miR-485-5p靶向氧連接的N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲

胡東來, 趙梓岐, 李 元, 楊 麗, 雷艷麗, 楚元奎, 3)*

(1)寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)系, 銀川 750004;2)寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院科研平臺(tái), 銀川 750004;3)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心, 銀川 750004)

前列腺癌是男性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤[1],雄激素剝奪療法是轉(zhuǎn)移性病例的主要治療方法之一,然而,有相當(dāng)一部分接受雄激素剝奪療法治療的患者最終卻進(jìn)展為更為惡性的去勢(shì)抵抗性前列腺癌[2]。因此,探索前列腺癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機(jī)制和尋找潛在的治療靶點(diǎn)是目前亟待解決的問題之一。

微RNA(microRNAs,miRNAs)是長(zhǎng)度約為21～24核苷酸的非編碼RNA分子,其主要功能是通過靶向信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄物來調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞的生物學(xué)過程[3]。研究表明,miR-485-5p通過靶向原癌基因酪氨酸蛋白激酶(Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src , SRC)在體內(nèi)外抑制卵巢癌的進(jìn)展[4]、通過靶向跨膜糖蛋白Mucin 1 (Transmembrane glycoprotein Mucin 1 , MUC1)抑制乳腺癌的進(jìn)展[5],以及通過負(fù)向調(diào)控角蛋白17 (Keratin 17, KRT17)抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展[6]。然而,miR-485-5p在前列腺癌中發(fā)揮的作用鮮有報(bào)道。因此,明確miR-485-5p在前列腺癌中所發(fā)揮的作用與機(jī)制,有助于了解前列腺癌發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在原因。

氧連接的N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(O-linked N-acetylglucosamine transferase, OGT)屬于多糖轉(zhuǎn)移酶家族,在碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)中被分類為糖基轉(zhuǎn)移酶41家族的成員[7],已報(bào)道OGT與癌癥特異性細(xì)胞死亡之間存在顯著相關(guān)性[8, 9]。由于其是細(xì)胞增殖所必需的,但細(xì)胞在有絲分裂后在無它的情況下也能存活,這使得該酶成為典型的癌癥靶標(biāo)[10]。OGT是一種參與癌細(xì)胞中氧非依賴性葡萄糖和谷氨酰胺消耗的酶,通過原癌基因MYC調(diào)節(jié)有絲分裂細(xì)胞代謝的相互作用而發(fā)展雄激素非依賴性前列腺癌,并在侵襲性前列腺癌中最常高表達(dá)[11]。先前的研究證實(shí),在食管癌中,miR-485-5p通過靶向OGT抑制食管癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲[12],但miR-485-5p/OGT軸在前列腺癌中發(fā)揮的作用尚未報(bào)道,有待進(jìn)一步研究。

鑒于此,本文旨在探究miR-485-5p是否靶向調(diào)控OGT從而影響前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲,明確miR-485-5p/OGT軸在前列腺癌進(jìn)展中所發(fā)揮的作用,以期為前列腺癌的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 前列腺癌細(xì)胞系PC3、DU145、LNCaP、22Rv1及正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1均來源于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)(上海)。

1.1.2 RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基(上海源培生物科技股份有限公司);特級(jí)胎牛血清(BI,以色列);LipofectamineTM2000(Invitrogen公司,美國(guó));miR-485-5p mimics與inhibitor、mimics NC、 inhibitor NC、si-OGT、si-NC、含miR-485-5p結(jié)合位點(diǎn)的Wt-OGT和Mut-OGT熒光素酶表達(dá)載體(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司);mimics、inhibitor、si-OGT、及各NC序列詳見Table 1;TRNzol Universal總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司);雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒(北京全式金生物生物技術(shù)股份有限公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司);引物(上海生工生物工程股份有限公司)。GAPDH抗體(Proteintech公司;美國(guó));OGT抗體(immunoway公司,美國(guó));山羊抗兔 IgG-HRP、山羊抗鼠 IgG-HRP(Proteintech 公司,美國(guó));全蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)。

