電離輻射對(duì)不同發(fā)育階段肺泡類(lèi)器官的損傷及機(jī)制

韓 蕊,張 雯,王 潤(rùn),趙國(guó)平,吳李君,韓 偉,陳少鵬

(1.安徽大學(xué) 物質(zhì)科學(xué)與信息技術(shù)研究院,安徽 合肥 230601;2.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與光電技術(shù)學(xué)院,安徽 合肥 230026;3.中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院 強(qiáng)磁場(chǎng)中心,安徽 合肥 230031;4.中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院 健康與醫(yī)學(xué)技術(shù)研究所,安徽 合肥 230031;5.皖南醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,安徽 蕪湖 241002)

核反應(yīng)堆事故或蓄意恐怖主義行動(dòng)造成的急性放射泄漏威脅是一個(gè)重大的公共安全和健康問(wèn)題.例如,切爾諾貝利和福島核電站事故引起人們的廣泛焦慮[1].暴露于輻射環(huán)境時(shí),放射性粒子經(jīng)呼吸進(jìn)入肺部導(dǎo)致肺損傷[2].此外,放射治療(放療)是胸部腫瘤的重要臨床治療手段,但治療中,常見(jiàn)副作用為放射性肺損傷,影響患者生存質(zhì)量甚至生命[3].

肺泡是氣體交換的主要場(chǎng)所,主要由兩種類(lèi)型的上皮細(xì)胞組成,立方形Ⅱ型肺泡上皮(alveolar typeⅡepithelial,簡(jiǎn)稱(chēng)AT2)細(xì)胞和鱗狀Ⅰ型肺泡上皮(alveolar typeⅠepithelial,簡(jiǎn)稱(chēng)AT1)細(xì)胞.AT2細(xì)胞的主要功能是分泌表面活性劑以防止肺泡塌陷,并在肺泡受損時(shí),作為干細(xì)胞再生AT1細(xì)胞[4].AT1細(xì)胞介導(dǎo)氣體交換,是肺主要的功能性細(xì)胞[5].動(dòng)物和細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的相關(guān)研究顯示,輻射對(duì)AT1細(xì)胞的損傷是放射性肺損傷的觸發(fā)因素[6],AT2細(xì)胞是肺纖維化發(fā)生的驅(qū)動(dòng)因素[7].輻射引起AT2細(xì)胞發(fā)生DNA損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體功能障礙等,導(dǎo)致AT2細(xì)胞死亡;也可以引起端粒損耗、活性氧類(lèi)(ROS)產(chǎn)生等,導(dǎo)致AT2細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞衰老[8].但由于動(dòng)物和細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)受限于倫理、種屬差異、無(wú)法實(shí)時(shí)觀察生理病理變化等,諸多問(wèn)題目前仍不清楚.近年來(lái)類(lèi)器官技術(shù)的發(fā)展,為深入開(kāi)展此項(xiàng)研究帶來(lái)了新的機(jī)遇.

