藥用植物狗牙根的化學(xué)成分及其抗炎活性研究

劉 佳，范蘇蘇，楊思琦，唐麗萍，張 旋，李 鮮

(昆明醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

狗牙根[Cynodondactylon(L.) Pers.]為禾本科(Poaceae)狗牙根屬(Cynodon)植物，又名百慕大草、絆根草、行儀芝，在中國(guó)有2 個(gè)種和1 個(gè)變種[1-2].狗牙根全草入藥，其味苦、微甘、入肝經(jīng)，具有祛風(fēng)活絡(luò)、解熱止血、解毒等功效，民間用于癆傷吐血、跌打損傷、瘡瘍腫毒、痢疾等疾病的治療[3].

目前從狗牙根中分離得到的化學(xué)成分有茋類化合物和木脂素類化合物，其初提物表現(xiàn)出抗癌、抗病毒、抗關(guān)節(jié)炎、利尿等藥理作用[4].但是對(duì)于狗牙根的化學(xué)成分和抗炎活性成分的研究還較少[5-6].為進(jìn)一步開發(fā)和利用藥用植物狗牙根，闡明其抗炎活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)綜合利用正相、反相硅膠柱色譜、Sephadex LH-20 凝膠柱色譜、半制備液相色譜等色譜方法對(duì)狗牙根中的化學(xué)成分進(jìn)行了分離純化，并通過NMR 和MS 等現(xiàn)代波譜技術(shù)鑒定了16 個(gè)化合物，其中15 個(gè)化合物為首次從該植物中分離得到.后又利用Griess 法，對(duì)狗牙根中的11個(gè)黃酮類化合物和3 個(gè)蒽醌類化合物進(jìn)行了體外抗炎活性研究，結(jié)果顯示，在RAW264.7 炎癥細(xì)胞模型上，化合物2、3和14顯著抑制NO 生成，其IC50值分別為2.74、2.35、3.61 μmol/L.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 儀器和材料Brucker AM-4 Avance 600 型核磁共振儀(德國(guó)Brucker 公司)，半制備高效液相色譜儀(上?？普芄?，薄層色譜硅膠GF 254(0.20-0.25 mm)和柱層析用硅膠(0.054～0.077 mm，200～300 目)(青島海洋化工廠)，RP-18(Merk 公司)，大孔吸附樹脂D101(上海萊特公司)，葡聚糖凝膠Sephadex LH-20(GE Healthcare)，MCI-gel CHP-20P(日本三菱)，Scientific Multiskan Go 酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Scientific 公司)；地塞米松(北京索萊寶生物科技有限公司)，一氧化氮檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)，色譜純甲醇和乙腈(上海星可公司)；其余分析純?cè)噭┵?gòu)自于天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，顯色劑為10%硫酸-乙醇溶液.

1.2 植物來源植物樣品于2021 年4 月采自云南臨滄，由昆明醫(yī)科大學(xué)唐麗萍教授鑒定，植物標(biāo)本現(xiàn)存放于昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 化合物的提取和分離干燥狗牙根全草18.0 kg，粉碎后用95%乙醇加熱回流提取4 次，減壓濃縮合并提取液后得到浸膏1 140 g，浸膏用大孔樹脂D101 進(jìn)行脫色，脫色后的樣品394 g 經(jīng)正相硅膠柱層析(0.054～0.077 mm，200～300 目)，使用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇依次洗脫，薄層色譜檢測(cè)，得到A～E 5 個(gè)部位.

B 部位(45 g)用MCI 柱層析(甲醇-水，體積比0:100→100:0)和丙酮洗脫，得到9 個(gè)部位Fr B1～B9，其中Fr B9 采用正相硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯，體積比100:1→2:1)得化合物15(2.5 g)和化合物16(2.5 g).