Table 1 Sequence

1.1.3 CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific,美國(guó));倒置熒光顯微鏡(Olympus Corporation,日本);熒光定量PCR儀(Applied Biosystems ,美國(guó));化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(GE通用電氣,美國(guó));電泳儀(Bio-rad,美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 DU145、PC3、LNCaP細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基、22Rv1細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、RWPE-1細(xì)胞用前列腺正常上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng),置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔天換液,待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)90%左右時(shí)進(jìn)行傳代。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化、重懸后接種在六孔板中用于轉(zhuǎn)染。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)到50%～70%時(shí),參考LipofectamineTM2000試劑說明書,分別將miR-485-5p mimics及inhibitor、si-OGT及對(duì)應(yīng)NC轉(zhuǎn)染到PC3和DU145細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染終濃度為50 nmol/L,培養(yǎng)24 h～48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染48 h后的PC3和DU145細(xì)胞,消化后重懸成單個(gè)細(xì)胞懸液,于12孔板中鋪板,再放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),每3 d換液1次,培養(yǎng)9～14 d。PBS潤(rùn)洗細(xì)胞,用4%多聚甲醛進(jìn)行固定,再用0.1%結(jié)晶紫水溶液染色,PBS潤(rùn)洗細(xì)胞,自然風(fēng)干后計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)量,并計(jì)算克隆形成率。

1.2.3 劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 用0.25%胰蛋白酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC3和DU145細(xì)胞,細(xì)胞重懸后,以3×105個(gè)/孔細(xì)胞數(shù)量鋪于六孔板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)50%～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用1 mL吸頭進(jìn)行劃痕,PBS洗去漂浮的細(xì)胞,分別在0 h、24 h拍照,記錄劃痕的寬度并計(jì)算細(xì)胞遷移率。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn) 以無血清培養(yǎng)基1∶8稀釋Matrigel基質(zhì)膠,侵襲實(shí)驗(yàn)組每個(gè)小室中垂直加入60 μL稀釋好的基質(zhì)膠,室溫靜置使基質(zhì)膠充分凝固,遷移實(shí)驗(yàn)組的小室不鋪膠。收集分組轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞,即胰酶消化,用無血清培養(yǎng)基重懸,并接種在上室中,保持上室終體積為200 μL,下室加入700 μL含20%血清的完全培養(yǎng)基,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用4%多聚甲醛進(jìn)行固定以及0.1%結(jié)晶紫水溶液加以染色、PBS潤(rùn)洗、棉簽輕輕擦去小室底部上層細(xì)胞,室溫風(fēng)干,顯微鏡下拍小室底部下層的細(xì)胞圖片,imageJ軟件計(jì)數(shù)遷移與侵襲的細(xì)胞數(shù)量,分別計(jì)算遷移率和侵襲率,遷移率=[(遷移的細(xì)胞數(shù))/(接種的細(xì)胞數(shù))]×100%,侵襲率=[(侵襲的細(xì)胞數(shù))/(接種的細(xì)胞數(shù))]×100%。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建含miR-485-5p結(jié)合位點(diǎn)的Wt-OGT和Mut-OGT熒光素酶表達(dá)載體(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞進(jìn)行鋪板,將miR-485-5p mimics、 mimics nc、Wt-OGT、Mut-OGT分組共轉(zhuǎn)染,24 h后收集細(xì)胞樣品,具體參考TransDetect?Double-Luciferase Reporter Assay Kit 試劑盒(北京全式金生物生物技術(shù)股份有限公司)說明書進(jìn)行熒光素酶活性的檢測(cè)。

1.2.6 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn) Trizol 法提取各組總RNA,測(cè)濃度和純度,確保濃度和純度達(dá)標(biāo)后,按照HiScript II Q RT SuperMix for qPCR和 ChamQ SYBR qPCR master Mix 試劑盒說明書(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR檢測(cè),引物序列詳見Table 2。反應(yīng)條件:95 ℃、5 min,95 ℃、15 s,58 ℃、15 s,72 ℃、15 s,設(shè)40個(gè)循環(huán),以GAPDH、U6作為內(nèi)參,2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

Table 2 Primer sequence of qRT-PCR

1.2.7 Western 印跡實(shí)驗(yàn) 各組細(xì)胞培養(yǎng) 48 h后,提取細(xì)胞總蛋白質(zhì),BCA法測(cè)其濃度,取20～30 μg蛋白質(zhì)上樣,SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質(zhì)后,轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,用5% 脫脂牛奶于室溫?fù)u床封閉2～3 h,PBST每次10 min漂洗3次后,加入相應(yīng)一抗,4 ℃孵育過夜,回收一抗,PBST漂洗3次后,加入二抗,室溫孵育1 h,再次3次漂洗,加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯影,以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(means ±SD)方式表示,所有實(shí)驗(yàn)均生物學(xué)重復(fù)3次,采用SPSS.26及Graphad Prism 9.4.1 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用方差分析,以雙側(cè)P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-485-5p在前列腺癌中表達(dá)下調(diào)

