新型吡唑乙酰胺類琥珀酸脫氫酶抑制劑的設(shè)計(jì)、合成及抑菌活性

王曉斌，董 雪，王瑞穎，張 娟，王濛琪，張宗群，楊婷玉，許夢(mèng)寒

（1.江蘇海洋大學(xué)藥學(xué)院,江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,2.海洋工程學(xué)院,海洋工程技術(shù)研究中心,連云港 222005；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,江蘇省農(nóng)藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210095）

農(nóng)用殺菌劑在保護(hù)農(nóng)作物免受植物病原真菌侵?jǐn)_方面發(fā)揮著極其重要的作用［1，2］.然而，農(nóng)用殺菌劑的廣泛應(yīng)用也逐漸暴露了兩個(gè)亟待解決的問(wèn)題：（1）部分殺菌劑存在對(duì)非靶標(biāo)生物毒性較大、對(duì)環(huán)境危害嚴(yán)重的弊病，因與人們逐漸增強(qiáng)的生態(tài)環(huán)保意識(shí)相沖突而被限制使用［3～5］；（2）一些殺菌劑長(zhǎng)期及不當(dāng)?shù)氖褂脤?dǎo)致病原真菌迅速產(chǎn)生抗藥性，從而制約了我國(guó)重大農(nóng)業(yè)病害防控工作的有效開展［6～8］.因此，創(chuàng)制應(yīng)用效果更好、對(duì)非靶標(biāo)生物選擇性更強(qiáng)且對(duì)環(huán)境安全系數(shù)更高的綠色殺菌劑對(duì)保障我國(guó)的糧食安全和促進(jìn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義［9，10］.

琥珀酸脫氫酶（SDH）是位于真菌線粒體電子傳遞鏈上的一類膜蛋白復(fù)合物，其活力的強(qiáng)弱對(duì)真菌生存所需能量的獲取和存儲(chǔ)有著重要的影響，是抑菌劑創(chuàng)制領(lǐng)域廣受關(guān)注的靶標(biāo)之一［11～13］.自1966年以來(lái)，先后共有24個(gè)琥珀酸脫氫酶抑制劑（SDHIs）被開發(fā)用作農(nóng)用殺菌劑，其分子的核心藥效團(tuán)為芳基甲酰胺結(jié)構(gòu)，特別是氟代吡唑甲酰胺單元在維持SDHIs 廣譜高效抑菌活性方面起到了重要作用［14～16］.然而，過(guò)于相似的分子結(jié)構(gòu)會(huì)使SDHIs在長(zhǎng)期施用后產(chǎn)生較嚴(yán)重的交互抗性［17，18］.近期，研究人員發(fā)現(xiàn)氟吡菌酰胺（Fluopyram）、氟唑菌酰羥胺（Pydiflumetofen）和Isoflucypram 等含三元或四元柔性酰胺鏈的SDHIs［結(jié)構(gòu)見(jiàn)Scheme 1（A）］對(duì)因使用萎銹靈（Carboxin）、啶酰菌胺（Boscalid）和吡噻菌胺（Penthiopyrad）等含二元酰胺鍵的SDHIs［結(jié)構(gòu)見(jiàn)Scheme 1（B）］而產(chǎn)生抗性的菌株依舊保持良好的抑制活性［19～22］，這使得對(duì)SDHIs酰胺鍵進(jìn)行柔性改造成為高效廣譜殺菌劑開發(fā)的重要策略［23，24］.

Scheme 1 Representative SDHIs bearing a flexible amide linkage(A) or commercialized SDHIs bearing a dualistic amide linkage(B)

鑒于柔性酰胺鏈在SDHIs 抑菌活性方面展現(xiàn)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，本文將吡唑甲酰胺殺菌劑結(jié)構(gòu)中的甲酰胺單元替換為柔性更為出眾的乙酰胺連接鏈，合成了一系列潛在靶向真菌SDH 的新型吡唑乙酰胺分子（結(jié)構(gòu)見(jiàn)Scheme 2）.隨后，采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了吡唑乙酰胺目標(biāo)分子對(duì)水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）和草莓灰霉病菌（Botrytis cinerea）的抑制活性，并運(yùn)用SDH酶活力測(cè)試和分子對(duì)接技術(shù)初步探討了高活性分子對(duì)真菌SDH的潛在作用方式.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

三氟乙酰乙酸乙酯、溴乙酸乙酯、溴乙烷、氫氧化鈉、取代苯胺和O-苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲四氟硼酸（TBTU），分析純，上海泰坦科技股份有限公司；甲基肼水溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%），瑞士Adamas公司；BC0955型琥珀酸脫氫酶測(cè)試盒，北京索萊寶科技有限公司.

