指紋圖譜、一測(cè)多評(píng)與模式識(shí)別相結(jié)合的忍冬藤配方顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)

曹桂云，寧 波，余彩娟，莊雪松，劉羽康，王岱杰，林永強(qiáng)，董曉弟，楊純國(guó)，崔偉亮，劉洪超，孟兆青*

1. 山東宏濟(jì)堂制藥集團(tuán)股份有限公司 山東省中醫(yī)藥治療呼吸系統(tǒng)疾病技術(shù)創(chuàng)新中心，山東 濟(jì)南 250103

2. 齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省分析測(cè)試中心，山東 濟(jì)南 250014

3. 山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250101

4. 山東一方制藥有限公司，山東 臨沂 276000

忍冬藤LoniceraeJaponicaeCaulis是忍冬科忍冬屬植物忍冬LonicerajaporacaThunb.的干燥莖枝，有清熱解毒、疏風(fēng)通絡(luò)之功效。用于溫病發(fā)熱、風(fēng)濕熱痹、癰腫瘡瘍、關(guān)節(jié)紅腫熱痛[1]。忍冬藤最早記載于漢末的《名醫(yī)別錄》，其性甘味寒，尤善清熱解毒、疏風(fēng)通絡(luò)[2]?！侗静菥V目》稱其“莖葉及花，功用皆同，治一切濕氣及諸腫痛”?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，忍冬藤與金銀花所含化學(xué)成分相似，主要為有機(jī)酸、黃酮類、環(huán)烯醚萜苷類等化合物[3-4]，具有抗菌、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等多種藥理作用[5-7]。

忍冬藤配方顆粒是由忍冬藤飲片經(jīng)水提取后濃縮干燥而成，具有免煎易服，易儲(chǔ)存，攜帶方便、便于調(diào)劑等優(yōu)點(diǎn)，滿足了隨證加減的臨床用藥特點(diǎn)，已經(jīng)成為忍冬藤臨床用藥的重要形式。因此建立完善的忍冬藤配方顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)方法規(guī)范忍冬藤配方顆粒質(zhì)量并明確忍冬藤配方顆粒與臨床湯劑一致性對(duì)于其臨床應(yīng)用具有十分重要的意義。國(guó)家藥品監(jiān)督管理局于2021 年發(fā)布的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》[8]（下稱《技術(shù)要求》）明確了“標(biāo)準(zhǔn)湯劑”的概念及標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備方法與工藝，并對(duì)配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)系統(tǒng)的建立提供了思路與依據(jù)。目前僅有4 篇文獻(xiàn)報(bào)道了忍冬藤標(biāo)準(zhǔn)湯劑及配方顆粒相關(guān)研究。胥愛(ài)麗等[9]建立了忍冬藤配方顆粒的HPLC 指紋圖譜。李志嬌等[10]建立了HPLC 法同時(shí)測(cè)定忍冬藤配方顆粒中綠原酸、咖啡酸、馬錢苷等3 種成分含量的方法。余德發(fā)等[11]以出膏率和綠原酸、馬錢苷的含量及轉(zhuǎn)移率為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)忍冬藤配方顆粒的制備工藝進(jìn)行了研究。范帥帥等[12]制備了15 批忍冬藤標(biāo)準(zhǔn)湯劑，以綠原酸、咖啡酸、馬錢苷作為定量檢測(cè)指標(biāo)，計(jì)算出膏率、含量和轉(zhuǎn)移率，并建立超高液相色譜指紋圖譜分析方法。其中前3 篇報(bào)道未基于標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行研究，第4 篇報(bào)道采用購(gòu)買的飲片進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備，均不符合《技術(shù)要求》相關(guān)規(guī)定，導(dǎo)致所測(cè)定配方顆粒中馬錢苷含量數(shù)據(jù)及出膏率數(shù)據(jù)與忍冬藤配方顆粒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)差距較大，難以反映現(xiàn)行忍冬藤配方顆粒質(zhì)量。這些報(bào)道還存在研究指標(biāo)成分過(guò)少或單一、未制定配方顆粒指標(biāo)成分含量限度等問(wèn)題，難以用于忍冬藤配方顆粒的全面質(zhì)量控制。另外，尚無(wú)忍冬藤配方顆粒與對(duì)其飲片臨床用藥的一致性相關(guān)研究，不利于忍冬藤配方顆粒的臨床配伍使用。

