基于干細(xì)胞與生物3D打印技術(shù)的皮膚組織工程研究與應(yīng)用進(jìn)展

李 玲, 丁 文, 劉 明

(1)黑龍江省黑河市疾病預(yù)防控制中心 檢驗(yàn)科, 黑龍江 黑河 164300;2)浙江工業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院,材料成形與控制工程研究所, 杭州 310014;3)浙江省腫瘤醫(yī)院 中國(guó)科學(xué)院杭州醫(yī)學(xué)研究所, 細(xì)胞治療技術(shù)研究與工程實(shí)驗(yàn)室, 杭州 310022)

皮膚作為具有大表面人體最外層的器官,大約占人體重的15%,其平鋪開的面積約1.7 m2[1,2]。近年來,與皮膚相關(guān)的炎癥、衰老和糖尿病傷口愈合等問題是臨床和研究中的難題[3]。迄今為止,最常用的治療皮膚缺損的方法是自體皮膚移植。然而,供體部位的缺乏、繼發(fā)性損傷和感染風(fēng)險(xiǎn)限制了自體皮膚移植的應(yīng)用。與傳統(tǒng)的治療方法相比,組織工程皮膚(tissue engineering skin , TES)為治療皮膚缺陷提供了一種新的方法[4,5]。Naik團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)當(dāng)人體有病原菌入侵時(shí),誘發(fā)的炎癥會(huì)使上皮干細(xì)胞中負(fù)責(zé)損傷和修復(fù)的AIM2基因,從而當(dāng)病原體再次入侵相同部位時(shí),帶有“記憶”的上皮干細(xì)胞會(huì)快速分泌損傷與修復(fù)蛋白,召集大量的免疫細(xì)胞和上皮干細(xì)胞快速消滅病原菌。他們證明了皮膚中上皮干細(xì)胞會(huì)對(duì)炎癥反應(yīng)產(chǎn)生記憶,這種皮膚“記憶”能力將可能改變我們對(duì)多種自身免疫疾病和癌癥的認(rèn)識(shí)[6]。Yu團(tuán)隊(duì)報(bào)道基于可穿戴交聯(lián)聚合物(wearable crosslinked polymer layer,XPL)凝膠系統(tǒng)人工皮膚可以模擬正常的皮膚性質(zhì),XPL可以局部應(yīng)用,在皮膚界面快速固化,XPL的發(fā)現(xiàn)可能為皮膚功能屏障受損、藥物傳送和損傷修復(fù)方面提供先進(jìn)的解決方案[7]。目前的研究在皮膚炎癥、衰老和皮膚修復(fù)上取得一定的進(jìn)步,但在創(chuàng)建功能性齊全的皮膚上仍然存在局限。

皮膚是人體內(nèi)非常復(fù)雜器官,主要由3層結(jié)構(gòu)組成包括表皮、真皮和皮下組織,表皮主要由角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞組成,物理屏障、免疫防御和感受器的作用;真皮主要由成纖維細(xì)胞、膠原纖維、血管、神經(jīng)、毛囊和汗腺組成,為皮膚提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),調(diào)節(jié)體溫促進(jìn)傷口愈合,支持和保護(hù)的作用;皮下組織作為皮膚的最內(nèi)層,主要由成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞組成,避免寒冷和劇烈的創(chuàng)傷,儲(chǔ)存能量促進(jìn)傷口的修復(fù)[8,9]。為了構(gòu)建用于藥物篩選、化妝品測(cè)試和可以移植的仿生皮膚模型,皮膚結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性需要更加可控的成型技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。如:3D生物打印。

生物打印工程技術(shù)提供了一個(gè)完全自動(dòng)化和先進(jìn)的平臺(tái),可以利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)通過一層一層的打印工藝,實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞、生物材料和生長(zhǎng)因子的沉積,具有高度的靈活性和可重復(fù)性[10,11]。3D生物打印技術(shù)有助于高度自動(dòng)化地構(gòu)建復(fù)雜的組織構(gòu)建物,可以同時(shí)沉積多種細(xì)胞類型和生物材料,以增強(qiáng)與天然皮膚結(jié)構(gòu)的相似性。目前主要的生物打印包括微滴噴墨式生物打印[12]、擠出式生物打印[13]、激光式生物打印[14]立體光刻式生物打印技術(shù)[15],并且對(duì)于皮膚的打印也已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了便攜式生物打印機(jī)的構(gòu)建[9]。三維生物打印在TES制備方面具有一些優(yōu)勢(shì),包括:(1)根據(jù)創(chuàng)面的形狀和深度,計(jì)算機(jī)掃描成像技術(shù)可以快速打印出與傷口匹配的植皮,具有及時(shí)性、高通量重復(fù)性高的特點(diǎn)。(2)有多種生物墨水的可用性。它們可以靈活、準(zhǔn)確地沉積不同的生物制劑(包括活細(xì)胞、核酸、生長(zhǎng)因子、預(yù)明膠化溶液等),構(gòu)建組織結(jié)構(gòu),其形態(tài)和生理學(xué)表現(xiàn)出相似的正常皮膚。(3)利用逐層沉積的原理,可以在傷口表面原位打印皮膚組織。(4)具有互聯(lián)的孔隙和一定的表面積,支持細(xì)胞附著、生長(zhǎng)、細(xì)胞間通信以及氣體和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換,在過去的十年中,3D生物打印技術(shù)已被用于各個(gè)領(lǐng)域的生物組織的制造,如血管系統(tǒng)、心、骨骼、軟骨、皮膚和肝[1,4,14]。