BRUKER-400型核磁共振波譜儀（NMR），德國(guó)Bruker公司；Triple TOF 5600 plus LC/MS/MS型高分辨質(zhì)譜儀（HRMS），美國(guó)ABSciex 公司；SMP-50 型全自動(dòng)數(shù)字熔點(diǎn)儀，英國(guó)Bibby 科學(xué)有限責(zé)任公司；ZF-1A 型三用紫外分析儀，上海勤科分析儀器有限公司；OSB-2100 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本EYELA 公司；ELX800型酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 中間體2-［5-羥基-1-甲基-3-（三氟甲基）-1H-吡唑-4-基］乙酸（2）的合成 在100 mL 乙醇中加入14.62 mL（0.10 mol）三氟乙酰乙酸乙酯，16.58 g（0.12 mol）碳酸鉀和1.66 g（0.01 mol）碘化鉀，常溫下攪拌10 min后加入16.63 mL（0.15 mol）溴乙酸乙酯，加熱至回流并反應(yīng)8 h.減壓蒸餾除去多余乙醇，所得殘?jiān)靡宜嵋阴ト芙?，?jīng)水洗除去鉀鹽，再次減壓蒸餾得到含2-（2，2，2三氟乙?；╃晁岫阴ィㄖ虚g體1）的黃色液體.將上述黃色液體溶于100 mL乙醇，加入13.24 mL（0.10 mol）甲基肼水溶液后加熱回流反應(yīng)8 h；加入8.00 g（0.20 mol）氫氧化鈉后再次回流反應(yīng)4 h.減壓蒸餾除去多余乙醇，殘?jiān)盟芙夂笥靡宜嵋阴ハ礈?隨后用鹽酸調(diào)節(jié)水相體系pH值為2，以乙酸乙酯萃取，用無(wú)水硫酸鈉干燥，經(jīng)減壓蒸餾得到中間體2白色粉末.

1.2.2 中間體2-（5-乙氧基-1-甲基-3-（三氟甲基）-1H-吡唑-4-基）乙酸（5）的合成 將8.94 g（0.04 mol）中間體2溶于100 mL甲醇，加入少量濃硫酸后加熱回流反應(yīng)8 h，經(jīng)減壓蒸餾除去多余甲醇，所得殘?jiān)靡宜嵋阴ト芙猓?jīng)水洗除去硫酸，用無(wú)水硫酸鈉干燥，再次減壓蒸餾得到2-［5-羥基-1-甲基-3-（三氟甲基）-1H-吡唑-4-基］乙酸甲酯（中間體3）.在100 mL 乙腈中加入9.53 g（0.04 mol）中間體3、4.48 mL（0.06 mol）溴乙烷和6.63 g（0.05 mol）碳酸鉀，加熱回流反應(yīng)10 h；經(jīng)減壓蒸餾得到含2-［5-乙氧基-1-甲基-3-（三氟甲基）-1H-吡唑-4-基］乙酸甲酯（中間體4）的黃色油膏.將上述黃色油膏加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的氫氧化鈉溶液（64.00 mL）中，加熱反應(yīng)2 h后用鹽酸調(diào)節(jié)體系pH值為2，用乙酸乙酯萃取，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾得到中間體5白色粉末.

1.2.3 目標(biāo)化合物6a～6j的合成 化合物6a～6j的合成路線見(jiàn)Scheme 3（A）.將0.76 g（3.00 mmol）中間體5加入15 mL氯化亞砜中，攪拌并加熱至回流反應(yīng)8 h.經(jīng)減壓蒸餾除去多余氯化亞砜后，所得殘?jiān)?5 mL 二氯甲烷溶解，加入3.00 mmol 取代苯胺和1.25 mL（9.00 mmol）三乙胺，常溫下攪拌10 h 后用水洗滌，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉處理，經(jīng)減壓蒸餾除去多余二氯甲烷，所得殘?jiān)觅|(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液重結(jié)晶，得到目標(biāo)產(chǎn)物6a～6j.