本研究根據(jù)《技術(shù)要求》相關(guān)規(guī)定，于山東、河南、河北等地收集代表性藥材，炮制成飲片，制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑，并建立忍冬藤質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，并以標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率、指紋圖譜及新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當(dāng)藥苷、馬錢苷6 個(gè)特征成分含量和轉(zhuǎn)移率評(píng)價(jià)忍冬藤配方顆粒與標(biāo)準(zhǔn)湯劑的一致性，為忍冬藤配方顆粒的質(zhì)量控制、工藝研究及臨床應(yīng)用提供參考。

1 儀器與材料

Agilent1260 型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；BSA224S-CW 型1/1 萬(wàn)電子天平，賽多利斯科技儀器（北京）有限公司；TS8606 型凍干機(jī)，菲維科公司；XS105 型1/10 萬(wàn)電子天平，梅特勒托利多科技（中國(guó)）有限公司；YRE2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；KQ-800VSW型雙頻靜音型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；KDM 型可調(diào)控溫電熱套，山東鄄城華魯電熱儀器有限公司。

忍冬藤對(duì)照藥材，批號(hào)121069-202107，中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品隱綠原酸（批號(hào)250031-202104）、新綠原酸（批號(hào)240008-202110）、當(dāng)藥苷（批號(hào)260014-202108），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為98.0%，上海鴻永生物科技有限公司；對(duì)照品馬錢苷酸，批號(hào)ST05430120，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%，上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司；對(duì)照品綠原酸，批號(hào) 110753-202119，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.3%，中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品馬錢苷，批號(hào)200359-200604，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%，江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司。

15 批忍冬藤藥材來(lái)源見(jiàn)表1，經(jīng)山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院林永強(qiáng)主任藥師鑒定，為忍冬科忍冬屬植物忍冬L.japoracaThunb.的干燥莖枝。水為超純水，乙腈、磷酸為色譜純，其他試劑均為分析純。忍冬藤配方顆粒，山東宏濟(jì)堂制藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)220501、220502、220503、220504、220505、220506，編號(hào)S16～S21；北京康仁堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)22015443，編號(hào)S22；山東一方制藥有限公司，批號(hào)G2020732、G2020742、G2020721，編號(hào)S23～S25；忍冬藤配方顆粒規(guī)格均為每克中藥配方顆粒均相當(dāng)于飲片6.5 g。

表1 15 批忍冬藤藥材信息Table 1 Information of 15 batches of LJC

2 方法與結(jié)果

2.1 忍冬藤標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉及配方顆粒制備

2.1.1 忍冬藤標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉的制備 將15 批忍冬藤藥材按照《中國(guó)藥典》2020 年版一部忍冬藤飲片【炮制】項(xiàng)下的方法炮制，即除去雜質(zhì)，洗凈，悶潤(rùn)，切段，干燥，得到15 批忍冬藤飲片（批號(hào)與藥材批號(hào)對(duì)應(yīng)相同，編號(hào)YP1～YP15）。結(jié)合現(xiàn)代臨床用藥習(xí)慣，標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝確定為稱取15批忍冬藤飲片不少于100 g，置于砂鍋中，加水煎煮2 次，第1 次加10 倍量水浸泡30 min，武火煮沸后改為文火煎煮20 min，第2 次加8 倍量水武火煮沸后改為文火煎煮15 min，趁熱用200 目篩濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮，冷凍干燥，即得15 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉（編號(hào)S1～S15）。

2.1.2 忍冬藤配方顆粒制備 取忍冬藤飲片6 500 g，加水煎煮，濾過(guò)，濾液濃縮成清膏，干燥，加入輔料適量，制粒，制成1 000 g，即得。其中，山東宏濟(jì)堂制藥集團(tuán)股份有限公司 220501、220502、220503（編號(hào)S16～S18）批配方顆粒由YF2104005批（編號(hào)YC3）藥材炮制成飲片，制備成配方顆粒。