C 部位(110.6 g)經(jīng)硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯，體積比100∶1→1∶100)和甲醇洗脫，得到16 個(gè)部位(Fr C1～C16).Fr C2 經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析后得到化合物13(3.4 mg).Fr C5 經(jīng)正相硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯，體積比50∶1→1∶3)、Sephadex LH-20 凝膠柱層析得到化合物14(6.7 mg).Fr C6 經(jīng)ODS 反相柱層析(甲醇-水，體積比50∶50→100∶0)得到8 個(gè)部位(Fr C6-1～C6-8)，其中Fr C6-3 和Fr C6-4 經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱層析得到化合物2(13.3 mg)、化合物3(1.9 mg)和化合物12(2.6 mg).Fr C8 采用正相硅膠柱層析法(石油醚-乙酸乙酯，體積比30∶1→1∶5，后用甲醇洗脫)后得3 個(gè)部位(Fr C8-1～C8-3)，F(xiàn)r C8-3 經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱層析得到化合物1(10.7 mg).Fr C10 和Fr C11 經(jīng)ODS 反相柱層析法(甲醇-水，體積比35∶65→100∶0)得到5 個(gè)部位(Fr C10-1～C10-5)和8 個(gè)部位(Fr C11-1～C11-8)，其中Fr C10-3 經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱層析得化合物4(2.3 mg)；Fr C11-5 經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱層析、半制備HPLC(乙腈-水，體積比43∶57)和制備薄層色譜法得到化合物11(6.3 mg).Fr C12 和Fr C14經(jīng)ODS 反相柱層析法(甲醇-水，體積比30∶70→100∶0)后分別得到11 個(gè)部位(Fr C12-1～C12-11)和5 個(gè)部位(Fr C14-1～C14-5)，對(duì)Fr C12-4 采用Sephadex LH-20 凝膠柱層析、半制備HPLC(甲醇-水，體積比47∶53)得化合物5(3.6 mg)；Fr C12-6經(jīng)半制備HPLC(53%甲醇-水，體積比53∶47)后采用制備薄層色譜得化合物6(12.7 mg)、化合物7(5.7 mg)和化合物8(3.7 mg)；Fr C14-1 經(jīng)正相硅膠柱層析(二氯甲烷-甲醇，體積比15∶1→3∶1，后用甲醇洗脫)后得到5 個(gè)部位(Fr C14-1-1～C14-1-5)，F(xiàn)r C14-1-2 經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱層析、半制備HPLC(乙腈-水，體積比20∶80)得到化合物10(6.3 mg)；Fr C14-2 經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱層析、半制備HPLC(乙腈-水，體積比30∶70)后得化合物9(4.7 mg).化合物1～16的結(jié)構(gòu)如圖1 所示.

圖1 化合物1～16 的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of compounds 1-16

2.2 化合物的抗炎活性篩選實(shí)驗(yàn)分組：①空白組：各孔接種RAW264.7 細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)液為含10% FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)基；②對(duì)照組：各孔接種RAW264.7 細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)液含10% FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)基和1 μg/mL LPS；③不同濃度給藥組：RAW264.7 細(xì)胞接種于孔內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)液為含有10% FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)基和1 μg/mL LPS 和不同濃度的化合物；④陽(yáng)性對(duì)照組：各孔接種RAW264.7 細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)液含10% FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)基和1 μg/mL LPS 和地塞米松.

選取細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好的RAW264.7 細(xì)胞，待細(xì)胞融合程度達(dá)80%～90%時(shí)，PBS 清洗2 次，吹打細(xì)胞使貼壁細(xì)胞懸浮后再用含10% FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)基重懸為單細(xì)胞懸液后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105mL-1.取出新96 孔板，每孔加入100 μL RAW264.7 細(xì)胞懸液接種細(xì)胞，并在加液四周加入PBS 避免邊緣效應(yīng)，隨后放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).24 h 后移液槍吸棄舊培養(yǎng)基，根據(jù)分組加入不同的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，24 h 后吸出培養(yǎng)液于1 500 r/min 離心5 min，吸取上清，根據(jù)NO 檢測(cè)試劑盒加樣，使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)550 nm 下檢測(cè)每孔的吸光度，根據(jù)公式計(jì)算NO 含量和NO 抑制率，最后再用SPSS17.0 軟件計(jì)算出化合物的抗炎活性的IC50值.公式如下：

NO 抑制率=[1-（實(shí)驗(yàn)孔OD 值-空白孔OD 值）/（對(duì)照孔OD 值-空白孔OD 值）]×100%.