Scheme 3 Synthetic routes of target compounds 6a—6j(A) and 6k,6l(B)

1.2.4 目標(biāo)化合物6k 和6l 的合成 化合物6k 和6l 的合成過(guò)程見(jiàn)Scheme 3（B）.將0.67 g（3.00 mmol）中間體2，3.00 mmol取代苯胺和1.25 mL（9.00 mmol）三乙胺加入25 mL二氯甲烷中，攪拌10 min后加入1.16 g（3.60 mmol）TBTU，常溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)10 h.所得反應(yīng)液經(jīng)水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾及乙醇（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%）重結(jié)晶得到目標(biāo)產(chǎn)物6k和6l.

1.2.5 中間體2 和5 及目標(biāo)分子6a～6l 的表征 化合物結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，13C NMR，19F NMR 和HRMS 確證.中間體2和5及目標(biāo)分子6a～6l的的理化性質(zhì)和表征數(shù)據(jù)如表1和表2所示，相關(guān)譜圖見(jiàn)本文支持信息圖S1～圖S56.

Table 1 Appearance,yields,melting points(m.p.),19F NMR and HRMS data of compounds 2,5 and 6a—6l

Table 2 1H NMR and 13C NMR data of compounds 2,5 and 6a—6l

1.3 抗植物病原真菌活性測(cè)試

以農(nóng)用殺真菌劑噁霉靈（Hymexazol）和氟吡菌酰胺為陽(yáng)性對(duì)照，采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了目標(biāo)分子6a～6l對(duì)水稻紋枯病菌，草莓灰霉病菌和小麥赤霉病菌的抑制效果［25～27］.上述菌株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省農(nóng)藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供.

1.4 水稻紋枯病菌SDH的提取及活力測(cè)試

參照文獻(xiàn)［23，24］方法提取水稻紋枯病菌的SDH，并利用琥珀酸脫氫酶測(cè)試盒測(cè)定了目標(biāo)分子6l對(duì)水稻紋枯病菌SDH的抑制活性.

1.5 同源模建和分子對(duì)接

參照文獻(xiàn)［23，24］方法構(gòu)建了水稻紋枯病菌SDH 蛋白，并基于此蛋白模型進(jìn)行了目標(biāo)分子6l 與SDH的分子對(duì)接研究.

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)化合物的合成及結(jié)構(gòu)表征

如Scheme 2所示，三氟乙酰乙酸乙酯在碳酸鉀作用下與溴乙酸乙酯發(fā)生親核反應(yīng)，生成的含三氟乙?；溺晁岫阴ルS即在堿性條件下與甲基肼發(fā)生環(huán)化作用，得到吡唑乙酸類中間體2.中間體2與甲醇發(fā)生酯化反應(yīng)，所得產(chǎn)物依次與溴乙烷和氫氧化鈉溶液發(fā)生反應(yīng)，得到另一個(gè)含有吡唑乙酸骨架的中間體5.中間體5與氯化亞砜發(fā)生氯代反應(yīng)后，在三乙胺存在下與取代苯胺發(fā)生酰胺化反應(yīng)得到目標(biāo)分子6a～6j.此外，在含三乙胺的二氯甲烷中，中間體2在TBTU 作用下與取代苯胺發(fā)生酰胺化反應(yīng)得到目標(biāo)分子6k和6l.所構(gòu)建分子6a～6l的結(jié)構(gòu)通過(guò)1H NMR，13C NMR，19F NMR和HRMS方法進(jìn)行確證，相關(guān)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)列于表1和表2，相應(yīng)譜圖見(jiàn)本文支持信息圖S9～S56.