2.2 忍冬藤標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒HPLC 指紋圖譜研究

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.4%磷酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫：0～40 min，6%～9%乙腈；40～50 min，9%乙腈；50～51 min，9%～13%乙腈；51～70 min，13%～20%乙腈；70～80 min，20%乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)0～60 min 為236 nm，60～80 min 為327 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。理論塔板數(shù)按馬錢苷峰計(jì)算不低于3 000。

2.2.2 參照物溶液的制備 取忍冬藤對(duì)照藥材1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%甲醇25 mL，回流提取30 min，放冷，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為對(duì)照藥材參照物溶液。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 取馬錢苷對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成含馬錢苷60 μg/mL 的對(duì)照品溶液，即得。

2.2.4 供試品溶液的制備 預(yù)試驗(yàn)采用單因素實(shí)驗(yàn)分別對(duì)提取方式、提取溶劑、提取時(shí)間和取樣量等進(jìn)行考察，確定供試品溶液制備方式為取忍冬藤配方顆?；驑?biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉適量，研細(xì)（過(guò)五號(hào)篩），取約0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，超聲處理（功率250 W、頻率40 kHz）30 min，放冷，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 取忍冬藤配方顆粒所使用的輔料（糊精）適量，按照“2.2.4”項(xiàng)下制備方法制備成陰性對(duì)照溶液；取忍冬藤配方顆粒供試品溶液、馬錢苷對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液按“2.2.1”項(xiàng)下方法獲得其色譜圖，結(jié)果表明（圖1）陰性對(duì)照無(wú)干擾，表明方法專屬性良好。

圖1 忍冬藤配方顆粒的專屬性分析Fig. 1 Chromatogram of specificity determination of LJC dispensing granules

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)忍冬藤配方顆粒樣品6 份，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以馬錢苷峰為參照峰，考察各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的一致性，結(jié)果顯示，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜2%，相對(duì)峰面積的RSD＜3%，供試品指紋圖譜相似度＞0.90，表明該方法的重復(fù)性較好。

2.2.7 中間精密度試驗(yàn) 由2 個(gè)分析人員在不同日期分別按“2.2.4”項(xiàng)下方法分別制備6 份供試品溶液，利用不同儀器按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，以馬錢苷峰為參照峰，考察各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的一致性，結(jié)果顯示，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜3%，相對(duì)峰面積的RSD＜5%，供試品指紋圖譜相似度＞0.90，表明該方法的中間精密度較好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以馬錢苷峰為參照峰，考察各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的一致性，結(jié)果顯示，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜1%，相對(duì)峰面積的RSD＜3%，供試品指紋圖譜相似度＞0.90，表明供試品溶液穩(wěn)定性較好。

2.2.9 指紋圖譜的建立 取15 批忍冬藤標(biāo)準(zhǔn)湯劑和10 批忍冬藤配方顆粒樣品，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012 版），其疊加色譜圖見(jiàn)圖2。對(duì)15 批忍冬藤標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指紋圖譜進(jìn)行多點(diǎn)校正和Mark 峰匹配后，生成忍冬藤標(biāo)準(zhǔn)湯劑的對(duì)照指紋圖譜（R），見(jiàn)圖3。共標(biāo)定16 個(gè)共有峰，并指認(rèn)了其中11 個(gè)成分，分別為新綠原酸（峰3）、馬錢苷酸（峰5）、8-表馬錢酸（峰6）、綠原酸（峰7）、隱綠原酸（峰8）、當(dāng)藥苷（峰10）、馬錢苷（峰11）、斷氧化馬錢子苷（峰12）、異綠原酸B（峰14）、異綠原酸A（峰15）、異綠原酸C（峰16）。

圖2 忍冬藤標(biāo)準(zhǔn)湯劑 (S1～S15) 和配方顆粒 (S16～S25) 的HPLC 指紋圖譜Fig. 2 HPLC fingerprints of LJC standard decoctions (S1—S15) and dispensing granules (S16—S25)

圖3 忍冬藤標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照指紋圖譜Fig. 3 Reference fingerprint of LJC standard decoctions