干細(xì)胞或器官祖細(xì)胞發(fā)育分化成不同類(lèi)型的細(xì)胞,這些細(xì)胞在一定受限空間內(nèi)自組織形成類(lèi)器官,類(lèi)器官可以更好地模擬人體器官在模型動(dòng)物上無(wú)法重現(xiàn)的特性和多細(xì)胞之間的相互作用[9].從2011年至今,已經(jīng)相繼有多種類(lèi)型類(lèi)器官的報(bào)道,目前已建成的3D類(lèi)器官模型主要有腎、肺、腸、腦、視網(wǎng)膜,胃[10],心臟[11],肝臟和胰腺[12]以及皮膚[13]等.2019年,肺類(lèi)器官的長(zhǎng)期培養(yǎng)方法被建立[14].組織來(lái)源的腫瘤類(lèi)器官主要用于預(yù)測(cè)病人對(duì)放射治療的敏感性[15]和藥物作用篩選[16];干細(xì)胞來(lái)源的肺類(lèi)器官主要用于探索病毒感染機(jī)制[17]以及肺纖維化和肺癌等肺部疾病的潛在研究[16];此外,近年肺類(lèi)器官已開(kāi)始應(yīng)用于毒理學(xué)研究[18-19].但類(lèi)器官在輻射損傷的研究中鮮有應(yīng)用,尤其輻射對(duì)肺發(fā)育的影響.筆者以人源肺類(lèi)器官為模型,探究輻射誘導(dǎo)不同發(fā)育階段的肺類(lèi)器官的損傷機(jī)制,以期為肺再生的機(jī)制研究提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人源胚胎干細(xì)胞(hESC-H9),購(gòu)自Wicell公司;m TeSR1胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基(貨號(hào):85850)、胚胎干細(xì)胞消化液ReLeSRTM1(貨號(hào):5872)、CHIR99021(貨號(hào):72052)購(gòu)自StemCell Technologies公司;Matrigel人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)膠(貨號(hào):354277)、細(xì)胞回收液(貨號(hào):354253)、Matrigel生長(zhǎng)因子基質(zhì)膠(貨號(hào):356231)購(gòu)自Corning公司;RPMI1640培養(yǎng)基(貨號(hào):C11875500BT)、DMEM F/12(貨號(hào):C11330500BT)、Advanced DMEM F/12(貨號(hào):12634010)、GlutaMAX(貨號(hào):35050061)、B27(貨號(hào):17504-044)、地塞米松(Dexamethasone,貨號(hào):D4902)、ITS(貨號(hào):41400-045)、Tryp LE(貨號(hào):12604-013)均購(gòu)自Gibco公司;Activin A(貨號(hào):C687)、Noggin(貨號(hào):CB89)、FGF4(貨號(hào):CR08)、FGF10(貨號(hào):CR11)、KGF(貨號(hào):CH73)均購(gòu)自近岸蛋白公司;SB431542(貨號(hào):HY-10431)、DAPT(貨號(hào):HY-13027)、8-Br-c AMP(貨號(hào):HY-12306)、IBMX(貨號(hào):HY-12318)均購(gòu)自MCE公司;BMP4(貨號(hào):120-05ET)購(gòu)自Peprotech公司;ATRA(貨號(hào):04-0021)購(gòu)自Stemgent公司;BSA(貨號(hào):A8020)、Triton-X100(貨號(hào):T8200)、RIPA緩沖液(貨號(hào):r0020)購(gòu)自Solarbio公司;Trizol試劑(貨號(hào):15596018)購(gòu)自Ambion公司;Hifair? Ⅲ1st Strand cDNA Synthesis Super Mix(貨號(hào):11141ES60)購(gòu)自Yeasen Biotechnology公司;Hochest33342(貨號(hào):H3570)購(gòu)自Invitrogen公司;抗淬滅劑(貨號(hào):P0128S-2)購(gòu)自碧云天公司;Tween20(貨號(hào):1247ML500)購(gòu)自Biofroxx公司.

1.2 胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)

按批號(hào)查詢?nèi)伺咛ジ杉?xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)膠Matrigel的濃度,根據(jù)使用濃度和包被面積計(jì)算后包被6孔板,置于室溫1 h后用于hESCs細(xì)胞的培養(yǎng).每天用預(yù)熱的DPBS清洗并更換新鮮m TeSR1培養(yǎng)基,置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng).細(xì)胞約3～5 d生長(zhǎng)至80%匯合度時(shí),可按照1∶5至1∶10的比例進(jìn)行傳代.