細(xì)胞來源是生物打印的重要組成成分。大規(guī)模的工業(yè)化細(xì)胞培養(yǎng)是生物打印應(yīng)用的必要條件,使用干細(xì)胞可能提供潛在的解決方案來克服細(xì)胞數(shù)量的局限性[7,10]。自2006年日本科學(xué)家山中伸彌團(tuán)隊(duì)將4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的組合轉(zhuǎn)入到皮膚纖維母細(xì)胞中得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)后,多能干細(xì)胞的增殖和分化方向得到廣泛重視[16]。近年來,有多研究致力于iPSCs分化來的角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞以及其他皮膚相關(guān)細(xì)胞,減少了移植后產(chǎn)生的排斥反應(yīng)[17]。另外,脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stromal cells, MSCs)和毛囊干細(xì)胞(hair follicle stem cells,HFSC)分化來的汗腺和毛囊附屬器等也備受關(guān)注,而3D生物打印的MSCs被證實(shí)具有更好的細(xì)胞增殖和表達(dá)生物因子的能力,種子細(xì)胞的來源解決了皮膚組織工程對(duì)于細(xì)胞數(shù)量的需求[7,18]。干細(xì)胞技術(shù)方面的突破使我們能夠建立更可靠、更復(fù)雜的生理或病理體外皮膚模型。

Yu等人以3D生物打印技術(shù)為基礎(chǔ),詳細(xì)的介紹了體外輸送各種類型的干細(xì)胞及其抗生素促進(jìn)傷口愈合等進(jìn)展[19]。Ishack等人介紹了3D生物打印的基本原理,3D生物打印皮膚的應(yīng)用[13]。目前,國(guó)內(nèi)外更多的研究集中在干細(xì)胞、3D生物打印和皮膚結(jié)構(gòu)構(gòu)建上,但從皮膚的應(yīng)用需求到下游應(yīng)用的綜述卻少。本文綜述介紹4種3D生物打印技術(shù),并與來源于干細(xì)胞的皮膚細(xì)胞最新進(jìn)展進(jìn)行詳細(xì)的介紹,重點(diǎn)討論了不同的3D生物打印工藝構(gòu)建皮膚的特點(diǎn)和皮膚種子細(xì)胞的來源,并剖析了皮膚構(gòu)建物的下游應(yīng)用需求,為本領(lǐng)域在體外生理或病理模型構(gòu)建、藥物篩選、再生醫(yī)學(xué)和臨床等研究提供參考。

1 皮膚的應(yīng)用需求

皮膚是人體內(nèi)非常復(fù)雜的組織,通過執(zhí)行關(guān)鍵功能來確保生存,如保護(hù)、體溫調(diào)節(jié)、排泄、吸收、代謝功能、感覺、蒸發(fā)管理和美學(xué)。開展皮膚相關(guān)問題的研究及應(yīng)用對(duì)于高仿生皮膚構(gòu)建有著廣泛的需求。

1.1 化妝品及藥物篩選需求:化妝品、疫苗、膏藥、皮膚病藥物

根據(jù)ISO 10993《醫(yī)療器械生物相容性標(biāo)準(zhǔn)》,皮膚刺激是生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中必須考慮的3個(gè)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)之一[20]。Akagi等利用逐層細(xì)胞包被技術(shù)構(gòu)建人表皮模型進(jìn)行刺激物驗(yàn)證,并從化學(xué)物品中分離出了有效的藥物或化妝品成分。皮膚表皮層的建立已經(jīng)取得了大的進(jìn)展,但是化妝品及藥物篩選的需求對(duì)于仿生的皮膚構(gòu)建物要求越來越嚴(yán)格[21]。隨著科技的不斷進(jìn)步,細(xì)胞和分子生物學(xué)方法被引入到現(xiàn)代毒理學(xué)研究,新的檢測(cè)方法亦隨之出現(xiàn)。如體外培養(yǎng)的永生化細(xì)胞、組織器官再生、計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)毒性等新的體外檢測(cè)方法替代傳統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法。近年來,歐洲聯(lián)盟完全禁止對(duì)化妝品進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn),這就需要開發(fā)試驗(yàn)應(yīng)用的替代模型[22]。不同的跨國(guó)公司和3D打印公司之間正在不斷的增加研發(fā)合作,凸顯了對(duì)于3D生物打印應(yīng)用于工程化皮膚構(gòu)造方面的重視。

1.2 皮膚移植:糖尿病、燒傷、皮膚病(大皰性表皮松懈癥、牛皮蘚)

因靜脈淤滯、糖尿病或其他疾病引起的皮膚潰瘍等疾病正在日益增加,因此人們對(duì)于皮膚修復(fù)的需求越來越多。Jackw團(tuán)隊(duì)通過基因編輯(CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)介導(dǎo)的同源定向修復(fù)技術(shù)(homology directed repair,HDR)來靶向來源于大皰性表皮松懈癥患者成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)的iPSC,矯正了突變基因COL7A1,從基因修復(fù)后的iPSCs分化為成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞,且在皮膚創(chuàng)傷的治療過程中不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥。這項(xiàng)重要研究將會(huì)給皮膚潰爛的大皰性表皮松懈癥患者帶去福音[23,24]?；蚓庉嫷某霈F(xiàn)改變了一些遺傳性疾病帶來的困擾,但仍存在基因突變風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。隨著科技的進(jìn)步,在患者來源細(xì)胞和動(dòng)物模型中基因編輯療法為其在遺傳性皮膚病的臨床應(yīng)用提供了進(jìn)一步的可能[25]。3D打印技術(shù)不僅可以形成仿生的皮膚構(gòu)建物,并且可以擺脫基因突變和新傷口炎癥等困擾,為皮膚移植和臨床應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ)。