3 結(jié)果與討論

3.1 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定化合物1黃色針晶；ESI-MSm/z：329[M-H]-，C17H14O7；1H NMR (DMSOd6,600 MHz)δH: 12.94 (1H,s,5-OH),7.25 (2H,s,H-2′,6′),6.80 (1H,s,H-3),6.36 (1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.04 (1H,d,J=2.0 Hz,H-6),3.85 (6H,s,3′,5′-OCH3);13C NMR (DMSO-d6,150 MHz)δC: 181.0 (C-4),168.7 (C-2,4′),163.1 (C-7),161.3 (C-9),157.7(C-5),148.5 (C-3′,5′),141.4 (C-1′),119.3 (C-10),104.2 (C-2′,6′),102.8 (C-3),99.9 (C-6),94.8 (C-8),56.3 (3′,5′-OCH3).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道基本一致，故將化合物1鑒定為苜蓿素.

化合物2黃色固體；ESI-MSm/z：299[M-H]-，C16H12O6；1H NMR (DMSO-d6,600 MHz)δH: 12.96(1H,s,5-OH),10.87 (1H,brs,7-OH),10.00 (1H,brs,4′-OH),7.57 (1H,m,H-6′),7.56 (1H,m,H-2′),6.93 (1H,d,J=8.9 Hz,H-5′),6.90 (1H,s,H-3),6.51(1H,d,J=2.1 Hz,H-8),6.20 (1H,d,J=2.2 Hz,H-6),3.88 (3H,s,5′-OCH3);13C NMR (DMSO-d6,150 MHz)δC: 181.8 (C-4),164.2 (C-7),163.7 (C-2),161.5 (C-5),157.3 (C-9),150.7 (C-4′),148.0 (C-3′),121.5 (C-1′),120.4 (C-6′),115.8 (C-5′),110.2 (C-2′),103.7 (C-10),103.2 (C-3),98.8 (C-6),94.0 (C-8),55.8 (OCH3).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道基本一致，故將化合物2鑒定為chrysoeriol.

化合物3黃色粉末；ESI-MSm/z：255[M-H]-，C15H12O4；1H NMR (丙 酮-d6,600 MHz,)δH: 8.12(1H,d,J=8.9 Hz,H-6′),7.83 (1H,d,J=15.0 Hz,Hβ),7.76 (2H,d,J=8.6 Hz,H-2,6),7.73 (1H,d,J=16.0 Hz,H-α),6.92 (2H,d,J=8.6 Hz,H-3,5),6.46 (1H,dd,J=2.4,8.8 Hz,H-5′),6.37 (1H,d,J=2.3 Hz,H-3′);13C NMR (丙 酮-d6,150 MHz)δC: 192.9 (C=O),167.7 (C-4′),165.7 (C-2′),161.2 (C-4),145.3 (C-β),133.4 (C-6′),131.9 (C-2,6),127.6 (C-1),118.3 (Cα),116.9 (C-3,5),114.6 (C-1′),108.8 (C-5′),103.8(C-3′).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致，故將化合物3鑒定為isoliquiritigenin.

化合物4紅色固體；ESI-MSm/z：581[M-H]-，C30H30O12；1H NMR (CD3OD-d4,600 MHz)δH: 7.08(2H,s,H-2′,6′),6.94 (1H,s,H-2′′),6.80 (1H,d,J=3.2 Hz,H-6′′),6.76 (1H,s,H-5′′),6.74 (1H,s,H-3),6.40 (1H,s,H-8),6.15 (1H,s,H-6),4.64 (1H,m,H-8′′),4.56 (1H,d,J=6.0 Hz,H-7′′),4.16 (1H,dt,J=8.5,3.3 Hz,H-9′′),3.94 (1H,dd,J=12.0,4.7 Hz,H-9′′),3.83 (6H,s,3′,5′-OCH3),3.80 (3H,s,3′′-OCH3),3.19 (3H,s,7′′-OCH3),1.92 (3H,s,9′′-OAc);13C NMR (CD3OD-d4,150 MHz)δC: 183.9 (C-4),172.6 (9′′-OAc),166.3 (C-7),165.4 (C-5),163.4(C-2),159.5 (C-9),154.8 (C-3′,5′),149.0 (C-4′′),147.9 (C-3′′),141.7 (C-4′),130.6 (C-1′′),127.6 (C-1′),122.1 (C-6′′),116.2 (C-5′′),112.3 (C-2′′),105.8(C-3),105.6 (C-10),105.0 (C-2′,6′),100.4 (C-6),95.3 (C-8),85.8 (C-7′′),83.5 (C-8′′),65.6 (C-9′′),56.9 (3′,5′-OCH3),57.3 (3′-OCH3),56.5 (7′′-OCH3),20.9 (9′′-OAc).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，故將化合物4鑒定為tricin 4′-O-(threoβ-guaiacyl-(7′-O-methyl-9′-O-acetyl)-glyceryl) ether.

