻醉滿意后，右側頸前區(qū)脫毛、消毒，逐層鈍性分離頸前區(qū)皮膚和肌肉組織，充分暴露大鼠右側頸總動脈、頸內動脈及頸外動脈，結扎頸總動脈及頸外動脈近心端，在頸總動脈與頸內動脈分叉處剪一切口，經切口將備好的線栓沿頸內動脈送至大腦中動脈起始部，阻斷血流。缺血2 h 后緩慢拔出線栓，再灌注22 h。假手術組只暴露右側頸總動脈，而不進行其余操作。造模后，腦絡通組給予腦絡通顆粒灌胃，按20.2 g/（kg·d）灌服，每天1 次，持續(xù)7 天。假手術組和模型組按同樣的方法同時灌胃同體積生理鹽水。

5 神經功能缺損評分（Zea Longa）

每組隨機挑選6 只大鼠，選一位不熟悉分組情況的工作人員，參照Zea Longa 評分標準[7]對再灌注22h 后大鼠進行神經功能評分，總分0 ～5 分。Zea Longa 評分標準：0 分代表無神經缺損癥狀，完全正常；1 分代表不能完全伸展左側前肢，輕度障礙；2 分代表行走時向偏癱側轉圈，中度障礙；3 分代表行走時向偏癱側傾倒，重度障礙；4 分代表不能自發(fā)行走、意識障礙；5 分代表死亡。評分越高，說明神經功能缺損程度越嚴重。保留評分1 ～3 分建模后大鼠，模型在實驗中隨機補全，以確保實驗中每組大鼠數量不變。

6 TTC 染色法

連續(xù)用藥7 天后，在深度麻醉后取各組大鼠腦組織，新鮮腦組織用0.9%氯化鈉溶液沖洗后放入-20℃冰箱中冷凍15 分鐘，將冷凍后腦組織沿冠狀面切成2mm 厚度切片，用2%的TTC 染液在黑暗環(huán)境下放入37℃的恒溫箱中孵育染色15 分鐘（紅色為正常腦組織，白色為梗死腦組織），拍照后用Image J 軟件計算大鼠梗死腦組織百分比。

7 TUNEL 染色

取各組大鼠腦組織分別進行脫水、浸蠟、包埋、切片，切片厚度約3 ～5μm，將上述切片置于60℃烤箱內烤片后保存。加入TUNEL 染色液，避光孵育1 小時，PBS 漂洗，中性樹膠封片，用光學顯微鏡下隨機選取5個缺血腦組織視野進行觀察，記錄陽性染色（綠色）細胞數，并計算細胞凋亡率情況。

8 Western blot 檢測PRMT5、P53、Bcl-2、Caspase-3

將各組大鼠腦組織進行取材，RIPA 細胞裂解液裂解，離心、取上清、提取總蛋白，然后凝膠電泳、轉膜、5% 脫脂奶粉封閉2 h。加入PRMT5、P53、Bcl-2、Caspase-3 蛋白Ⅰ抗（1:1000）及 β-actinI 抗（1:500），經過一夜4℃孵育后再用TBST 漂洗，而后加入HRP 標記的二抗（1:10000），最后加入ECL 顯色、曝光。最后用Image J 軟件對各指標進行分析。

9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0 進行統(tǒng)計學分析，數據用平均值±標準差表示，組間比較用單因素方差分析，P＜ 0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 各組大鼠神經功能評分和腦梗死體積的變化

與假手術組比較，模型組大鼠神經功能評分及腦梗死體積顯著增加（P＜ 0.05）；與模型組比較，腦絡通顆粒組大鼠神經功能評分及腦梗死體積顯著降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠的神經功能評分和腦梗死體積

2 各組大鼠神經細胞凋亡的變化

與假手術組比較，模型組大鼠神經元細胞凋亡率顯著增加（P＜ 0.05）；與模型組比較，腦絡通顆粒組大鼠神經元細胞率顯著下降（P＜ 0.05），見圖2。

圖2 各組大鼠神經細胞凋亡的變化

3 各組大鼠腦組織Bcl-2、Caspase-3 蛋白的變化

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織Caspase-3蛋白表達水平顯著增加、Bcl-2 蛋白表達水平顯著降低（P＜ 0.05）；與模型組比較，腦絡通顆粒組大鼠腦組織Caspase-3 蛋白表達水平顯著降低、Bcl-2 蛋白表達水平顯著上調（P＜ 0.05），見圖3。

圖3 各組大鼠腦組織Bcl-2、Caspase-3 蛋白的變化

4 各組大鼠腦組織p53蛋白的變化

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織p53表達水平顯著增加（P＜ 0.05）；與模型組比較，腦絡通顆粒組大鼠腦組織p53 表達水平顯著下調（P ＜ 0.05），見圖4。

圖4 各組大鼠腦組織p53 蛋白的變化

5 各組大鼠腦組織PRMT5 蛋白的變化

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織PRMT5 表達水平顯著增加（P ＜ 0.05）；與模型組相比，腦絡通顆粒組大鼠腦組織PRMT5 表達水平顯著下調（P ＜0.05），見圖5。