1.3 仿生層次的需求:色素、毛囊、神經(jīng)、汗腺

皮膚構(gòu)建包含多種功能結(jié)構(gòu),除了表皮和真皮外,皮膚還有其他附屬結(jié)構(gòu)包括毛囊、神經(jīng)汗腺等,它們對(duì)于皮膚功能發(fā)揮非常重要的作用,通過執(zhí)行關(guān)鍵功能來確保生存,如保護(hù)、體溫調(diào)節(jié)、排泄、吸收、代謝、感覺、蒸發(fā)管理和美學(xué)等[22,26]。目前,傳統(tǒng)的皮膚構(gòu)建物已經(jīng)為燒傷或慢性創(chuàng)傷患者提供了有益替代物,但現(xiàn)有的生物工程構(gòu)建物在色素沉著、毛囊和汗腺再生等功能結(jié)構(gòu)重建方面仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠理想[7,9,27]。生物打印方法有助于高度自動(dòng)化地構(gòu)建復(fù)雜的皮膚構(gòu)建物,其在生物學(xué)、材料學(xué)和計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)領(lǐng)域的潛力將有望使全功能皮膚結(jié)構(gòu)得以實(shí)現(xiàn)。

2 3D生物打印技術(shù)

生物打印技術(shù)是從3D打印技術(shù)發(fā)展而來的,目前主要包括噴墨式生物打印、擠出式生物打印、激光輔助式生物打印和立體光刻式生物打印。3D生物打印技術(shù)有潛力直接創(chuàng)建梯度宏觀結(jié)構(gòu),以更好地模擬自然細(xì)胞外基質(zhì),從而同時(shí)增加多種類型細(xì)胞的附著和增殖,為高仿生皮膚的制備提供了可能。

2.1 噴墨式生物打印皮膚

由于噴墨式生物打印技術(shù)簡(jiǎn)單、靈活、多功能性并能良好控制沉積模式,使其在皮膚組織構(gòu)建中得到廣泛的應(yīng)用。Ng等利用噴墨式生物打印來源不同供體的角質(zhì)形成細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和纖維母細(xì)胞,所形成的表皮區(qū)域厚度從51.6±3.4 μm(第1周)增加到143.5±6.7 μm(4周),并且在氣液相界面(air-liquid interface , ALI)培養(yǎng)2周,表皮區(qū)域的細(xì)胞形態(tài)顯示了角質(zhì)細(xì)胞分化的早期跡象,這對(duì)黑素體吸收至關(guān)重要。通過上述打印方式,他們成功的構(gòu)建了色素沉著的皮膚構(gòu)建物,且表現(xiàn)出與人類皮膚類似的色素沉著,并與傳統(tǒng)手工鑄造的含有色素皮膚構(gòu)建體相比發(fā)現(xiàn),存在明顯的表皮層和一層連續(xù)的基底膜蛋白[27]。3D生物打印技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了三維體外皮膚著色技術(shù)的發(fā)展。Kim團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種混合3D細(xì)胞打印系統(tǒng),可以同時(shí)使用噴墨式生物打印和擠出式生物打印構(gòu)建含有真皮的皮膚模型。首先,通過使用擠出式打印系統(tǒng)將聚己內(nèi)酯材料構(gòu)建成一個(gè)網(wǎng)狀基層,然后利用噴墨式打印系統(tǒng)均勻的分配含有角質(zhì)形成細(xì)胞的膠原材料。所構(gòu)建的組織模型在ALI條件下培養(yǎng)14天,通過HE染色切片發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞被拉伸,并且與在天然真皮細(xì)胞拉伸情況相似,這一現(xiàn)象也表明角化細(xì)胞在第14天分化。層狀表皮厚度(97±3 μm)也保持在75 ～ 150 μm的正常范圍內(nèi)?；旌舷到y(tǒng)構(gòu)建的皮膚模型顯示了良好的生物學(xué)特性,如穩(wěn)定存在的纖維生長(zhǎng)因子以及成熟的表皮層[28,29]。同時(shí)使用基于噴墨式和擠出式系統(tǒng)或者其他分配模塊,為構(gòu)建仿生的生理或病理模型奠定了良好基礎(chǔ)。

2.2 擠出式生物打印皮膚

擠出式生物打印是生物打印方法中較簡(jiǎn)單的一種。價(jià)格低廉、打印速度快擴(kuò)充性強(qiáng),對(duì)細(xì)胞的損傷較低,是進(jìn)行皮膚構(gòu)建較好的打印方式[30]。Huang團(tuán)隊(duì)使用明膠和海藻酸鈉對(duì)真皮組織進(jìn)行了3D生物打印,他們創(chuàng)建了附有小鼠上皮祖細(xì)胞的真皮,并且發(fā)現(xiàn)負(fù)載細(xì)胞的真皮結(jié)構(gòu)至少可以保持3周。在培養(yǎng)7天后,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞良好的附著在生物材料上,表現(xiàn)出明顯的活力。在體外,將小鼠足底真皮和表皮生長(zhǎng)因子同步加入細(xì)胞外基質(zhì)模擬物中,為表皮祖細(xì)胞創(chuàng)造了良好的微環(huán)境,維持細(xì)胞活力,促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)散和基質(zhì)形成,實(shí)現(xiàn)了特異性細(xì)胞分化。在體內(nèi),直接將生物打印細(xì)胞外基質(zhì)移植到小鼠燒傷的爪子中,恢復(fù)了汗腺的功能[31]。Albanna帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)開發(fā)了可移動(dòng)的皮膚生物打印系統(tǒng),促進(jìn)了自體或異體成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞直接進(jìn)入損傷區(qū)域,形成表皮和真皮的分層結(jié)構(gòu)。在6周的時(shí)間內(nèi)對(duì)小鼠傷口面積進(jìn)行評(píng)估,發(fā)現(xiàn)與未接受皮膚打印的小鼠相比,傷口愈合速度更快。將負(fù)載自體成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的水凝膠載體孵育在豬的切除性傷口,促進(jìn)了傷口快速閉合、增加收縮并加速了再上皮化大規(guī)模的發(fā)展[32]。應(yīng)用擠出式3D打印技術(shù)構(gòu)造的皮膚構(gòu)建物在形態(tài)和功能上與人體皮膚組織相似,為再生醫(yī)學(xué)移植探索了新的方法[32]。