借助dbDEMC網(wǎng)站 (biosino.org)現(xiàn)有數(shù)據(jù)集對(duì)前列腺癌中差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè),分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),與前列腺癌旁組織相比miR-485-5p在前列腺癌組織中低表達(dá)(P=1.16e-2,Fig.1A-B),并且經(jīng)查閱文獻(xiàn)得知,在前列腺癌中研究其表達(dá)、功能和作用機(jī)制的報(bào)道甚少,因此,選擇相對(duì)新穎的miR-485-5p分子作進(jìn)一步研究。通過qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-485-5p在前列腺正常上皮細(xì)胞與癌細(xì)胞系中的表達(dá)差異,結(jié)果顯示,與在前列腺正常上皮細(xì)胞RWPE-1中的表達(dá)量(1.00 ± 0.06)相比,miR-485-5p在PC3(0.35 ± 0.03)、DU145(0.38 ± 0.01)及LNCaP(0.42±0.05)細(xì)胞系中呈低表達(dá),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,Fig.1C),考慮到與LNCaP細(xì)胞相比,PC3和DU145細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖、遷移及侵襲能力,并且更能代表前列腺癌發(fā)展的晚期階段,因此,在接下來的探索方面選擇在PC3和DU145細(xì)胞中研究miR-485-5p的功能及相關(guān)調(diào)控機(jī)制。

Fig.1 The expression of miR-485-5p in prostate cancer tissue and cells (A-B) Heat map analysis of miR-485-5p was performed in the dbDEMC website and its expression in prostate cancer tissues was analyzed. (C) The expression of miR-485-5p in prostate cancer cell lines was detected by qRT-PCR.**P<0.01. n=3

2.2 miR-485-5p抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲

采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-485-5p在2種細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效果,在PC3細(xì)胞中,與mimics NC組 (1.00 ± 0.09) 相比,miR-485-5p mimics組表達(dá)量顯著上調(diào)(1.30 ± 0.07) ,在DU145細(xì)胞中,與mimics NC組(1.01 ± 0.12)相比,miR-485-5p mimics組表達(dá)量顯著上調(diào)( (16.08 ± 0.13),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05, Fig.2A-B)。通過平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-485-5p對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖能力的影響,結(jié)果顯示, PC3細(xì)胞中,與mimics NC組(100.00% ± 9.00%)相比,過表達(dá)miR-485-5p能夠顯著抑制PC3細(xì)胞的克隆形成率(59.33% ± 3.51%),DU145細(xì)胞中,與mimics NC組(100.30% ± 6.42%)相比,過表達(dá)miR-485-5p同樣能夠顯著抑制DU145細(xì)胞的克隆形成率(71.0% ± 8.54%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01, Fig.2C-E)。采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-485-5p對(duì)前列腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響,結(jié)果顯示,PC3細(xì)胞中,分別與遷移的mimics NC組(99.00% ± 8.54%)和侵襲的mimics NC組(100.00% ± 9.00%)相比,過表達(dá)miR-485-5p能夠顯著抑制PC3細(xì)胞的遷移率(59.33% ± 6.51%)和侵襲率(44.67% ± 4.51%),DU145細(xì)胞中,分別與遷移的mimics NC組(100.00% ± 5.00%)和侵襲的mimics NC組(100.30% ± 10.02%)相比,過表達(dá)miR-485-5p同樣能夠抑制DU145細(xì)胞的遷移率(40.67% ± 4.73%)和侵襲率(36.00% ± 4.58%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01, Fig.2F-I)。同時(shí),劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與PC3細(xì)胞的mimics NC組(100.0%±11.27%)相比,過表達(dá)miR-485-5p顯著抑制了PC3細(xì)胞的遷移率(54.67%±7.5%),與DU145細(xì)胞的mimics NC組(100.30% ±3.51%),過表達(dá)miR-485-5p同樣是抑制了DU145細(xì)胞的遷移率(44.33% ± 2.08%),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01, Fig.2J-L)。綜上所述,miR-485-5p抑制PC3和DU145細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲。

2.3 miR-485-5p靶向調(diào)控氧連接的N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶

通過TargetScan、PITA、miRmap、miRDB、microT及PicTar網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-485-5p的靶基因,Venn圖表明,OGT是這六款軟件共同預(yù)測(cè)的待選靶基因之一(Fig.3A)。隨后構(gòu)建OGT3′UTR的野生型和突變型雙熒光素酶報(bào)告載體,采用雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)驗(yàn)證miR-485-5p與OGT的靶向關(guān)系,結(jié)果顯示,與mimics NC組(1.0±0.08)相比,miR-485-5p mimics使得OGT3 ′UTR-Wt組的熒光素酶活性顯著降低(0.85 ± 0.30),而OGT3 ′UTR-Mut的熒光素酶活性無顯著變化(0.96 ± 0.06),即:正如預(yù)測(cè),兩者具有結(jié)合位點(diǎn)(P<0.05,Fig.3B-C)。接著本文通過Western 印跡檢測(cè)過表達(dá)miR-485-5p,OGT蛋白的表達(dá)量變化,結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-485-5p時(shí),OGT蛋白的表達(dá)量顯著下調(diào)(Fig.3D),同時(shí)采取qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)過表達(dá)miR-485-5p后OGTmRNA的表達(dá)量變化,與mimics NC組(1.00 ± 0.19)相比,過表達(dá)miR-485-5p后,OGTmRNA表達(dá)量顯著下調(diào)(0.39 ± 0.01),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,Fig.3E)。上述結(jié)果表明,miR-485-5p能夠與OGT靶向特異性結(jié)合,OGT是miR-485-5p的直接靶標(biāo)。

2.4 氧連接的N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶在前列腺癌中表達(dá)上調(diào)

借助GEDS(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/web/GEDS/)網(wǎng)站分析OGT在多種腫瘤中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,其在前列腺癌、肺癌和肝癌等癌組織中高表達(dá)(Fig.4A)。利用GEPIA網(wǎng)站 (Gene Expression Profiling Interactive Analysis) (cancer-pku.cn)來分析OGT在前列腺癌組織中的表達(dá),結(jié)果顯示,與前列腺正常組織相比,OGT在癌組織中高表達(dá)(P<0.01,Fig.4B )。隨后,采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)OGT在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá),與在前列腺正常上皮細(xì)胞RWPE-1中的表達(dá)量(1.01 ± 0.14)相比,OGT在PC3(19.10 ± 0.08)、DU145(3.89 ± 0.23)、LNCaP(19.17 ± 0.32)、22Rv1(3.55 ± 0.12)4種癌細(xì)胞系中均高表達(dá)(P<0.01,Fig.4C),提示其可能在前列腺癌的進(jìn)展中發(fā)揮促癌作用。

Fig.4 The expression of OGT in prostate cancer tissues and cells (A) The expression of OGT in tissues in various tumors was analyzed using the GEDS website. (B) The expression of OGT was analyzed in prostate cancer tissues via GEPIA website. **P<0.01. (C) The expression of OGT in prostate cancer cell lines was detected by qRT- PCR,**P<0.01, n=3

2.5 氧連接的N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲

采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)OGT在 mRNA水平的干擾效果,在PC3細(xì)胞中,與si-NC組(1.00 ± 0.10)相比,si-OGT-1的mRNA表達(dá)量下降至(0.26 ± 0.03),si-OGT-2的mRNA表達(dá)量下降至(0.36 ± 0.02),在DU145細(xì)胞中,與si-NC組相比(1.00 ± 0.03),si-OGT-1的mRNA表達(dá)量下降至(0.25 ± 0.01),si-OGT-2的mRNA表達(dá)量下降至(0.46 ± 0.07),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig.5A,P<0.01 )。采用Western印跡檢測(cè)OGT在蛋白質(zhì)水平的干擾效果,干擾OGT后,其蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著下降(Fig.5B ),選擇si-OGT-1用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾OGT對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果顯示,PC3細(xì)胞中,與si-NC組(100.00% ± 7.94%)相比,干擾OGT能夠顯著抑制PC3細(xì)胞的克隆形成率(64.67% ± 6.51%),DU145細(xì)胞中,與si-NC組(100.30% ± 9.07%)相比,干擾OGT同樣能夠抑制DU145細(xì)胞的克隆形成率(50.67% ± 7.37%),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig.5C-D,P<0.01)。同時(shí),通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾OGT對(duì)前列腺癌細(xì)胞遷移與侵襲的影響,結(jié)果顯示,PC3細(xì)胞中, 與si-NC遷移組(100.30% ± 5.51%)相比,干擾OGT能夠顯著抑制PC3細(xì)胞的遷移率(64.67% ± 4.73%),與si-NC侵襲組(99.67% ± 6.43%)相比,干擾OGT能夠顯著抑制PC3細(xì)胞的侵襲率(42.00% ± 6.56%),DU145細(xì)胞中,與si-NC遷移組(99.67% ± 10.60%)相比,干擾OGT同樣能夠抑制DU145細(xì)胞的遷移率(45.33% ± 7.10%),與si-NC侵襲組(100.00% ± 7.00%)相比,干擾OGT同樣能夠抑制DU145細(xì)胞的侵襲率(53.33% ± 9.50%),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig.5E-H,P<0.01)。綜上所述,OGT促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲。