化合物5黃色粉末；ESI-MSm/z：285[M-H]-，C15H10O6；1H NMR (CD3OD-d4,600 MHz)δH: 7.39(2H,m,H-2′,6′),6.91 (1H,d,J=8.4 Hz,H-5′),6.54(1H,s,H-3),6.44 (1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.21 (1H,d,J=2.1 Hz,H-6);13C NMR (CD3OD-d4,150 MHz)δC: 183.8 (C-4),166.5 (C-7),166.3 (C-2),163.2 (C-5),159.5 (C-9),151.2 (C-4′),147.1 (C-3′),123.6 (C-6′),120.3 (C-1′),116.8 (C-5′),114.1 (C-2′),105.2(C-10),103.8 (C-3),100.3 (C-6),95.1 (C-8).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故將化合物5鑒定為木犀草素.

化合物6黃色粉末；ESI-MSm/z：525[M-H]-，C27H26O11；1H NMR (CD3OD-d4,600 MHz)δH: 7.23(2H,s,H-2′,6′),7.01 (1H,d,J=1.9 Hz,H-2′′),6.82(1H,dd,J=8.2 Hz,1.9 Hz,H-6′′),6.75 (1H,d,J=8.1 Hz,H-5′′),6.48 (1H,s,H-8),6.22 (1H,d,J=2.0 Hz,H-6),4.93 (1H,d,J=5.3 Hz,H-7′′),4.47 (1H,m,H-8′′),3.70 (2H,dd,J=12.1,3.4 Hz,H-9′′α,H-9′′β),3.93 (6H,s,3′,5′-OCH3),3.84 (3H,s,3′′-OCH3);13C NMR (CD3OD-d4,150 MHz)δC: 183.0 (C-4),167.3 (C-7),165.5 (C-2),163.5 (C-5),159.8 (C-9),155.1 (C-3′,5′),148.9 (C-3′′),147.3 (C-4′′),140.8(C-4′),134.1 (C-1′′),128.2 (C-1′),121.2 (C-6′′),115.9 (C-5′′),111.9 (C-2′′),106.1 (C-3),105.6 (C-2′,6′),105.4 (C-10),100.8 (C-6),95.7 (C-8),87.8(C-8′′),74.5 (C-7′′),62.2 (C-9′′),57.2 (3′,5′-OCH3),56.6(3′′-OCH3).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，故將化合物6鑒定為tricin 4′-O-(erythro-βguaiacy-lglyceryl) ether.

化合物7黃色粉末；ESI-MSm/z：495[M-H]-，C26H24O10；1H NMR (CD3OD-d4,600 MHz)δH: 7.22(2H,d,J=8.5 Hz,H-2′′,6′′),7.16 (2H,s,H-2′,6′),6.73 (2H,d,J=8.1 Hz,H-3′′,5′′),6.65 (1H,s,H-3),6.41 (1H,brs,H-8),6.16 (1H,brs,H-6),4.93 (1H,d,J=5.4 Hz,H-7′′),4.43 (1H,td,J=5.4,3.3 Hz,H-8′′),3.96 (1H,d,J=5.5 Hz,H-9′′),3.94 (6H,s,3′,5′-OCH3),3.68 (1H,dd,J=12.1,3.3 Hz,H-9′′);13C NMR (CD3OD-d4,150 MHz)δC: 183.7 (C-4),170.3(C-7),165.2 (C-2),163.2 (C-5),159.5 (C-9),157.8(C-4′′),154.9 (C-3′,5′),140.4 (C-4′),133.1 (C-1′′),129.1 (C-6′′),127.9 (C-1′),115.7 (C-3′′,5′′),105.8(C-3),105.1 (C-10,2′,6′),100.6 (C-6),95.4 (C-8),87.5 (C-8′′),74.0 (C-7′′),61.8 (C-9′′),56.9 (C-10′′).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，故將化合物7鑒定為calquiquelignan D.