2.3 激光輔助式生物打印皮膚

激光輔助生物打印能夠?qū)⒒罴?xì)胞按照預(yù)設(shè)計(jì)的模式排列,實(shí)現(xiàn)功能性皮膚構(gòu)建物的體外制造[33]。Koch等利用激光輔助生物打印實(shí)現(xiàn)成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和人源間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cell,hMSC )的有序排列,實(shí)現(xiàn)真皮組織打印。打印后幾天皮膚細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的存活率分別為98%±1%和90%±10%,保持其增殖能力。此外,皮膚細(xì)胞和hMSC顯示出細(xì)胞凋亡或DNA斷裂的增加,且細(xì)胞表型不變[34,35]。此發(fā)現(xiàn)可能會(huì)制造出更仿生的皮膚替代物改善糖尿病或燒傷病人的損傷。Koch等還利用激光輔助生物打印將成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞和膠原蛋白材料,構(gòu)造打印形成仿真的表皮皮膚模型,細(xì)胞之間處于分層狀態(tài)且不易發(fā)生混合。打印后10 d,細(xì)胞定位和增殖分析發(fā)現(xiàn)在成纖維細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞之間形成了層黏連蛋白[36]。可見,激光式生物打印技術(shù)為產(chǎn)生具有完整血管網(wǎng)絡(luò)的組織提供了巨大的潛力,激光輔助生物打印技術(shù)甚至可能實(shí)現(xiàn)打印完整器官的長(zhǎng)期目標(biāo)。

2.4 立體光刻式生物打印皮膚

立體光刻式生物打印進(jìn)行皮膚組織打印的研究少,更多應(yīng)用于打印微針陣列,用于胰島素經(jīng)皮給藥[37]。Economidou等利用立體光刻打印光聚合樹脂連續(xù)聚合形成微針,通過噴墨打印在針的表面形成了薄層胰島素和糖醇或二糖載體。打印工藝的優(yōu)化使得3D打印微針的透皮能力優(yōu)于金屬陣列,最小的作用力變化范圍在2～5 N。并且與皮下注射相比,胰島素包被3D打印陣列顯示出顯著的穩(wěn)態(tài)降糖效果,促進(jìn)了血中胰島素濃度的迅速增加,血漿中葡萄糖水平迅速下降。胰島素作用快,低血糖控制良好,在60 min內(nèi)血糖水平降低,且穩(wěn)定血糖超過4 h[38]。立體光刻打印技術(shù)精準(zhǔn)打印的結(jié)構(gòu)微針被視為皮下注射針優(yōu)良的微創(chuàng)替代物,它可以穿過皮膚角質(zhì)層但不會(huì)對(duì)表皮下區(qū)的神經(jīng)末梢造成干擾,因此不會(huì)引起疼痛。Yadav等利用微立體光刻打印技術(shù),構(gòu)建了平均長(zhǎng)度、寬度和厚度分別為13.05±0.11 mm、13.07±0.15 mm和3.50±0.05 mm微針陣列,實(shí)現(xiàn)了利福平的透皮遞送,在移除微針陣列后穿透痕跡在45內(nèi)完全消失[39]。微立體光刻生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用是一個(gè)有吸引力的制造技術(shù),尤其是對(duì)微米尺寸制造,是一種潛在的治療皮膚癌的方法。4種生物3D打印方式在再生組織醫(yī)學(xué)的研究具有前景(見Fig.1)。

Fig.1 Summary of four 3D bioprinting approaches. (A) Principle of inkjet bioprinting. (B) Principle of extrusion-based bioprinting. (C) Principle of laser-assisted bioprinting. (D) Principle of stereolithography bioprinting

2.5 便攜式3D打印機(jī)