以目標(biāo)分子6b 的表征數(shù)據(jù)解析為例進(jìn)行具體分析.在化合物6b 的1H NMR 譜圖中，δ10.27 處的單峰為酰胺鍵上質(zhì)子氫的信號(hào)峰；δ7.59 和7.36 處的雙峰分別為苯胺鄰位和間位質(zhì)子氫的信號(hào)峰；δ4.26和1.31處的四重峰和三重峰是吡唑5位乙氧基質(zhì)子氫的信號(hào)峰；δ3.71和3.54處的單峰分別為吡唑1位甲基和吡唑4位亞甲基質(zhì)子氫的信號(hào)峰.在化合物6b的13C NMR譜圖中，δ168.55處的吸收峰為酰胺羰基碳的信號(hào)峰；δ122.12 和139.49 處的四重峰為三氟甲基和吡唑3 位碳的信號(hào)峰；δ152.67和99.41處的吸收峰分別是吡唑5位和4位碳的信號(hào)峰；δ138.49～121.14處的吸收峰為苯環(huán)碳的信號(hào)峰；δ71.82和15.60處的吸收峰為吡唑5位乙氧基碳的信號(hào)峰；δ35.19和29.40處的吸收峰分別是吡唑4位亞甲基和吡唑1位甲基碳的信號(hào)峰.在化合物6b的19F NMR譜圖中，δ-60.40處的吸收峰為三氟甲基氟的信號(hào)峰.化合物6b的HRMS譜圖顯示，［M+Na］+離子峰的吸收信號(hào)為m/z384.0687，與其分子式C15H15ClF3N3O2［M+Na］+的計(jì)算值m/z384.0697十分接近.

2.2 目標(biāo)分子的抑菌活性

為考察苯胺上取代基類型對(duì)抑菌活性的影響，首先合成了目標(biāo)分子6a～6j，并采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了上述10個(gè)分子在藥劑質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)對(duì)水稻紋枯病菌，小麥赤霉病菌和草莓灰霉病菌的抑制活性.測(cè)試結(jié)果（表3）表明，化合物6b，6g和6h在藥劑質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)對(duì)水稻紋枯病菌的抑制效果最優(yōu)，抑制率分別為35.33%，37.11%和40.00%，與對(duì)照藥劑噁霉靈和氟吡菌酰胺保持相當(dāng).同時(shí)，化合物6b，6d和6g在藥劑質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)對(duì)小麥赤霉病菌的抑制效果較明顯，抑制率分別達(dá)到16.92%，20.59%和26.97%.此外，化合物6b，6g和6h在藥劑質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)對(duì)草莓灰霉病菌也展現(xiàn)出較明顯的抑制效果，抑制率分別達(dá)到28.49%，20.70%和20.43%.上述抑菌測(cè)試結(jié)果表明，在苯胺苯環(huán)的對(duì)位引入氯原子和4-氯苯氧單元能顯著改善分子骨架的抑菌活性.

Table 3 Antifungal activities of compounds 6a—6l at 50 μg/mL

為探索吡唑5 位取代基類型對(duì)抑菌活性的影響，在保留苯環(huán)對(duì)位氯原子和4-氯苯氧單元的基礎(chǔ)上，構(gòu)建并測(cè)定了目標(biāo)分子6k和6l在藥劑質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)對(duì)3種測(cè)試真菌的抑制活性，結(jié)果如表3所示.抑菌測(cè)試結(jié)果表明，化合物6l在藥劑質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)對(duì)水稻紋枯病菌，小麥赤霉病菌和草莓灰霉病菌的抑制效果（65.78%，46.82%和62.10%）均優(yōu)于化合物6g（37.11%，6.97%和20.70%）.同時(shí)，化合物6k 在藥劑質(zhì)量濃度為50 μg/mL 時(shí)對(duì)草莓灰霉病菌的抑制效果（51.08%）也顯著優(yōu)于化合物6b（28.49%）.上述結(jié)果表明，將改善分子吡唑5位的乙氧基替換為羥基能顯著改善所得分子的抑菌效果.化合物6l在藥劑質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)對(duì)水稻紋枯病菌的抑制效果（65.78%）顯著優(yōu)于對(duì)照藥劑噁霉靈和氟吡菌酰胺（33.90%和56.25%）.抑菌活性測(cè)試結(jié)果（圖1和表4）表明，化合物6l 對(duì)水稻紋枯病菌的半最大效應(yīng)濃度（EC50）值為19.92 μg/mL，其活性顯著優(yōu)于對(duì)照藥劑噁霉靈（76.74 μg/mL）和氟吡菌酰胺（40.36 μg/mL）.