Fig.5 The effect of OGT interference on the proliferation and migration of prostate cancer cells (A) The interference efficiency of OGT at mRNA level was detected by qRT-PCR,**P<0.01, n=3. (B) The interference efficiency of OGT at protein level was detected by Western blotting. (C-D) The proliferation ability of PC3 and DU145 cells after interference with OGT was detected by plate clone formation assay. The bar graph indicated the clone formation rate,**P<0.01, n=3. (E-H) Transwell assay detected the migration and invasion ability of PC3 and DU145 cells after interference with OGT, and the scale was 50 μm. Bar charts showed relative mobility and invasion rate, respectively,**P<0.01, n=3

2.6 干擾氧連接的N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶能夠部分逆轉(zhuǎn)miR-485-5p對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的影響

采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-485-5p的抑制表達(dá)效果,經(jīng)轉(zhuǎn)染的PC3細(xì)胞中,與inhibitor NC組(1.00±0.07)相比,miR-485-5p的表達(dá)量下降至(0.15 ± 0.02),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig.6A,P<0.01)。DU145細(xì)胞中,與inhibitor NC組(1.00 ± 0.06)相比,miR-485-5p的表達(dá)量下降至(0.40 ± 0.08),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig.6B,P<0.01)。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾OGT后,miR-485-5p對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果顯示,PC3細(xì)胞中,與inhibitor NC+si-NC組(100.00% ± 3.73%)相比, miR-485-5p inhibitor+si-NC組克隆形成率顯著升高(208.50% ± 11.53%),而miR-485-5p inhibitor+si-OGT組克隆形成率僅為(146.50% ± 10.16%),DU145細(xì)胞中, 與inhibitor NC+si-NC組(100.00% ± 14.78%)相比,miR-485-5p inhibitor+si-NC組克隆形成率顯著升高(205.4%±11.44%),而miR-485-5p inhibitor+si-OGT組克隆形成率僅為(157.50% ± 8.88%),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig.6C-D,P<0.01)。采用Transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證干擾OGT后,miR-485-5p對(duì)前列腺癌細(xì)胞遷移與侵襲的影響,結(jié)果顯示,PC3細(xì)胞中,與inhibitor NC+si-NC遷移組(100.00% ± 8.97%)相比,miR-485-5p inhibitor+si-NC組遷移率顯著升高(221.80% ± 13.14%),而miR-485-5p inhibitor+si-OGT組遷移率僅為(143.20% ± 9.77%),DU145細(xì)胞中,與inhibitor NC+si-NC遷移組(100.00% ± 18.81%)相比,miR-485-5p inhibitor+si-NC組遷移率顯著升高(245.90% ± 11.44%),而miR-485-5p inhibitor+si-OGT組遷移率僅為(158.10% ± 12.93%),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig.6E-F,P<0.01)。PC3細(xì)胞中,與inhibitor NC+si-NC侵襲組(100.00% ± 11.81%)相比,miR-485-5p inhibitor+si-NC組侵襲率顯著升高(233.70% ± 15.92%),而miR-485-5p inhibitor+si-OGT組侵襲率僅為(151.50% ± 8.60%),DU145細(xì)胞中,與inhibitor NC+si-NC侵襲組(100.00% ± 9.80%)相比, miR-485-5p inhibitor+si-NC組侵襲率顯著升高(260.90% ± 12.67%),而miR-485-5p inhibitor+si-OGT組侵襲率僅為(158.80% ± 12.12%),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig.6G-H,P<0.01)。上述結(jié)果表明,干擾OGT在一定程度上能夠逆轉(zhuǎn)miR-485-5p對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的影響。因此,miR-485-5p通過靶向調(diào)控OGT發(fā)揮著抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的作用。