隨著3D打印技術(shù)的發(fā)展,手持式皮膚打印機(jī)的出現(xiàn)使傷口部位的皮膚組織原位修復(fù)成為可能。Hakimi等人的杰出工作代表了便攜式3D生物打印機(jī)的發(fā)展(重量< 0.8 kg),在體外,他們發(fā)現(xiàn)包埋在纖維蛋白基質(zhì)中的人真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)10天后的存活率為90%。在體內(nèi),使用微流控打印機(jī)對(duì)皮膚組織進(jìn)行了原位生物打印。研究表明,在直徑8 mm的小鼠切除傷口上原位形成了生物聚合物纖維陣列,同時(shí)沉積在彎曲和柔順的傷口表面上。沉積的條紋片狀或條紋陣列牢固地附著在傷口上,并周期性地跟隨呼吸周期或人工組織變形。皮膚的原位形成是使用生物墨水中的特異性皮膚細(xì)胞直接治療的結(jié)果[5,40]。這種便攜式3D打印機(jī)在目前的醫(yī)療保健市場(chǎng)是革命性的創(chuàng)新,因?yàn)椴∪瞬槐氐却龑?shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的細(xì)胞再進(jìn)行皮膚移植。另外,該技術(shù)也用于燒傷或外傷等緊急情況,并在救護(hù)車上進(jìn)行實(shí)時(shí)治療。一般來說,傷口敷料根據(jù)其在傷口愈合中的作用分為被動(dòng)敷料和主動(dòng)敷料。理想的創(chuàng)傷敷料不僅要保護(hù)創(chuàng)面不受微生物感染,允許氣體交換,吸收多余的滲出物,還要保持濕潤(rùn)的環(huán)境,促進(jìn)上皮的再生。近年來,電紡納米纖維聚合物已顯示出作為傷口愈合敷料的巨大潛力[5,9]。Dong等首次提出一種抗菌且生物相容的誘導(dǎo)型聚集排放物(aggregation-induced emission,AIE)的納米纖維敷料,通過人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞在納米纖維敷料上粘附牢固并且復(fù)制能力增強(qiáng)。同時(shí)他們利用手持式靜電紡絲裝置完成了AIE納米纖維敷料的原位沉積,電紡后在對(duì)其基本性能如表面形貌、結(jié)構(gòu)、熱穩(wěn)定性和疏水性進(jìn)行表征發(fā)現(xiàn)AIE納米纖維敷料對(duì)沙門氏菌具有高效的抗菌活性,在皮膚傷口模型的體內(nèi)研究中,沉積的AIE納米纖維敷料能夠消除多藥耐藥細(xì)菌感染并促進(jìn)傷口愈合[41]。這種個(gè)性化納米纖維敷料經(jīng)濟(jì)、耐用可以無痛去除,還能防止細(xì)菌滲透。電紡個(gè)性化敷料是一個(gè)理想的和安全的解決方案,滿足傷口治療的臨床需要。

3 皮膚種子細(xì)胞的來源

為了構(gòu)建仿生的皮膚模型,細(xì)胞的選擇是非常重要的環(huán)節(jié),皮膚干細(xì)胞是三維皮膚模型和皮膚再生的首選細(xì)胞來源,其以自我更新和多向分化能力,易于收集和免疫原性弱的特點(diǎn),在皮膚重建中得到了廣泛應(yīng)用。

3.1 間充質(zhì)干細(xì)胞

間充質(zhì)干細(xì)胞如骨髓來源的MSCs(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs)和脂肪來源的干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, Ad-MSCs)已被廣泛研究用于燒傷的創(chuàng)面修復(fù)和瘢痕緩解。多項(xiàng)研究表明,MSCs通過分泌獨(dú)特的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子促進(jìn)血管生成和加速傷口愈合,通過抑制肌成纖維細(xì)胞活動(dòng)和減少膠原沉積,進(jìn)而減少增生性瘢痕[42,43]。Bian團(tuán)隊(duì)利用高糖誘導(dǎo)創(chuàng)建了人類真皮衰老模型,并發(fā)現(xiàn)來源于子宮蛻膜的間充質(zhì)干細(xì)胞(decidua-derived mesenchymal stem cells, dMSC)形成的小細(xì)胞囊泡(small extracellular vesicles,sEVs)不僅能顯著促進(jìn)人類真皮成纖維的增殖、遷移和分化,還能改善其衰老狀態(tài)。此外,體內(nèi)發(fā)現(xiàn)dMSC-sEVs局部應(yīng)用加速膠原沉積,促進(jìn)糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合[44]。同年,Yao等利用擠出式生物打印創(chuàng)建了汗腺(sweat gland,SG)樣基質(zhì),介導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為功能性的汗腺,并促進(jìn)了小鼠SG的恢復(fù)[45]。Ge團(tuán)隊(duì)從miR-132基因過表達(dá)的脂肪干細(xì)胞(miR-132-overexpressing adipose stem cells,miR-132-exo)中獲取工程外泌體,在體外,證實(shí)了其對(duì)HUVECs的增值和遷移的促進(jìn)作用,在體內(nèi),基于核因子KB蛋白信號(hào)通路介導(dǎo)的miR-132-exo可以有效減輕炎癥反應(yīng),顯著提高皮瓣存活率,促進(jìn)糖尿病創(chuàng)傷的愈合?？梢?間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)成為一種有潛力的治療皮膚損傷的的來源種子[46]。間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)三維打印基質(zhì)包封后,可提供一個(gè)仿生的微環(huán)境,促使細(xì)胞分化為組織所需的細(xì)胞,使其具備再生醫(yī)學(xué)的重要應(yīng)用價(jià)值。