1.3 不同發(fā)育階段肺泡類(lèi)器官的誘導(dǎo)分化

用預(yù)熱的DPBS 輕柔洗1 次對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hESCs,加入含有Activin A(100 ng·m L-1)和CHIR99021(2μmol·L-1)的定型內(nèi)胚層(DE)階段誘導(dǎo)培養(yǎng)基,每天更換培養(yǎng)基.第4天,細(xì)胞用預(yù)熱的Advanced DMEM F/12培養(yǎng)基輕柔洗1次,加入含有Noggin(200 ng·m L-1),FGF4(500 ng·mL-1),CHIR99021(2μmol·L-1)和SB431542(10μmol·L-1)的前腸內(nèi)胚層(AFE)誘導(dǎo)階段培養(yǎng)基,每天換液.第8天時(shí),向細(xì)胞中加入適量Tryp LE消化液消化10 min,收集細(xì)胞,加入一定比例預(yù)冷Matrigel,吹打混勻后種板,37 ℃培養(yǎng)箱放置約15 min,加入含有BMP4(20 ng·m L-1),ATRA(0.5μmol·L-1),CHIR99021(3.5μmol·L-1),GlutaMAX,2%B27的腹側(cè)前腸內(nèi)胚層(VAFE)階段的誘導(dǎo)培養(yǎng)基,每3～4 d換液1次;第15天,加入含有GlutaMAX,2%B27,CHIR99021(3μmol·L-1),FGF10(10 ng·m L-1),KGF(10 ng·m L-1),DAPT(20μmol·L-1)的肺祖類(lèi)器官階段的誘導(dǎo)培養(yǎng)基,每3～4 d傳代1次;第22天,加入含有地塞米松(50 nmol·L-1),8-Br-c AMP(100μmol·L-1),IBMX(100μmol·L-1),KGF(10 ng·m L-1),2%B27,0.25%BSA,0.1%ITS,CHIR99021(3 μmol·L-1),SB431542(10μmol·L-1)的肺泡類(lèi)器官階段的誘導(dǎo)培養(yǎng)基,每3～4 d傳代1次.

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

按試劑盒的操作說(shuō)明,采用Trizol試劑提取總RNA,將1μg總RNA 使用Hifair? Ⅲ1st Strand cDNA Synthesis Super Mix試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA.相應(yīng)引物和SYBR Green Master Mix配制qPCR反應(yīng)體系,反應(yīng)在Roche LightCycler 480 PCR系統(tǒng)上進(jìn)行,每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次.

1.5 細(xì)胞免疫熒光染色

取種于爬片上的細(xì)胞,預(yù)冷的PBS清洗后用4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞20 min;加入PBS清洗3次,0.3%Triton-X100室溫通透30 min;PBS清洗3次后用含5%BSA的封閉液室溫封閉細(xì)胞1 h;棄去封閉液,加入封閉液稀釋的一抗于室溫下孵育1 h;吸棄一抗并用PBS清洗3次,用封閉液稀釋的二抗于室溫下避光孵育1 h;吸棄二抗,加入PBS清洗3次,Hochest33342覆蓋細(xì)胞10 min后,滴加抗淬滅劑,封片,在熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察.

1.6 類(lèi)器官免疫熒光染色

取處理后的類(lèi)器官,加入預(yù)冷的PBS 清洗類(lèi)器官,棄去PBS 后加入細(xì)胞回收液于冰上溶解Matrigel 45 min,收集類(lèi)器官于離心管中,離心棄上清;加入4%的多聚甲醛于4℃固定45 min,補(bǔ)加0.1%Tween20,離心棄上清;加入0.5%Tween20于4 ℃通透30 min;加入含0.1%Tween20和3%BSA的PBS室溫封閉類(lèi)器官1 h;用含0.1%Tween20和0.1%BSA的PBS配制的TBPBS稀釋一抗,置于4℃搖床過(guò)夜孵育;TBPBS清洗類(lèi)器官3次,用TBPBS稀釋二抗,室溫避光孵育1.5 h;TBPBS清洗類(lèi)器官3次,Hochest33342復(fù)染10 min后,將類(lèi)器官置于載玻片上;滴加抗淬滅劑后加蓋玻片封片,在熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察.