Fig.6 Verification of the interaction between miR-485-5p and OGT at the level of cell function (A) qRT-PCR verified the inhibitory expression efficiency of miR-485-5p in PC3 cells,**P<0.01, n=3. (B) qRT-PCR verified the inhibitory expression efficiency of miR-485-5p in DU145 cells,**P<0.01, n=3. (C-D) Plate clone formation assay was used to detect the proliferation ability of cells in each group. The bar graph indicated the clone formation rate,**P<0.01, n=3. (E-F) Transwell assay was used to detect the migration ability of cells in each group, and the scale was 50 μm. Bar graph showed the relative migration rate of cells,**P<0.01, n=3. (G-H) The invasion ability of cells in each group was detected by Transwell assay, and the scale was 50 μm. The bar graph showed the relative invasion rate of cells,**P<0.01, n=3

3 討論

前列腺癌是美國(guó)男性癌癥死亡的第二大原因[13], 在中國(guó),前列腺癌的發(fā)病率近年來呈逐漸上升趨勢(shì)[14]。毫無疑問,探索前列腺癌的發(fā)病機(jī)制及尋找有效的治療靶點(diǎn)迫在眉睫。

越來越多的研究表明,許多癌癥病例與miRNA失調(diào)相關(guān)。如:Zhao等人[15]研究表明,過表達(dá)miR-29a-3p或miR-29b-3p能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖,Tang等人[16]研究顯示,上調(diào)miR-21-5p能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲。就前列腺癌而言,已報(bào)道m(xù)iR-205和miR-34a參與前列腺癌的進(jìn)展并用作前列腺癌的潛在生物標(biāo)志物或治療靶標(biāo)[17]。眾所周知,miRNA可充當(dāng)腫瘤抑癌基因或癌基因角色,既往研究表明miR-485-5p在許多腫瘤中扮演著抑癌基因角色,如:Yuqin Pan等人[18]的研究證實(shí),過表達(dá)miR-485-5p可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲,Zhao等人[19]研究顯示,轉(zhuǎn)染miR-485-5p inhibitor可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲。然而,miR-485-5p在前列腺癌中的作用仍未可知,因此,本文旨在探究miR-485-5p在前列腺癌中的作用和機(jī)制。

本文通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-485-5p在前列腺癌組織中低表達(dá),qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)其在前列腺癌PC3、DU145及LNCaP細(xì)胞系中均低表達(dá),過表達(dá)miR-485-5p發(fā)現(xiàn),PC3和DU145細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲能力受到了顯著抑制。眾所周知,miRNA具有較為廣泛的生物學(xué)調(diào)節(jié)功能,可通過直接結(jié)合信使RNA的3'非翻譯區(qū)而調(diào)控基因的表達(dá),為明確miR-485-5p抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用機(jī)制,本文借助靶向預(yù)測(cè)網(wǎng)站分析miR-485-5p的下游靶標(biāo),發(fā)現(xiàn)OGT是其中之一,另外,經(jīng)查閱文獻(xiàn)得知OGT在前列腺癌中表達(dá)上調(diào)[11, 20, 21],且較高的OGT表達(dá)與Gleason評(píng)分、pN分期和神經(jīng)周圍侵襲顯著相關(guān),提示OGT是晚期前列腺癌的潛在預(yù)后標(biāo)志物[22]。隨后,本文通過雙熒光素酶報(bào)告、Western 印跡和qRT-PCR證實(shí)OGT是miR-485-5p的一個(gè)下游靶基因,后續(xù)實(shí)驗(yàn)證明,干擾OGT能夠顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,從而證實(shí)了OGT在前列腺癌中發(fā)揮的促癌作用,因此,本文推測(cè)miR-485-5p可以通過靶向結(jié)合OGT的mRNA進(jìn)而發(fā)揮抑癌的生物學(xué)效應(yīng)。共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,干擾OGT能夠在一定程度上逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-485-5p對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的促進(jìn)作用,從而證實(shí)miR-485-5p通過負(fù)向調(diào)控OGT發(fā)揮著抑癌作用。不足之處是本文只是在細(xì)胞水平做了研究,進(jìn)一步的研究需要建立裸鼠模型來深入探究miR-485-5p的作用及調(diào)控機(jī)制,這將是今后繼續(xù)研究的方向之一。

綜上所述,本研究證實(shí)了miR-485-5p在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)和生物學(xué)功能,并初步明確miR-485-5p可通過靶向調(diào)控OGT進(jìn)而抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲。上述研究結(jié)果將有助于進(jìn)一步揭示miR-485-5p在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制,可為尋找前列腺癌的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。