3.2 毛囊干細(xì)胞

新毛囊是由位于毛囊突起區(qū)的毛囊干細(xì)胞及其繼發(fā)胚芽中的子代驅(qū)動(dòng)再生的,組織依靠干細(xì)胞來維持自身平衡和修復(fù)傷口[47]。Gur-Cohen等發(fā)現(xiàn)在適當(dāng)?shù)拇碳は蚂o息態(tài)的毛囊干細(xì)胞可以被激活,驅(qū)動(dòng)生長(zhǎng)期開始,并開始一個(gè)新的毛發(fā)周期。在皮膚中,淋巴毛細(xì)血管作為關(guān)鍵的干細(xì)胞生態(tài)成分可以在干細(xì)胞周圍形成密集網(wǎng)絡(luò)[48]。并有研究表明Wnt信號(hào)通路對(duì)毛囊干細(xì)胞的維持、激活和分化具有重要作用,其失調(diào)將導(dǎo)致毛囊干細(xì)胞失去干性或不能被正常激活。Xu等通過在裸鼠傷口原位生物打印表皮干細(xì)胞(epidermal stem cells,Epi-SCs)和皮膚多能干細(xì)胞(skin-derived precursors,SKPs)促進(jìn)了毛囊的再生過程,4周,成功觀察到表皮、真皮、血管和皮脂腺的形成。此外,研究發(fā)現(xiàn)打印后的表皮干細(xì)胞和皮膚多能干細(xì)胞依然分別表達(dá)高水平的CD49f基因和BMP6基因,證實(shí)了原位打印細(xì)胞依舊保持高的細(xì)胞活力和增殖能力[49]。Abaci團(tuán)隊(duì)通過使用3D打印再現(xiàn)毛囊微環(huán)境,演示了在人類皮膚構(gòu)建物中生成人類毛囊的仿生方法。另外,Lef-1基因在真皮乳頭細(xì)胞(dermal papilla cells,DPCs)中的過表達(dá)顯著提高了人類皮膚構(gòu)建物中毛囊分化的效率。此外,在移植前對(duì)有毛的皮膚構(gòu)建物進(jìn)行血管化,使免疫缺陷小鼠的毛發(fā)有效生長(zhǎng)[50]。從培養(yǎng)的人類細(xì)胞中再生整個(gè)毛囊的能力將對(duì)不同類型的脫發(fā)和慢性傷口的醫(yī)療管理產(chǎn)生革命性的影響,這迎合了現(xiàn)階段皮膚損傷修復(fù)領(lǐng)域迫切的醫(yī)療需求。

3.3 多能干細(xì)胞(iPSCs)

iPSCs的研究是再生醫(yī)學(xué)的重大突破,特異性iPSC的建立為在培養(yǎng)系統(tǒng)中模擬生理和病理模型創(chuàng)造了機(jī)會(huì),并有可能迅速促進(jìn)藥物的發(fā)現(xiàn)。iPSCs是一類具有自我更新和分化功能的細(xì)胞,在皮膚細(xì)胞的分化中得到廣泛的應(yīng)用[51]。Abaci團(tuán)隊(duì)利用iPSC來源的內(nèi)皮細(xì)胞在3D打印技術(shù)下構(gòu)建了灌注的血管網(wǎng)絡(luò),并證實(shí)帶血管化的人體皮膚移植物可以形成強(qiáng)健的表皮和建立內(nèi)皮屏障,從而允許藥物的局部和全身遞送的再現(xiàn)[52]。同樣,iPSC不僅可以分化為內(nèi)皮細(xì)胞,還可以分化出皮膚附屬器其他細(xì)胞包括黑色素細(xì)胞[53]、神經(jīng)細(xì)胞和施萬細(xì)胞[54]。為了建立一個(gè)受神經(jīng)支配的組織工程皮膚模型,Muller等利用iPSCs分化成感覺神經(jīng)元和施萬細(xì)胞構(gòu)建了工程皮膚組織,施萬細(xì)胞是神經(jīng)元功能和軸突遷移的主要細(xì)胞,當(dāng)受到誘導(dǎo)神經(jīng)肽刺激時(shí),來自iPSCs的神經(jīng)元釋放P物質(zhì)和降鈣素基因相關(guān)的肽。這種獨(dú)特的人體神經(jīng)細(xì)胞模型對(duì)于皮膚神經(jīng)炎癥的研究非常有用[54]。同時(shí),臍帶血單個(gè)核細(xì)胞(cord blood mononuclear cells,CBMCs)已成為再生醫(yī)學(xué)的潛在細(xì)胞來源。Kim等利用CBMCs-iPSCs分化而成的角化形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞發(fā)育成表皮層和真皮層。將表皮層疊加于真皮層上,形成復(fù)雜的三維皮膚類器官,該類器官移植入皮膚受損的小鼠模型中,改善了皮膚損傷[55]。iPSCs是很有吸引力的候選細(xì)胞,因?yàn)樗鼈兂嗽趥惱砩媳唤邮芡?還可以分化成任何所需要的細(xì)胞。在重編程過程中,它們是根據(jù)患者的基因定制的,干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展可能有助于為皮膚打印提供合適的細(xì)胞源替代品,根據(jù)種子細(xì)胞的來源及其病理性作用見Table 1。

Table 1 Stem cell types and differentiated skin cell types and roles

4 3D生物打印與相關(guān)的下游應(yīng)用

生物3D打印能夠很大程度重建天然皮膚的宏觀結(jié)構(gòu)和微觀特征,保障了高仿生皮膚制備的可能性,為化妝品及藥物應(yīng)用、皮膚移植和仿生層次等下游應(yīng)用提供了條件。

4.1 化妝品及藥物應(yīng)用

Episkin?是法國(guó)歐萊雅旗下子公司Episkin體外重建的表皮模型,是用人膠原I型蛋白 和膠原III 型蛋白做底部基質(zhì)支架,然后在其上涂一層膠原IV型蛋白,干燥后形成IV膠原的薄膜,將人正常角質(zhì)細(xì)胞接種到覆有IV型膠原的支架上,經(jīng)過13的氣液相培養(yǎng)形成一種類似人表皮的具有分層結(jié)構(gòu)的體外重建表皮模型[56]。EpiSkin?模型不僅可以作為表皮替代物,還在化妝品領(lǐng)域內(nèi)可用于透皮吸收分析、皮膚腐蝕性驗(yàn)證、皮膚刺激性分析、光毒性分析UV暴露及保護(hù)分析[56,57]。SkinEthic?模型同樣可進(jìn)行形態(tài)學(xué)的分析,培養(yǎng)基中細(xì)胞因子,炎癥因子等水平檢測(cè)及基因方面的分析,相較于 Episkin?模型其優(yōu)勢(shì)在于使用化學(xué)限定培養(yǎng)基培養(yǎng),與血清培養(yǎng)基相比,培養(yǎng)基中各組成成分及濃度都是確定的,有利于表達(dá)通路中某些特定上調(diào)或下調(diào)的因子。作為表皮替代物,在化妝品領(lǐng)域內(nèi)可用于透皮吸收分析、皮膚刺激性分析、皮膚致敏性分析、光毒性分析、UV暴露及保護(hù)分析美白/美黑作用分析[57,58]。此外,Strat-M?模型也是一種模擬人體皮膚多層結(jié)構(gòu)的合成膜替代品,在體外滲透中,其優(yōu)異的多孔結(jié)構(gòu)和疏水性再現(xiàn)了皮膚的擴(kuò)散屏障機(jī)制,在不含滲透增強(qiáng)劑的制劑中,間苯二酚的穩(wěn)態(tài)通量對(duì)于水溶液為42±5 μg/cm2h,水凝膠為42±6 μg/cm2h,以及水包油乳液為40±6 μg/cm2h,這更接近于離體皮膚(5±3、9±2、13±6 μg/cm2h)的滲透指標(biāo)。Strat-M?模型作為一種可靠的人類皮膚替代品在化妝品研發(fā)過程用作快速篩選潛在親水活性分子的高效益工具[59]。