Fig.1 Anti-R.solani effects of compound 6l

Table 4 Inhibitory effects of compound 6l against R.solani and their SDH

2.3 化合物6l與水稻紋枯病菌SDH的分子對(duì)接研究

為探究SDH 是否為化合物6l 分子的潛在作用靶標(biāo)，測(cè)定了化合物6l 對(duì)水稻紋枯病菌SDH 的抑制效果.由表4結(jié)果可見(jiàn)，化合物6l對(duì)水稻紋枯病菌SDH的半數(shù)抑制濃度（IC50=61.53 μmol/mL）要明顯優(yōu)于氟吡菌酰胺（105.90 μmol/mL），證實(shí)真菌體內(nèi)的SDH是化合物6l抑菌活性發(fā)揮的潛在作用靶標(biāo).隨后，通過(guò)同源模建的方法獲得了水稻紋枯病菌SDH的蛋白模型，并運(yùn)用Autodock 4.2.6程序進(jìn)一步探究了化合物6l分子與水稻紋枯病菌SDH的潛在作用方式（圖2）.分子對(duì)接研究結(jié)果表明，化合物6l分子和氟吡菌酰胺以近似相同的構(gòu)象嵌入琥珀酸脫氫酶上的活性口袋中，同時(shí)這兩個(gè)活性分子與周圍殘基的相互作用方式也基本相同.如，殘基ARG 81和TYR 128通過(guò)氫鍵與化合物6l 和氟吡菌酰胺發(fā)生相互作用，殘基ILE 230，ILE 78，VAL 82借助Pi-Alkyl和Alkyl的方式與上述兩個(gè)活性分子發(fā)生相互作用.上述作用方式在一定程度上維持了化合物6l分子對(duì)植物病原真菌的抑制活性.其次，化合物6l分子中的二苯醚單元以Alkyl和Pi-Alkyl的方式與殘基ILE 78，VAL 82和PHE 121發(fā)生作用，這可能是含二苯醚單元的目標(biāo)分子對(duì)植物病原真菌抑制活性明顯優(yōu)于其它目標(biāo)分子生物活性的重要原因.此外，化合物6l中的吡唑5位羥基通過(guò)氫鍵與殘基TYR 128發(fā)生作用，這可能是含羥基的吡唑乙酰胺分子在抑菌表現(xiàn)方面優(yōu)于含乙氧基吡唑乙酰胺分子的重要原因.

3 結(jié)論

鑒于酰胺鏈柔性改造在新型SDHIs創(chuàng)制方面展現(xiàn)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，將吡唑甲酰胺殺菌劑結(jié)構(gòu)中的甲酰胺單元替換為柔性更為出眾的乙酰胺連接鏈，構(gòu)造了一系列潛在靶向真菌SDH 的新型吡唑乙酰胺分子.經(jīng)1H NMR，13C NMR，19F NMR和HRMS確證分子結(jié)構(gòu)后，采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了上述分子對(duì)植物病原真菌的抑制活性.通過(guò)抑菌活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)了具有廣譜抑菌特性的二苯醚聯(lián)吡唑乙酰胺分子6l，其在藥劑質(zhì)量濃度為50 μg/mL 時(shí)對(duì)水稻紋枯病菌，小麥赤霉病菌和草莓灰霉病菌的抑制率（65.78%，46.82%和62.10%）與對(duì)照藥劑噁霉靈（33.90%，46.86%和61.04%）保持相當(dāng).生物活性測(cè)試結(jié)果表明，化合物6l 對(duì)水稻紋枯病菌的EC50值為19.92 μg/mL，抑菌活性明顯優(yōu)于對(duì)照藥劑噁霉靈和氟吡菌酰胺（76.74 μg/mL 和40.36 μg/mL）.SDH 酶活力測(cè)試結(jié)果證明真菌體內(nèi)的SDH 是化合物6l抑菌活性發(fā)揮的潛在作用靶標(biāo)，其對(duì)水稻紋枯病菌SDH的IC50值（61.53 μmol/mL）要明顯優(yōu)于氟吡菌酰胺（105.90 μmol/mL）.進(jìn)一步的分子對(duì)接研究表明，化合物6l分子中的二苯醚單元能以多種方式與靶標(biāo)口袋內(nèi)的氨基酸結(jié)合，對(duì)分子抑菌活性的發(fā)揮起到關(guān)鍵作用.研究結(jié)果表明，二苯醚聯(lián)吡唑乙酰胺分子對(duì)植物病原真菌具有較顯著抑制作用，具備作為優(yōu)勢(shì)抑菌先導(dǎo)結(jié)構(gòu)進(jìn)行深度發(fā)掘的潛力.

支持信息見(jiàn)http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20230444.