1.7 PI染色

取處理后的細(xì)胞,Tryp LE消化后收集至離心管中,離心棄上清;加入PBS離心清洗1次,加入100μg·mL-1的PI染料,避光于冰上孵育15 min;離心棄去PI染液,加入PBS重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè).

1.8 蛋白免疫印跡

使用含有蛋白酶抑制劑和釩酸鈉的RIPA裂解液裂解細(xì)胞,超聲后離心取蛋白質(zhì)上清,用BCA 試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)定量,取等量的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE);將蛋白質(zhì)從丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上,用5%脫脂奶對(duì)膜封閉;加入一抗,置于4℃孵育過(guò)夜;加入二抗在室溫下孵育1 h,成像觀察.

1.9 流式細(xì)胞分析

將細(xì)胞回收液加入處理后的類(lèi)器官培養(yǎng)板中,冰上溶解Matrigel 45 min;收集類(lèi)器官于離心管中,離心棄上清;加入Tryp LE于37℃消化15 min,補(bǔ)加PBS,離心棄上清;加入1 m L 4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞10 min,補(bǔ)加PBS至6 mL,離心棄上清;加入1 mL 0.2%Triton-X100室溫通透細(xì)胞20 min,補(bǔ)加PBS至6 mL,離心棄上清;加入1 mL 1%FBS室溫封閉1 h,離心棄上清;加入封閉液稀釋的一抗200μL,室溫孵育細(xì)胞1 h,補(bǔ)加PBS至6 mL,離心棄上清;加入封閉液稀釋的二抗200μL,室溫避光孵育細(xì)胞1 h,補(bǔ)加PBS至6 m L,離心棄上清;加入1 m L 100μg·mL-1的PI染料,避光于冰上孵育15 min,補(bǔ)加PBS至6 m L,離心棄上清;加入100μL PBS將細(xì)胞混勻,流式細(xì)胞儀避光檢測(cè).

2 結(jié)果與分析

2.1 人源肺泡類(lèi)器官的模型構(gòu)建

為了在體外研究輻射對(duì)不同發(fā)育階段人肺泡的損傷,首先需要構(gòu)建人肺泡類(lèi)器官模型.由于該研究中使用的肺泡類(lèi)器官是由多能誘導(dǎo)干細(xì)胞而來(lái),故首先用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)hESCs的干性進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示98.9%的細(xì)胞均為OCT4和Nanog雙陽(yáng)性細(xì)胞(圖1(a)),表明該研究使用的hESCs保持著良好的干性特征.

圖1 人源胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)肺泡類(lèi)器官

參考Pei等[20]誘導(dǎo)肺泡類(lèi)器官的方案,用人胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,簡(jiǎn)稱(chēng)hESCs)進(jìn)行人源肺祖類(lèi)器官(lung progenitors,簡(jiǎn)稱(chēng)LPs)和肺泡類(lèi)器官(alveolar organoids,簡(jiǎn)稱(chēng)ALOs)的構(gòu)建.誘導(dǎo)流程和不同誘導(dǎo)階段添加的細(xì)胞因子如圖1(b)所示:前7天為2D細(xì)胞培養(yǎng),其中第0～3天為定型內(nèi)胚層階段(definitive endoderm,簡(jiǎn)稱(chēng)DE),使用定型內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基;第4～7天為前腸內(nèi)胚層階段(anterior foregut endoderm,簡(jiǎn)稱(chēng)AFE),使用前腸內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基.第7天時(shí)將消化得到的細(xì)胞與Matrigel混合培養(yǎng),且使其逐漸形成3D類(lèi)器官.第8～14天為腹部前腸內(nèi)胚層階段(ventralized anterior foregut endoderm,簡(jiǎn)稱(chēng)VAFE),使用腹部前腸內(nèi)胚層誘導(dǎo)培養(yǎng)基;第15～21天為L(zhǎng)Ps階段,使用LPs誘導(dǎo)培養(yǎng)基;第22～35天為ALOs階段,使用ALOs誘導(dǎo)培養(yǎng)基.各階段細(xì)胞的示意圖如圖1(c)所示,在培養(yǎng)的第4天細(xì)胞密度逐漸增大,第5天逐漸有大量緊密的細(xì)胞團(tuán)飄浮培養(yǎng)基中,第21天形成100～200μm 的人源肺祖類(lèi)器官,第35天形成200～500μm 的肺泡類(lèi)器官.