2.2.10 忍冬藤配方顆粒與標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指紋圖譜比較 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012 版）計(jì)算相似度，忍冬藤配方顆粒與標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照指紋圖譜的相似度均＞0.9，S16～S18 批配方顆粒與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)湯劑（S3）圖譜相似度＞0.95，表明配方顆粒的生產(chǎn)工藝較為穩(wěn)定且化學(xué)成分與標(biāo)準(zhǔn)湯劑一致性較好。15 批忍冬藤標(biāo)準(zhǔn)湯劑與對(duì)照指紋圖譜的相似度＞0.9，說(shuō)明不同批次忍冬藤飲片所制備的標(biāo)準(zhǔn)湯劑具有較高的相似度。

2.2.11 聚類分析 將15 批忍冬藤標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜中16 個(gè)特征峰的峰面積按制成量折算配方顆粒峰面積，將折算后的峰面積和10 批配方顆粒的峰面積導(dǎo)入SPSS 20.0 軟件進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)刻度距離為15 時(shí)，可分為2 類，配方顆粒S16～S25 與標(biāo)準(zhǔn)湯劑S1～S13、S15 聚為一類，標(biāo)準(zhǔn)湯劑S14 單獨(dú)聚為一類，說(shuō)明配方顆粒的生產(chǎn)工藝較穩(wěn)定，且化學(xué)成分與標(biāo)準(zhǔn)湯劑一致性較好。

圖4 15 批忍冬藤標(biāo)準(zhǔn)湯劑和10 批配方顆粒指紋圖譜聚類分析Fig. 4 Fingerprint cluster analysis map of 15 batches of LJC standard decoction and 10 batches of dispensing granules

2.2.12 主成分分析（principal component analysis，PCA） 將15 批忍冬藤標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC 指紋圖譜中16個(gè)特征峰的峰面積按制成量折算配方顆粒峰面積，將折算后的峰面積和10 批配方顆粒的峰面積導(dǎo)入SPSS 20.0 軟件進(jìn)行PCA，以特征值＞1 為提取標(biāo)準(zhǔn)得到3 個(gè)主成分，其方差貢獻(xiàn)率分別為52.63%、23.89%、10.15%，累積方差貢獻(xiàn)率為86.67%，可以代表16 個(gè)共有成分的大部分信息，得分圖見(jiàn)圖5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)配方顆粒與標(biāo)準(zhǔn)湯劑的成分較為一致，但存在3 批配方顆粒（S23～S25）與其余配方顆粒及標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品分布距離較遠(yuǎn)，分析其原因是由于該3 批配方顆粒峰10（當(dāng)藥苷）峰面積偏高所致。

圖5 15 批忍冬藤標(biāo)準(zhǔn)湯劑和10 批配方顆粒PCA 得分圖Fig. 5 PCA score chart of 15 batches of LJC standard decoction and 10 batches of dispensing granules

2.2.13 偏最小二乘法-判別分析（partial least squares- discriminant analysis，PLS-DA） 將15 批忍冬藤標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜中16 個(gè)特征峰的峰面積按制成量折算配方顆粒峰面積，將折算后的峰面積和10 批配方顆粒的峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行PLS-DA，獲得相應(yīng)模型，模型參數(shù)為RX2為0.985，RY2為0.886，Q2為0.695，均大于0.5，表明擬合模型的準(zhǔn)確度和預(yù)測(cè)能力較好，結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)果與相似度分析、PCA 結(jié)果相似，配方顆粒S16～S18與其對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)湯劑S3 分布集中，10 批配方顆粒分布集中，表明配方顆粒生產(chǎn)工藝穩(wěn)定性較好，成分與標(biāo)準(zhǔn)湯劑一致性較好，以上結(jié)果與聚類分析及PCA 相似。

圖6 15 批忍冬藤標(biāo)準(zhǔn)湯劑和10 批配方顆粒PLS-DA 得分散點(diǎn)圖Fig. 6 PLS-DA score scatter plots of 15 batches of LJC standard decoction and 10 batches of dispensing granules

2.3 忍冬藤配方顆粒的HPLC 定量方法研究

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.4%磷酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫：0～40 min，6%～9%乙腈；40～55 min，9%乙腈；55～65 min，9%～75%乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)236 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算不低于3 000。