化合物8黃色粉末；ESI-MSm/z：495[M-H]-，C26H24O10；1H NMR (CD3OD-d4,600 MHz)δH: 7.45(1H,d,J=8.4 Hz,H-2′′),7.45 (1H,d,J=8.4 Hz,H-6′′),7.27 (2H,s,H-2′,H-6′),6.76 (1H,d,J=8.3 Hz,H-3′′),6.76 (1H,d,J=8.3 Hz,H-5′′),6.73 (1H,s,H-3),6.49 (1H,s,H-8),6.22 (1H,s,H-6),5.03 (1H,d,J=6.7 Hz,H-7′′),4.29 (1H,m,H-8′′),3.97 (6H,s,3′,5′-OCH3),3.80 (1H,dd,J=12.0,4.0 Hz,H-9′′β),3.40 (1H,dd,J=12.1,3.5 Hz,H-9′′α);13C NMR(CD3OD-d4,150 MHz)δC: 183.5 (C-4),166.7 (C-7),164.9 (C-2),162.9 (C-5),159.3 (C-9),157.9 (C-4′′),154.4 (C-3′,5′),140.7 (C-4′),132.5 (C-1′′),130.9(C-6′′),129.0 (C-2′′),127.8 (C-1′),116.6 (C-3′′),115.6 (C-5′′),105.6 (C-3),105.0 (C-2′,6′),104.8 (C-10),100.3 (C-6),95.1 (C-8),88.6 (C-8′′),74.0 (C-7′′),61.7 (C-9′′),56.7 (3′,5′-OCH3).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，故將化合物8鑒定為calquiquelignan E.

化合物9黃色粉末；ESI-MSm/z：637[M-H]-，C32H30O14；1H NMR (吡 啶-d5,600 MHz)δH: 7.72(1H,s,H-6′),7.59 (1H,s,H-7′′′),7.42 (2H,s,H-2′′′,6′′′),7.36 (1H,s,H-3′),6.83 (1H,s,H-8),6.76 (2H,d,J=11.5 Hz,H-3′′′,5′′′),6.71 (1H,s,H-3),6.57(1H,s,H-6),6.54 (1H,d,J=16.0 Hz,H-8′′′),5.32(1H,d,J=11.8 Hz,H-1′′),4.65 (1H,s,H-6′′),4.24(1H,s,H-6′′),3.92 (3H,s,2′-OCH3),3.91 (3H,s,4′-OCH3),3.81(1H,m,H-5′),3.67 (1H,d,J=2.3 Hz,H-3′′),3.62 (1H,d,J=2.3 Hz,H-2′′),3.55 (1H,s,H-4′′);13C NMR(吡 啶-d5,150 MHz)δC: 183.0 (C-4),167.6 (C-9′′′),165.2 (C-2),164.1 (C-7),163.9 (C-5),160.7 (C-4′′′),158.0 (C-9),149.5 (C-2′),149.0(C-4′),146.1 (C-7′′′),142.4 (C-5′),135.3 (C-2′′′,6′′′),126.4 (C-1′′′),121.1 (C-1′),116.8 (C-3′′′,5′′′),115.0 (C-8′′′),111.2 (C-6′),106.8 (C-10),106.2 (C-3′),104.5 (C-3),101.8 (C-1′′),100.8 (C-6),95.7 (C-8),78.5 (C-3′′),75.7 (C-5′′),74.8(C-2′′),71.7 (C-4′′),64.6 (C-6′′),56.7 (2′-OCH3),55.9 (4′-OCH3).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，故將化合物9鑒定為5,5′-dihydroxy-2′,4′-dimethoxy-flavone-7-Oβ-D-(6′′-O-Z-p-coumaroyl)-glucopyranoside.