接著,筆者對(duì)各個(gè)誘導(dǎo)階段的類(lèi)器官進(jìn)行鑒定.首先,使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)各時(shí)期標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖2(a)所示,DE階段干性基因OCT4轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào),DE階段標(biāo)志基因FOXA2/SOX17分別上升幾十甚至上百倍,表明誘導(dǎo)開(kāi)始進(jìn)入DE階段;LPs階段TTF1的表達(dá)量上調(diào)了300倍左右,SOX2和SOX9也明顯上調(diào);在誘導(dǎo)了35 d的ALOs階段,HOPX/SFTPB/SFTP都有成百上千倍的上調(diào).用免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步在蛋白水平驗(yàn)證不同時(shí)期的類(lèi)器官誘導(dǎo)情況,如圖2(b)所示,在不同階段OCT4、FOXA2、SOX17、TTF1、EpCAM、平足蛋白(podoplanin)、肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白C(prosurfactant protein C,簡(jiǎn)稱(chēng)pro-SPC)都有一定程度表達(dá),這些蛋白的表達(dá)進(jìn)一步證明各階段肺泡類(lèi)器官模型成功建立.

圖2 肺泡類(lèi)器官培養(yǎng)各階段的鑒定結(jié)果

2.2 輻射誘導(dǎo)hESCs和DE細(xì)胞的損傷

人源肺泡類(lèi)器官模型構(gòu)建成功之后,探究γ射線對(duì)hESCs和DE階段細(xì)胞的影響.首先分別使用1,5,10 Gy的γ射線分別對(duì)hESCs和DE階段的細(xì)胞進(jìn)行照射處理,24 h后進(jìn)行PI染色,流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞的存活狀況,結(jié)果如圖3所示.發(fā)現(xiàn)1 Gy的γ射線處理24 h,hESCs的死亡增加了13倍(圖3(a)左),在10 Gy處理組,約98%的細(xì)胞發(fā)生了死亡;而DE階段細(xì)胞死亡比例雖然呈上升趨勢(shì),但在輻射前后沒(méi)有顯著差異(圖3(a)右).之后,對(duì)2種細(xì)胞在不同劑量輻射處理后,Western Blot檢測(cè)各自標(biāo)志性蛋白的表達(dá)量變化,結(jié)果顯示(圖3(b)左),hESC的干性相關(guān)蛋白在24 h沒(méi)有明顯變化,可能是細(xì)胞死亡太多,且時(shí)間較短,細(xì)胞還沒(méi)有發(fā)生分化.但DE階段細(xì)胞中,與其分化相關(guān)的蛋白SOX17的表達(dá)量在5 Gy和10 Gy時(shí)顯著下調(diào),故推測(cè)輻射會(huì)影響DE階段細(xì)胞向肺泡類(lèi)器官的分化能力.為了驗(yàn)證這一猜想,對(duì)第3天的DE階段細(xì)胞輻射后,立即將培養(yǎng)基更換為AFE階段的誘導(dǎo)培養(yǎng)基,并繼續(xù)誘導(dǎo)14 d,觀察類(lèi)器官形成情況,結(jié)果如圖3(d)所示,對(duì)照組在第2天開(kāi)始出現(xiàn)明顯的球體樣的細(xì)胞團(tuán)聚集,第4天致密的細(xì)胞團(tuán)大量增加,第14天便形成典型的肺祖類(lèi)器官的形態(tài);而1 Gy處理組中雖然在第4天有少量聚集的細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn),但第14天時(shí)并未形成明顯的類(lèi)器官形態(tài);5 Gy和10 Gy處理組在輻射處理之后的第2天,就出現(xiàn)明顯的細(xì)胞密度不足,且第4天還出現(xiàn)異常的分化細(xì)胞的狀態(tài),在第14天無(wú)法自組裝形成類(lèi)器官.最后,對(duì)第14天形成的類(lèi)器官的尺寸進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果如圖3(c)所示,即使是1 Gy低劑量的輻射處理,也會(huì)使DE階段細(xì)胞的分化功能受到明顯損傷,幾乎無(wú)法形成類(lèi)器官.