2.3.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當(dāng)藥苷、馬錢苷對(duì)照品適量，精密稱定，加入30%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.975 1、1.301 4、1.508 0、1.146 6、1.173 1、2.081 2 mg/mL 的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 采用單因素實(shí)驗(yàn)分別對(duì)供試品提取方式、提取溶劑、提取時(shí)間和取樣量等進(jìn)行考察，確定供試品溶液制備方式為取忍冬藤配方顆?；驑?biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉適量，研細(xì)（過(guò)五號(hào)篩），取約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W、頻率40 kHz）30 min，放冷，用30%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3.4 專屬性考察 取忍冬藤配方顆粒所使用的輔料（糊精）適量，按照“2.3.3”項(xiàng)下方法制備成陰性對(duì)照溶液；取忍冬藤配方顆粒供試品溶液，新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當(dāng)藥苷、馬錢苷混合對(duì)照品溶液，空白溶液，陰性對(duì)照溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法獲得其色譜圖，結(jié)果表明（圖7）表明陰性對(duì)照無(wú)干擾，方法專屬性良好。

圖7 忍冬藤配方顆粒的專屬性分析Fig. 7 Chromatogram of specificity determination of LJC dispensing granules

2.3.5 線性關(guān)系考察 采用逐級(jí)稀釋法，精密量取適量新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當(dāng)藥苷、馬錢苷混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于10 mL 量瓶中，加入30%甲醇定容，稀釋得到質(zhì)量濃度分別為97.51、130.14、150.80、114.66、117.31、520.30 μg/mL的對(duì)照品溶液，分別稀釋1、2、4、8、16 倍，從低到高濃度的混合對(duì)照品溶液編號(hào)分別為I～V，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，每個(gè)質(zhì)量濃度平行進(jìn)樣2 次，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），色譜峰峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得到各指標(biāo)成分的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果分別為新綠原酸Y＝11.290X－11.353，r＝0.999 9，線性范圍6.09～97.51 μg/mL；馬錢苷酸Y＝14.637X－7.810 6，r＝1.000 0，線性范圍8.13～130.14 μg/mL；綠原酸Y＝18.175X－31.221，r＝0.999 9，線性范圍9.42～150.80 μg/mL；隱綠原酸Y＝10.862X－22.52，r＝0.999 8，線性范圍7.17～114.66 μg/mL；當(dāng)藥苷Y＝12.731X－4.369 5，r＝1.000 0，線性范圍7.33～117.31 μg/mL；馬錢苷Y＝15.108X－23.868，r＝1.000 0，線性范圍32.52～520.30 μg/mL。

2.3.6 中間精密度試驗(yàn) 由2 個(gè)分析人員在不同日期分別按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，利用不同儀器按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，結(jié)果忍冬藤配方顆粒中新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當(dāng)藥苷、馬錢苷峰面積的RSD 分別為1.96%、1.60%、2.97%、2.26%、2.48%、0.30%，結(jié)果表明方法中間精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取220501 批次忍冬藤配方顆粒供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當(dāng)藥苷、馬錢苷峰面積的RSD 分別為1.66%、0.30%、0.88%、2.64%、0.14%、0.34%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取220501 批次忍冬藤配方顆粒樣品，共6 份，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當(dāng)藥苷、馬錢苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 分別為1.16%、0.48%、0.67%、0.53%、0.53%、0.71%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗(yàn) 取0.1 g 忍冬藤配方顆粒，分別加入新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當(dāng)藥苷、馬錢苷對(duì)照品儲(chǔ)備液0.4、1.5、0.2、0.3、0.4、0.7 mL，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備溶液，平行制備6 份，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果表明，新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當(dāng)藥苷、馬錢苷的平均加樣回收率分別為99.01%、102.18%、99.92%、97.72%、96.99%、97.42%，RSD 分別為2.26%、1.65%、1.20%、2.64%、2.33%、2.48%，符合分析要求。