圖5 各組大鼠腦組織PRMT5 蛋白的變化

討 論

隨著現代人飲食習慣及生活方式的改變，我國腦血管病的發(fā)生率不斷升高，其中，缺血性腦血管病約占發(fā)病總數70%～80%[8]，成為危害國人生活質量和生命健康的主要疾病之一。當缺血性腦血管病發(fā)生后，治療的首要目標是恢復腦組織血液供應，防止腦組織因缺血、缺氧導致神經功能進一步加重。然而，部分患者在腦組織血流恢復后出現癥狀加重的現象，即腦缺血再灌注損傷[9]。祖國醫(yī)學認為腦缺血再灌注損傷屬于“中風病”的范疇，且本病正虛為本，邪實為標。其主要機制為氣虛血瘀、脈絡不通。故在治療上以益氣活血為重要法則[10]。腦絡通顆粒是我院在臨床中治療腦血管病當中不斷積累總結而成，主要由黃芪、當歸 、赤芍、川芎、葛根、石菖蒲、地龍、熟地黃等藥物組成，參考補陽還五湯重在補氣、輔以活血化瘀通絡的立方思想，故本方重用黃芪為君，氣旺則血行，以兼具補血與活血的當歸為臣，助君補氣活血的同時，祛瘀而不傷血，佐以赤芍、川芎、熟地黃活血行氣，地龍、葛根化瘀通絡，配以石菖蒲醒神，諸藥合用，共達補氣活血、通絡開竅等作用[11]。因此，我們將腦絡通顆粒應用于CIRI 大鼠，研究發(fā)現，腦絡通顆?？筛纳拼笫蟮纳窠浌δ苋睋p癥狀，可減小CIRI 大鼠的腦梗死體積。

凋亡是由基因調控，細胞自主、有序的主動死亡。凋亡由多種基因調控，主要包含Bcl-2家族、Caspase家族等。Bcl-2 作為一種重要的抑制細胞凋亡的蛋白，與腦血缺再灌注損傷后神經功能呈負相關，表達水平越高說明抑制神經細胞凋亡能力越強，是一種重要的內源性神經保護物質[12]。而Caspase-3 是Caspase 家族中最具代表性的蛋白酶，是一種凋亡執(zhí)行蛋白酶，激活后會通過影響DNA 的代謝和修復導致DNA 裂解及mRNA 衰變，從而引發(fā)細胞凋亡[13]。經現代藥理學研究，方中黃芪主要成分為黃芪甲苷及黃芪多糖，Yang 等[14]研究發(fā)現黃芪甲苷可使促細胞凋亡蛋白Caspase-3 水平下調，抑制神經細胞凋亡，保護神經功能。當歸中有效成分主要是當歸多糖，在當歸多糖干預心肌缺血再灌注損傷大鼠的研究中，葉建華等[15]發(fā)現其可能促進抑制細胞凋亡因子Bcl-2 的表達，達到抗凋亡的作用。石菖蒲中有效成分主要包括揮發(fā)油、黃酮類化合物、多糖等，可以促進Bcl-2 的表達，從而阻止海馬神經元的凋亡。本研究發(fā)現，腦絡通顆?？缮险{CIRI 大鼠腦組織Bcl-2 蛋白表達水平，下調Caspase-3 蛋白的表達水平，并抑制CIRI 大鼠神經細胞凋亡，從而對腦缺血再灌注損傷大鼠起到神經保護作用。

腫瘤抑制基因p53 作為促細胞凋亡基因，被激活的p53 主要通過調控細胞周期、抑制細胞增殖發(fā)揮誘導細胞凋亡的作用[16]。相關研究表明，p53 表達水平與腦缺血再灌注損傷后神經細胞凋亡呈正相關[17]，激活p53 能使促細胞凋亡蛋白Caspase-3 表達水平上調，抑制p53 有利于抗細胞凋亡蛋白Bcl-2 的表達[18]。Wu 等將黃芪應用于細菌內毒素脂多糖（LPS）干預的人肺II 型上皮肺腺癌細胞系、人臍靜脈內皮細胞系和人膀胱癌細胞系，研究發(fā)現黃芪可抑制p53 通路，上調Bcl-2 蛋白表達，降低Caspase-3 表達水平，發(fā)揮抗細胞凋亡作用[19]。此外，研究表明川芎可通過抑制p38 MAPK/p53 信號傳導，抑制腎小管上皮細胞凋亡，改善急性腎損傷和腎纖維化[20]。同樣，本研究表明，腦絡通顆?？梢种艭IRI 大鼠腦組織p53 的表達，從而上調CIRI 大鼠腦組織Bcl-2 蛋白表達水平，下調Caspase-3 蛋白的表達，進而抑制CIRI 大鼠神經細胞凋亡。

蛋白精氨酸甲基轉移酶家族（protein arginine methyltransferases， PRMTs）催化蛋白精氨酸甲基化修飾，影響蛋白質-蛋白質和蛋白質-核酸之間的相互作用，參與調節(jié)細胞凋亡的基礎過程[21]。PRMT5作為PRMT 家族主要成員之一，研究發(fā)現，在CIRI 腦組織中PRMT5 表達水平明顯升高，抑制PRMT5 可改善CIRI 小鼠的神經功能、減輕小鼠腦梗死體積[22]。本研究同樣發(fā)現，在CIRI 大鼠腦組織中PRMT5表達水平較假手術組明顯升高，且腦絡通顆粒可顯著降低CIRI 大鼠腦組織PRMT5 的表達水平。

綜上，本研究結果顯示，腦絡通顆?？娠@著改善CIRI 大鼠的神經功能缺損癥狀，減小CIRI 大鼠的腦梗死體積；腦絡通顆?？赡苁峭ㄟ^抑制PRMT5、p53基因表達，下調Caspase-3 蛋白和上調Bcl-2 蛋白表達水平抑制神經細胞凋亡，從而對腦缺血再灌注損傷大鼠起到神經保護作用。