圖3 1,5,10 Gy的γ射線對(duì)hESCs和DE階段細(xì)胞的影響

2.3 輻射誘導(dǎo)肺祖類(lèi)器官的損傷

隨后,對(duì)誘導(dǎo)21 d形成的LPs進(jìn)行了γ射線照射處理,結(jié)果顯示輻射1 d之后,不同劑量處理下的LPs與對(duì)照組相比,在形態(tài)學(xué)上沒(méi)有明顯變化(如圖4(a)所示);但輻射3 d之后,5 Gy和10 Gy處理下的LPs周?chē)扒粌?nèi)開(kāi)始出現(xiàn)明顯的死亡細(xì)胞,類(lèi)器官開(kāi)始出現(xiàn)明顯的損傷[21](如圖4(b)所示);輻射后的第7天,對(duì)照組和1 Gy處理下的類(lèi)器官明顯變大,且生長(zhǎng)狀態(tài)良好,但5 Gy和10 Gy處理下的LPs依然保持在受損狀態(tài)(如圖4(c)所示).故對(duì)類(lèi)器官的受損情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì),圖4(d)為不同劑量不同時(shí)間時(shí),受損類(lèi)器官所占比例;圖4(e)為不同輻射劑量不同時(shí)間時(shí),受損類(lèi)器官產(chǎn)生的散細(xì)胞的遷移距離.統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,肺祖類(lèi)器官在輻射后第3天開(kāi)始出現(xiàn)明顯損傷,且損傷一直保持到第7天甚至更長(zhǎng)時(shí)間,沒(méi)有出現(xiàn)較明顯的修復(fù)現(xiàn)象;1 Gy的低劑量對(duì)LPs沒(méi)有明顯損傷,但中劑量的5 Gy和高劑量的10 Gy對(duì)LPS的損傷幾乎沒(méi)有差異.

圖4 輻射對(duì)肺祖類(lèi)器官的影響

2.4 輻射對(duì)肺祖類(lèi)器官分化的影響

前面的結(jié)果表明中高劑量輻射導(dǎo)致肺祖類(lèi)器官的明顯損傷,接著通過(guò)檢測(cè)LPs分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子TTF1,研究輻射對(duì)LPs向ALOs分化的影響.檢測(cè)結(jié)果顯示,γ射線處理3,7 d之后,5 Gy和10 Gy處理組TTF1基本不表達(dá)(圖5(a)),表明高于5 Gy的γ射線輻射可導(dǎo)致類(lèi)器官嚴(yán)重受損,并可影響其進(jìn)一步分化.為了尋找輻射對(duì)分化影響的直接證據(jù),輻射之后,立即將LPs培養(yǎng)基更換為ALOs誘導(dǎo)培養(yǎng)基,并在第35天時(shí)進(jìn)行觀察與檢測(cè).圖5(b)的明場(chǎng)圖顯示,1 Gy輻射處理之后的LPs再繼續(xù)形成ALOs時(shí)與對(duì)照組沒(méi)有明顯差異,但5 Gy和10 Gy處理之后的LPs繼續(xù)形成ALOs時(shí),ALOs的狀態(tài)和形成率都受到較大影響,甚至失去類(lèi)器官明亮飽滿、邊緣清晰的典型特征,成為黑色不透亮的團(tuán)狀聚集體.同時(shí),對(duì)形成的ALOs進(jìn)行的免疫熒光鑒定結(jié)果顯示(圖5(c)),輻射導(dǎo)致AT2細(xì)胞分泌的表面活性物質(zhì)C表達(dá)量降低甚至不表達(dá),表明輻射后的LPs并未形成ALOs.以上結(jié)果表明,中高劑量的輻射會(huì)抑制LPs向ALOs的分化.