2.4 忍冬藤配方顆粒的一測(cè)多評(píng)方法建立研究

2.4.1 相對(duì)校正因子（fi/s）計(jì)算 精密吸取“2.3.5”項(xiàng)下系列混合對(duì)照品溶液I～V 各適量，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以綠原酸為內(nèi)參物（s），計(jì)算新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當(dāng)藥苷、馬錢苷的fi/s，計(jì)算公式fi/s＝AsCi/AiCs，As為內(nèi)標(biāo)峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度，Ai為待測(cè)物峰面積，Ci為待測(cè)物質(zhì)量濃度。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 fi/s 計(jì)算結(jié)果Table 2 fi/s of each component reference

2.4.2fi/s重現(xiàn)性考察 分別考察3 臺(tái)不同Agilent 1260 高效液相色譜儀、1 臺(tái)Waters e2695 高效液相色譜儀和6 根不同色譜柱對(duì)fi/s的影響，結(jié)果見(jiàn)表3，測(cè)得的fi/s的RSD 值在2.31%～2.72%，表明各待測(cè)組分fi/s在不同儀器和不同色譜柱之間重現(xiàn)性良好。

表3 不同儀器和色譜柱對(duì)fi/s 的影響Table 3 Effects of different instruments and chromatographic columns on fi/s

分別考察不同體積流量及柱溫對(duì)fi/s的影響，結(jié)果見(jiàn)表4，測(cè)得的fi/s的RSD 值分別在0.56%～1.40%，表明各待測(cè)組分fi/s在不同體積流量及柱溫之間重現(xiàn)性良好。

2.4.3 待測(cè)組分色譜峰定位 分別計(jì)算各待測(cè)組分與內(nèi)參物綠原酸的相對(duì)保留時(shí)間（tR）與保留時(shí)間差（Δt），并考察其在不同儀器和不同色譜柱之間的重現(xiàn)性，結(jié)果表明（表5），相對(duì)保留時(shí)間波動(dòng)較小，最終選擇不同儀器和不同色譜柱中各待測(cè)成分的相對(duì)保留時(shí)間值的平均值作為峰定位依據(jù)。

表5 不同儀器和色譜柱中各目標(biāo)成分的相對(duì)保留時(shí)間及保留時(shí)間差Table 5 Values of r and ΔtR determined by different instruments and columns

2.4.4 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果的比較 分別采用一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法計(jì)算待測(cè)成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表6。外標(biāo)法與一測(cè)多評(píng)法計(jì)算的含量經(jīng)t檢驗(yàn)比較，P遠(yuǎn)大于0.05，表明2 種方法測(cè)得的含量無(wú)明顯差異，且2 組含量之間RSD＜2%，表明所建立的一測(cè)多評(píng)法準(zhǔn)確性良好，可用于忍冬藤配方顆粒及標(biāo)準(zhǔn)湯劑的含量測(cè)定。

表6 外標(biāo)法與QAMS 測(cè)定忍冬藤中6 種成分含量的比較Table 6 Comparison of six effective constituents determined by external standard method and QAMS in LJC

2.5 忍冬藤配方顆粒與標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率、有效成分含量及轉(zhuǎn)移率比較

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒的出膏率進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表7、8。15 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率在7.80%～14.57%，出膏率平均值為11.80%，平均值的70%～130%分別為8.26%～15.34%。3 批配方顆粒的出膏率為14.40%～14.80%，均在15 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率平均值±30%范圍內(nèi)。分別取15 批忍冬藤標(biāo)準(zhǔn)湯劑和3 批配方顆粒，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當(dāng)藥苷、馬錢苷含量。由表7 可知，15 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑中新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當(dāng)藥苷、馬錢苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.09～8.60、6.91～21.84、2.71～6.83、1.94～8.72、1.51～6.81、10.26～33.88 mg/g，平均值分別為4.76、11.96、5.14、4.78、3.98、22.73 mg/g。

表7 忍冬藤標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率，新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當(dāng)藥苷、馬錢苷的含量及轉(zhuǎn)移率Table 7 Extraction rate of LJC standard decoction, content and transfer rate of new chlorogenic acid, loganic acid,chlorogenic acid, cryptochlorogenic acid, sweroside and loganin