化合物10黃色粉末；ESI-MSm/z：417[M-H]-，C21H22O9；1H NMR (吡啶-d5,600 MHz)δH: 8.19 (1H,dd,J=8.9,3.2 Hz,H-5),7.52 (2H,d,J=5.6 Hz,H-2′,6′),7.41 (2H,d,J=5.5 Hz,H-3′,5′),6.92 (1H,dd,J=8.7,1.7 Hz,H-6),6.84 (1H,d,J=1.6 Hz,H-8),5.69(1H,dd,J=7.8,3.0 Hz,H-1′′),5.54 (1H,d,J=13.0 Hz,H-2),4.58 (1H,m,H-6′′),4.40 (4H,m,H-2′′,3′′,4′′,6′′),4.16 (1H,m,H-5′′),3.19 (1H,dd,J=16.4,12.8 Hz,H-3α),2.94 (1H,d,J=16.7 Hz,H-3β);13C NMR (吡啶-d5,150 MHz)δC: 190.6 (C-4),166.8 (C-7),164.5 (C-8a),159.0 (C-6′),133.5 (C-1′),129.78 (C-5),128.7 (C-2′,6′),117.3 (C-3′,5′),114.9 (C-4a),112.1 (C-6),104.1 (C-8),102.3 (C-1′′),80.2 (C-2),79.3 (C-3′′),78.8 (C-5′′),75.2 (C-2′′),71.5 (C-4′′),62.6 (C-6′′),44.8 (C-3).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，故將化合物10鑒定為4 ′-hydroxy-2,3-dihydroflavone 7-β-D-glucopyranoside.

化合物11黃色固體；ESI-MSm/z：539[M-H]-，C28H28O11；1H NMR (CD3OD-d4,600 MHz)δH: 7.03(2H,s,H-2′,6′),6.90(1H,s,H-2′′),6.77 (1H,m,H-6′′),6.75 (1H,s,H-5′′),6.65 (1H,s,H-3),6.45 (1H,s,H-8),6.19 (1H,s,H-6),4.46 (1H,s,H-7′′),4.29(1H,dd,J=11.8,3.2 Hz,H-8′′),3.91 (1H,m,H-9′′),3.86 (6H,s,3′,5′-OCH3),3.85 (3H,s,7′′-OCH3),3.82 (3H,s,3′′-OCH3),3.74 (1H,m,H-9′′);13C NMR (CD3OD-d4,150 MHz)δC: 183.8 (C-4),166.6(C-7),165.2 (C-2),163.2 (C-5),159.4 (C-9),154.7(C-3′,5′),148.8 (C-3′′),147.4 (C-4′′),140.5 (C-4′),131.1 (C-1′′),127.6 (C-1′),122.1 (C-6′′),115.6 (C-5′′),112.2 (C-2′′),105.7 (C-3),105.4 (C-10),104.9(C-2′,6′),100.4 (C-6),95.3 (C-8),86.6 (C-8′′),83.8(C-7′′),61.9 (C-9′′),56.9 (7′′-OCH3),56.8 (3′,5′-OCH3),56.4 (3′′-OCH3).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致，故將化合物11鑒定為tricin 4′-O-(threoβ-guaiacyl-(7′′-O-methyl)-glyceryl) ether.

化合物12紅色粉末；ESI-MSm/z：285[M-H]-，C15H10O6；1H NMR (丙 酮-d6,600 MHz)δH: 12.23(1H,s,8-OH),7.74 (1H,s,H-4),7.30 (1H,s,H-2),7.26 (1H,d,J=2.4 Hz,H-5),6.63 (1H,d,J=2.4 Hz,H-7),4.78 (2H,s,H-11);13C NMR (丙酮-d6,150 MHz)δC: 191.3 (C-9),182.5 (C-10),168.3 (C-6),166.3 (C-8),163.4 (C-1),153.7 (C-3),136.7 (C-10a),134.5 (C-4a),121.7 (C-2),118.1 (C-4),115.5 (C-9a),110.8 (C-5),109.9 (C-8a),108.9 (C-7),63.8 (C-11).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，故將化合物12鑒定為ω-hydroxyemodin.