圖5 輻射對(duì)肺祖類(lèi)器官分化的影響

2.5 輻射誘導(dǎo)肺泡類(lèi)器官的損傷

肺泡是肺的主要功能單元.為了研究輻射對(duì)肺泡細(xì)胞的影響,對(duì)35 d形成的ALOs進(jìn)行輻射處理,并在處理1 d和7 d之后分別檢測(cè),結(jié)果如圖6所示.

圖6 輻射對(duì)肺泡類(lèi)器官的影響

明場(chǎng)圖結(jié)果顯示,不同輻射劑量處理的類(lèi)器官在形態(tài)學(xué)上并無(wú)明顯差異(圖6(a)).流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示輻射1 d后AT1和AT2細(xì)胞數(shù)的比例沒(méi)有發(fā)生明顯變化,但輻射7 d后兩種細(xì)胞的比例均呈現(xiàn)下降趨勢(shì),尤其是10 Gy處理組的AT1細(xì)胞和AT2細(xì)胞數(shù)比例均顯著性下降,分別下降了68.3%和76%(圖6(b)).最后,通過(guò)文獻(xiàn)報(bào)道和生信分析,筆者篩選了一些與肺分化相關(guān)并在肺泡中表達(dá)的基因[22],包括NFIB,KLF2,YAP1,HOXA5和NUMB.輻射后,對(duì)這些基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè).結(jié)果顯示,輻射后第1天,NUMB的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)(圖6(c)左).NUMB的表達(dá)與祖細(xì)胞的分化相關(guān),推測(cè)輻射的第1天,類(lèi)器官可能通過(guò)激活祖細(xì)胞分化,來(lái)補(bǔ)充受損的功能性細(xì)胞.輻射后第3天,NUMB的轉(zhuǎn)錄水平回落,NFIB,KLF2,YAP1和HOXA5的轉(zhuǎn)錄水平都大幅上調(diào)(圖6(c)中).4個(gè)基因NFIB,KLF2,YAP1和HOXA5與非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),該結(jié)果表明類(lèi)器官中有惡性轉(zhuǎn)化的發(fā)生.雖然7 d后,NFIB和YAP1轉(zhuǎn)錄水平有所回落,但KLF2和HOXA5仍保持較高水平(圖6(c)右).以上結(jié)果表明,輻射7 d內(nèi),肺泡類(lèi)器官形態(tài)上雖然沒(méi)有較大影響,但其基因的表達(dá)已受到很大影響,這可能對(duì)肺泡功能產(chǎn)生長(zhǎng)期影響.

3 討論

類(lèi)器官因可以維持其天然組織的遺傳和表型特征[23],已廣泛應(yīng)用于高通量藥物篩選、精準(zhǔn)醫(yī)療、器官組織發(fā)育以及組織再生領(lǐng)域[24].同時(shí),類(lèi)器官是一種體外培養(yǎng)的多細(xì)胞體系,便于研究細(xì)胞間的協(xié)作,因此,近年來(lái)類(lèi)器官開(kāi)始應(yīng)用于毒理學(xué)研究[19].