表8 忍冬藤配方顆粒的出膏率、指標(biāo)成分含量及轉(zhuǎn)移率Table 8 Extraction rate, index ingredients content and transfer rate of LJC dispensing granules

為計(jì)算該6 種成分從飲片到配方顆粒和標(biāo)準(zhǔn)湯劑的轉(zhuǎn)移率，需測(cè)定其在飲片中的含量。經(jīng)過(guò)考察，確定其測(cè)定方法為分別取15 批忍冬藤飲片粉末（過(guò)三號(hào)篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，回流提取30 min，放冷，用30%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算飲片中新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當(dāng)藥苷、馬錢苷含量。6 種指標(biāo)成分從飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑的轉(zhuǎn)移率分別為新綠原酸24.14%～41.75%、馬錢苷酸40.64%～70.83%、綠原酸26.48%～44.22%、隱綠原酸29.58%～51.97%、當(dāng)藥苷28.96%～46.59%、馬錢苷45.73%～84.73%，平均值分別為33.25%、54.53%、35.41%、42.23%、37.10%、65.19%。雖然各指標(biāo)成分含量差異較大，但轉(zhuǎn)移率較穩(wěn)定，分析可知是由于相應(yīng)飲片中指標(biāo)成分含量差異大。根據(jù)《技術(shù)要求》，配方顆粒藥效物質(zhì)應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)湯劑保持一致，需根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的含量及含量轉(zhuǎn)移率范圍制定合理含量上下限度。

配方顆粒在制備過(guò)程中加入了一定量的輔料，按制成量換算15 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑中6 種成分的含量，新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當(dāng)藥苷、馬錢苷在配方顆粒中理論質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.57～5.14、4.20～19.81、2.04～6.28、1.46～5.49、1.14～4.84、9.31～32.10 mg/g，平均值為3.34、9.53、3.85、3.42、2.90、16.74 mg/g，分別計(jì)算±s、±2s、±3s、平均值的70%～130%范圍，為更好的控制配方顆粒的質(zhì)量，取指標(biāo)成分含量下限為平均值的70%，含量上限為＋3s，將該范圍作為配方顆?？山邮艿暮肯薅确秶葱戮G原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當(dāng)藥苷、馬錢苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)限度范圍分別為2.34～7.09、6.67～22.47、2.70～6.97、2.40～7.24、2.03～6.13、11.72～31.93 mg/g。經(jīng)測(cè)定（表6），S16～S22 批配方顆粒6 種指標(biāo)成分的含量符合所制定配方顆粒含量限度要求，S23～S25批配方顆粒當(dāng)藥苷含量略高于限度范圍，其余指標(biāo)成分含量符合所制定配方顆粒含量限度要求。S23～S25 批配方顆粒均購(gòu)自山東一方制藥有限公司，推測(cè)其生產(chǎn)工藝參數(shù)或生產(chǎn)設(shè)備可能與其他廠家存在差異導(dǎo)致當(dāng)藥苷含量略高于限度要求。

指標(biāo)成分從飲片到3 批配方顆粒（S16～S18）的轉(zhuǎn)移率分別為46.16%～47.20%、41.87%～42.26%、39.64%～40.17%、58.20%～59.42%、31.14%～31.26%、84.06%～86.26%，基本符合15 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑轉(zhuǎn)移率平均值±30%范圍。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明配方顆粒制備工藝較為合理。

3 討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

標(biāo)準(zhǔn)湯劑是指以傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論作為指導(dǎo)，選取主產(chǎn)區(qū)藥材或道地藥材，經(jīng)加工炮制而成合格飲片后，按照臨床應(yīng)用時(shí)傳統(tǒng)湯劑的煎煮方法，參照現(xiàn)代中藥提取方法制備而成的單味中藥飲片水煎劑。本研究購(gòu)買15 批次代表性藥材炮制成飲片制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑。忍冬藤屬于清熱解毒類中藥，藥用部位為藤木?！都夹g(shù)要求》標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備中規(guī)定，清熱類藥物不宜久煎，煮沸后再煎煮20 min 為宜，質(zhì)地較硬的飲片可適當(dāng)延長(zhǎng)煎煮時(shí)間。結(jié)合現(xiàn)代臨床用藥習(xí)慣，在《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》相關(guān)規(guī)定的基礎(chǔ)上，出膏率和新綠原酸等6 種指標(biāo)成分的轉(zhuǎn)移率為主要指標(biāo)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化對(duì)標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝參數(shù)進(jìn)行考察，確定標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝。按照固化的工藝對(duì)飲片進(jìn)行提取，對(duì)提取液進(jìn)行濃縮、凍干，制備成標(biāo)準(zhǔn)湯劑，標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝合理，可用于配方顆粒工藝合理性判斷及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定。