4.2 皮膚移植應(yīng)用

含有異體細(xì)胞的多層皮膚替代物已被用于治療非愈合性皮膚潰瘍。Xie等利用3D生物打印制作了植入的多層血管化皮膚移植物。該移植物使用的生物墨水含有人包皮纖維細(xì)胞、臍帶血人內(nèi)皮細(xì)胞和人類胎盤周細(xì)胞,并將這些細(xì)胞懸浮在鼠尾I型膠原上來形成一層真皮。第二層生物墨水含有人類包皮角質(zhì)細(xì)胞來形成表皮。當(dāng)這些3D打印的移植物被移植到免疫缺陷小鼠的背側(cè)時(shí),人的內(nèi)皮細(xì)胞與小鼠創(chuàng)面上的微血管相融合,并促進(jìn)了表皮網(wǎng)的形成,促進(jìn)了傷口的修復(fù)和愈合[60,61]。Dai等利用人成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞和明膠建立了皮膚真皮層結(jié)構(gòu),利用聚氨酯和角質(zhì)形成細(xì)胞作為生物墨水,形成皮膚表皮結(jié)構(gòu)。當(dāng)植入體內(nèi)時(shí),雙層皮膚構(gòu)建物在裸鼠模型中,28天后達(dá)到90%的傷口愈合率,并且有76%的表皮層出現(xiàn)上皮化[62]。在使用基質(zhì)蛋白或異種來源的成分生產(chǎn)出的皮膚替代品中,較高的過敏反應(yīng)免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)一直是皮膚移植領(lǐng)域中的難點(diǎn)。Baltazar 團(tuán)隊(duì)利用生物打印的皮膚替代品成功實(shí)現(xiàn)了人內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的無異源分離、擴(kuò)增和冷凍保存。含有人膠原蛋白質(zhì)和纖連蛋白質(zhì)的無異源生物墨水經(jīng)過分層在接種到人角質(zhì)形成細(xì)胞以形成表皮層。這一雙層皮膚移植物的制造,為皮膚組織工程的無異種移植提供了可行性[63]。在皮膚移植領(lǐng)域,皮膚的軟組織和分層結(jié)構(gòu)使其較其它生物材料的沉積更為容易,3D打印技術(shù)能夠?yàn)榛颊咛峁└佣ㄖ苹蜕锵嗳菪缘囊浦财つw。通過構(gòu)建與患者本身相匹配的組織,移植的成功率和效果得以顯著提升。這對(duì)于燒傷患者、先天性皮膚病患者以及其他需要皮膚移植的患者來說是一項(xiàng)重大的醫(yī)學(xué)進(jìn)步。

4.3 皮膚附屬器的應(yīng)用

3D生物打印含有色素、毛囊、神經(jīng)和汗腺的皮膚模型,為藥物開發(fā)、化妝品測(cè)試、生理或病理模型和皮膚移植開創(chuàng)新的策略。色素沉著皮膚模型可以通過3D打印黑素細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)。Min等利用3D打印技術(shù)成功構(gòu)建了含有色素沉著的皮膚模型。利用包括成纖維細(xì)胞的膠原水凝膠構(gòu)建真皮層,將黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞打印到真皮層的頂端進(jìn)行培養(yǎng)誘導(dǎo)色素沉著,在表皮層和真皮連接處觀察到雀斑樣的色素形成[64]。利用3D打印技術(shù)結(jié)合干細(xì)胞培養(yǎng),實(shí)現(xiàn)人工皮膚更加真實(shí)的外觀。生發(fā)研究員、頭發(fā)修復(fù)外科醫(yī)生以及制藥和化妝品行業(yè)對(duì)3D技術(shù)的應(yīng)用將對(duì)含有毛囊的人體皮膚組織維護(hù)和再生產(chǎn)生重大影響[49];Motter Catarino團(tuán)隊(duì)在含有成纖維細(xì)胞的預(yù)凝膠真皮層中印刷DPCs和HUVECs誘導(dǎo)的球狀體,并結(jié)合角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞的遷移條件,成功在成熟組織中發(fā)育毛囊樣結(jié)構(gòu),其形態(tài)和組成與天然皮膚組織基本一致,作為毛發(fā)的移植模型用來測(cè)試化妝品的安全性,這對(duì)再生醫(yī)學(xué)的研究無疑會(huì)產(chǎn)生巨大的推動(dòng)性[65]。針對(duì)含有神經(jīng)細(xì)胞特定疾病皮膚模型,并分析這些模型在瞬時(shí)受體電位陽離子通道A1激動(dòng)劑刺激下,神經(jīng)肽釋放后感覺神經(jīng)的潛在影響。這種模型特別適合于銀屑病的建模,以探明由皮膚神經(jīng)支配調(diào)節(jié)的疾病發(fā)生機(jī)制,且這種免疫功能皮膚模型具有很強(qiáng)的個(gè)性化藥物治療潛力[54];擠出式生物打印技術(shù)已被應(yīng)用在構(gòu)建來自iPSCs的皮質(zhì)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)前體產(chǎn)生的神經(jīng)構(gòu)建體,經(jīng)過進(jìn)一步分化,表達(dá)了神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物,這為 3D生物打印構(gòu)建更為復(fù)雜的人類神經(jīng)系統(tǒng)奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)[66]。此外,胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)是SG再生的種子細(xì)胞,鑒于細(xì)胞外基質(zhì)中的真皮成分和生長(zhǎng)因子對(duì)于上皮胚胎干細(xì)胞命運(yùn)發(fā)揮著重要作用,將ESCs和表皮生長(zhǎng)因子同時(shí)加入到明膠和海藻酸鈉的混合物中制成生物墨水,打印并構(gòu)建體外生態(tài)模型培養(yǎng)14 h后成功觀察到SG細(xì)胞,依靠生物材料支架為細(xì)胞分化提供結(jié)構(gòu)空間和附著位點(diǎn),能夠準(zhǔn)確誘導(dǎo)細(xì)胞定向分化以實(shí)現(xiàn)SG細(xì)胞的增殖[45,67]。這對(duì)于基于干細(xì)胞的3D打印在臨床應(yīng)用和治療中是有價(jià)值的。