化合物13紅色粉末；EI-MSm/z：254[M]+，C15H10O4；1H NMR (丙 酮-d6,600 MHz)δH: 12.62(1H,brs,1-OH),8.12 (1H,d,J=8.5 Hz,H-8),7.66(1H,d,J=2.5 Hz,H-5),7.58 (1H,s,H-4),7.29 (1H,d,J=8.5 Hz,H-7),7.12 (1H,s,H-2),2.47 (3H,s,H-11);13C NMR(丙酮-d6,150 MHz)δC: 189.2 (C-9),183.4(C-10),166.8 (C-6),163.6 (C-1),148.1 (C-3),136.2(C-10a),134.5 (C-4a),130.6 (C-8),125.4 (C-8a),124.5 (C-2),122.9 (C-7),120.9 (C-4),115.1 (C-9a),113.5 (C-5),21.9 (C-11).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本一致，故將化合物13鑒定為phomarin.

化合物14橙黃色固體；ESI-MSm/z：329[M-H]-，C17H14O7；1H NMR (DMSO-d6,600 MHz)δH: 13.37(1H,s,8-OH),13.31 (1H,s,6-OH),12.98 (1H,s,2-OH),7.75 (1H,s,H-4),7.10 (1H,s,H-5),3.81(3H,s,1-OCH3),3.79 (3H,s,7-OCH3),2.26 (1H,s,H-3);13C NMR (DMSO-d6,150 MHz)δC: 186.7 (C-9),180.6 (C-10),158.7 (C-6),157.1 (C-8) 156.7 (C-2),147.4 (C-1),140.1 (C-7),131.7 (C-3),128.7 (C-10a),126.0 (C-4),124.1 (C-4a) 124.1 (C-9a),110.2 (C-8a),108.8 (C-5),61.1 (7-OCH3),59.8 (1-OCH3),16.6 (C-3).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道基本一致，故將化合物14鑒定為aurantio-obtusin.

化合物15和16白色粉末；EI-MSm/z：414[M]+，C29H50O；EI-MSm/z：412[M]+，C29H48O.波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道基本一致，故將化合物15和16的混合物鑒定為β-谷甾醇和豆甾醇的混合物.

3.2 化合物的抗炎活性結(jié)果從表1 可看出，化合物2、3、6、8和14的NO 抑制率IC50值均低于陽(yáng)性對(duì)照藥物地塞米松，其中化合物2、3和14顯著抑制NO 生成，其IC50值分別為2.74、2.35 μmol/L和3.61 μmol/L，化合物4NO 抑制率與陽(yáng)性對(duì)照藥相當(dāng)，其余化合物與陽(yáng)性對(duì)照藥物地塞米松相比均未顯示抗炎活性.

表1 14 個(gè)化合物的NO 抑制率IC50 值Tab.1 The NO inhibition rate IC50 of 14 compounds

3.3 討論綜合運(yùn)用正相、反相硅膠柱色譜、Sephadex LH-20 凝膠柱色譜、半制備液相色譜等色譜方法對(duì)藥用植物狗牙根的化學(xué)成分進(jìn)行了分離純化；運(yùn)用核磁共振和質(zhì)譜等波譜方法鑒定了16 個(gè)化合物，其中除化合物5 外其余化合物均為首次從該植物中分離得到.本文報(bào)道的16 個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)類型包括黃酮類、蒽醌類和甾體類化合物，其中化合物1～11 為黃酮類化合物，化合物12～14 為蒽醌類化合物，化合物15～16 為甾體類化合物.

抗炎活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物2、3 和14 表現(xiàn)出顯著的抗炎活性，抗炎活性的構(gòu)效關(guān)系初步分析認(rèn)為苯環(huán)上酚羥基和羥基甲氧基化是影響狗牙根中黃酮類、蒽醌類抗炎活性能力的原因之一[21].實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明狗牙根草中黃酮類化合物和蒽醌類化合物的抗炎活性可能與抑制NO 的生成有關(guān)，但化合物的抗炎作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究.本文首次揭示了黃酮類化合物和蒽醌類化合物是狗牙根中抗炎活性成分之一，為合理開發(fā)狗牙根的藥用資源提供了科學(xué)依據(jù).