3.2 指標(biāo)性成分的選擇

忍冬藤的化學(xué)成分較為豐富，其中的主要活性成分為環(huán)烯醚萜苷類和有機(jī)酸類。對(duì)忍冬藤配方顆粒進(jìn)行成分分析，新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當(dāng)藥苷、馬錢苷在忍冬藤中含量較大，生物活性較高[13-21]，綠原酸和馬錢苷也是《中國(guó)藥典》忍冬藤藥材及飲片質(zhì)量控制所采用的指標(biāo)成分。因此，將此6 種成分作為忍冬藤配方顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)。

建立一測(cè)多評(píng)法檢測(cè)6 種成分含量的方法，其中，綠原酸化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且廉價(jià)易得，作為內(nèi)標(biāo)物，建立其與新綠原酸、馬錢苷酸、隱綠原酸、當(dāng)藥苷、馬錢苷的fi/s，在不同液相色譜系統(tǒng)與色譜柱中RSD均小于5%，符合測(cè)定要求。故選擇綠原酸為內(nèi)標(biāo)物，以降低檢測(cè)成本。此方法的建立為全面考察忍冬藤質(zhì)量提供了參考方法，提示在缺少對(duì)照品的情況下，通過(guò)fi/s及色譜峰的定位計(jì)算含量，可以實(shí)現(xiàn)忍冬藤中6 種成分的質(zhì)量控制。該方法作為忍冬藤質(zhì)量的一種有效評(píng)價(jià)方式，可為忍冬藤的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考和依據(jù)。

3.3 配方顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的建立及與標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)比分析

本研究收集了4 個(gè)產(chǎn)地的15 批忍冬藤藥材，根據(jù)《技術(shù)要求》制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑，采用高效液相色譜法建立了忍冬藤標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒的指紋圖譜，建立忍冬藤標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒中新綠原酸、馬錢苷酸、綠原酸、隱綠原酸、當(dāng)藥苷、馬錢苷的含量測(cè)定方法。以出膏率、指紋圖譜、6 種指標(biāo)成分含量及轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，并結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別分析，多維度衡量了忍冬藤配方顆粒與標(biāo)準(zhǔn)湯劑的一致性，為忍冬藤配方顆粒的生產(chǎn)工藝的研究提供依據(jù)。

配方顆粒出膏率在標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率平均值±30%范圍內(nèi)；3 批配方顆粒與其對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指紋圖譜相似度均＞0.95，10 批配方顆粒的指紋圖譜相似度＞0.9；聚類分析顯示3 批配方顆?？膳c其對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)湯劑聚成一類，10 批配方顆?？膳c14 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑聚為一類；PCA 與PLS-DA 顯示3 批配方顆粒對(duì)其應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)湯劑S3 分布集中，10 批配方顆粒分布較為集中；除S23～S25 批配方顆粒當(dāng)藥苷含量略高，指標(biāo)成分的含量在標(biāo)準(zhǔn)湯劑按制成量換算后含量平均值的70%～＋3s范圍內(nèi)；6 種指標(biāo)成分從飲片到配方顆粒中的轉(zhuǎn)移率基本符合從飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑轉(zhuǎn)移率平均值的70%～130%；以上結(jié)果說(shuō)明忍冬藤配方顆粒制備工藝合理，與忍冬藤飲片臨床湯劑物質(zhì)基礎(chǔ)基本一致。以上研究能夠比較全面的反映忍冬藤配方顆粒的內(nèi)在質(zhì)量，可忍冬藤配方顆粒在臨床中的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)，并為其他配方顆粒研究提供思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突