5 問題與展望

3D生物打印具有高分辨率、操作靈活、可重復(fù)打印高通量輸出等優(yōu)點(diǎn)。然而,所有的技術(shù),包括3D生物打印,都受到一定的限制和挑戰(zhàn)。首先,3D皮膚模型代表了一種全層結(jié)構(gòu),缺乏免疫細(xì)胞、血管分布、神經(jīng)和汗腺。盡管3D生物打印皮膚有部分臨床成功的,但患者和臨床醫(yī)生越來越多的要求解決現(xiàn)有的局限性,如改善表面感覺和再生[1]。在3D打印皮膚誘導(dǎo)的新組織形成過程中,神經(jīng)再生依賴于新形成的血管。由于缺乏血液供應(yīng),神經(jīng)再生幾乎被完全抑制[1,61]。其次,在生物墨水中仍存在一些關(guān)鍵的技術(shù)問題需要解決:(1)人體皮膚具有獨(dú)特的物理力學(xué)特性,這對(duì)于與皮膚組織特征相對(duì)應(yīng)的生物材料要求很高。(2)所選的打印材料必須與3D打印材料相兼容,由于這些材料在打印后的收縮或強(qiáng)度下降,它們不能滿足3D生物打印的使用要求。(3)三維生物打印水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度不足,壓縮后的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性保持困難。因此,確定一種優(yōu)越的凝膠方法,在不影響細(xì)胞活力的情況下快速穩(wěn)定的預(yù)凝膠溶液是很重要的[68]。另外,3D生物打印需要在打印階段進(jìn)行優(yōu)化,[8]。最后,種子細(xì)胞也是三維生物打印技術(shù)中需要考慮的一個(gè)重要方面。干細(xì)胞作為組織工程種子細(xì)胞的重要來源,已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。近年的研究表明,干細(xì)胞可以在促進(jìn)皮膚附屬物再生、傷口愈合和組織重建方面發(fā)揮重要作用。干細(xì)胞在TES領(lǐng)域具有巨大的潛力,但倫理問題、成本和技術(shù)要求阻礙了干細(xì)胞的充分利用[68,69]。

三維生物打印技術(shù)在組織修復(fù)和再生領(lǐng)域的應(yīng)用仍是可行的。施旺細(xì)胞作為皮膚感覺神經(jīng)再生的關(guān)鍵細(xì)胞成分,在體外可以添加到3D打印支架中,是3D打印皮膚感覺神經(jīng)再生的良好方法。在未來,可以考慮在TGS中加入施旺細(xì)胞,以促進(jìn)神經(jīng)纖維的定向生長(zhǎng),增殖和聚集形成類似于“神經(jīng)導(dǎo)管”的管狀結(jié)構(gòu),促進(jìn)神經(jīng)再生[1]。另外,3D生物打印的研究現(xiàn)狀表明,一種理想的生物墨水仍有待確定。在未來,生物墨水的材料組成可以進(jìn)一步優(yōu)化,如通過引入納米材料,以提高組織或器官的再生。此外,隨著皮膚老化模型,細(xì)胞衰老的概念仍在研究中,對(duì)于再現(xiàn)與年齡相關(guān)的皮膚模型至關(guān)重要。這兩個(gè)領(lǐng)域都相對(duì)較新,在獲得最優(yōu)模型之前需要進(jìn)一步的研究。到目前為止,該領(lǐng)域的研究表明,3D生物打印將允許精確地放置所有各種類型的天然皮膚細(xì)胞,并精確地并可重復(fù)地制造結(jié)構(gòu)來替代受傷皮膚。然而,復(fù)制天然皮膚的結(jié)構(gòu)完整性和功能,以允許傷口修復(fù)、溫度控制和感覺有待實(shí)現(xiàn)。隨著相關(guān)技術(shù)的進(jìn)步和多學(xué)科合作的探索,三維生物打印有望克服這些障礙,在生物工程和皮膚仿生學(xué)中發(fā)揮重要作用。