筆者建立并運(yùn)用人源肺泡類(lèi)器官模型開(kāi)展輻射誘導(dǎo)不同發(fā)育階段肺損傷的研究,采用了Pei等[20]的方法,構(gòu)建了多種肺類(lèi)器官.同已報(bào)道的其他人肺類(lèi)器官培養(yǎng)方案(如氣液交界面系統(tǒng)[25]、以基質(zhì)膠為介質(zhì)的克隆球[26]、支氣管肺泡樣結(jié)構(gòu)[27]和來(lái)自成體干細(xì)胞和多能干細(xì)胞的肺類(lèi)器官[28-29]等)相比,筆者采用的類(lèi)器官模型培養(yǎng)周期相對(duì)較短,可以較好地反映人體肺泡的細(xì)胞構(gòu)成,并且可以在體外擴(kuò)大培養(yǎng)的同時(shí)還能保持類(lèi)器官長(zhǎng)時(shí)間的結(jié)構(gòu)完整性和遺傳特征的穩(wěn)定性.但在類(lèi)器官構(gòu)建的過(guò)程中,需要嚴(yán)格注意誘導(dǎo)分化時(shí)細(xì)胞的密度和誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng),這對(duì)各階段的分化效率來(lái)說(shuō)非常重要;為了保證類(lèi)器官良好的3D結(jié)構(gòu),要保證基質(zhì)膠的濃度在80%以上并及時(shí)更新基質(zhì)膠.

筆者的研究表明不同發(fā)育階段的肺泡類(lèi)器官對(duì)輻射的敏感性不同.隨著肺泡類(lèi)器官的誘導(dǎo)進(jìn)展,發(fā)現(xiàn)DE期的細(xì)胞較干細(xì)胞更耐輻射.輻射雖然引起DE期細(xì)胞的分化,但導(dǎo)致的細(xì)胞死亡要低于受輻射的干細(xì)胞.LPs類(lèi)器官輻射后形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯的變化,出現(xiàn)向外遷移的細(xì)胞,并隨著劑量的增加逐漸喪失誘導(dǎo)成ALOs類(lèi)器官的能力.ALOs類(lèi)器官輻射后仍保持著原有的形態(tài)學(xué)特征,但其AT1和AT2細(xì)胞數(shù)的比例發(fā)生了變化,關(guān)鍵標(biāo)志性基因的表達(dá)也出現(xiàn)顯著性變化.已有報(bào)道顯示AT2細(xì)胞的缺失和功能障礙在放射性肺損傷中起著核心作用[7],在AT2細(xì)胞出現(xiàn)的結(jié)果與小鼠模型上觀察到的有一定的相似性.總之,筆者所建立的人源肺泡類(lèi)器官輻射損傷模型,較系統(tǒng)地觀察了不同發(fā)育階段的人源肺泡類(lèi)器官對(duì)輻射的損傷響應(yīng),有助于進(jìn)一步揭示放射性肺損傷的機(jī)制.

目前類(lèi)器官的應(yīng)用依然存在許多限制.首先,類(lèi)器官建模的技術(shù)方案還不夠客觀、規(guī)范,這可能影響類(lèi)器官的可重復(fù)性,導(dǎo)致研究結(jié)果出現(xiàn)偏差.目前對(duì)于肺泡類(lèi)器官來(lái)說(shuō),只能夠比較好地模擬上皮細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展,但肺部的發(fā)育分化是上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞互相作用的結(jié)果,甚至還包括血管的發(fā)生以及和免疫細(xì)胞之間的相互作用,所以單獨(dú)的上皮細(xì)胞之間的關(guān)系尚未完全闡明肺器官的真實(shí)結(jié)構(gòu),需要建立更接近人體水平的類(lèi)器官.肺類(lèi)器官未來(lái)可以用以探索污染物與靶組織和器官之間的相互作用,以評(píng)估暴露于各種環(huán)境毒素對(duì)肺部的急性和慢性不利影響;或者用于研究肺部疾病的病理過(guò)程和藥物靶點(diǎn),例如肺炎、慢性肺纖維化、慢阻肺等.