武都地區(qū)初榨橄欖油酚類和脂肪酸組成對油脂氧化穩(wěn)定性研究

唐鳳霞, 李 川, 周 昊, 陳虹霞, 張昌偉, 王成章

(中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所;江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室;國家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點實驗室;林木生物質(zhì)低碳高效利用國家工程研究中心;江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210042)

初榨橄欖油作為一種優(yōu)質(zhì)的脂質(zhì)來源,具有延緩衰老、抗炎和維持腸道健康的功效,受到科學(xué)界的廣泛研究[1-3]。初榨橄欖油的營養(yǎng)特性和氧化穩(wěn)定性與其化學(xué)組成密切相關(guān)。初榨橄欖油由98%可皂化部分和2%不可皂化部分組成,可皂化部分由甘油三酯、磷脂和甾醇酯等脂肪酸衍生物組成,其中油酸為主要脂肪酸(占脂肪酸總量的55%～83%),高含量的油酸可以降低20%～40%的冠心病風(fēng)險[4]。不可皂化部分包括酚類、色素、甾醇、萜類、生育酚及揮發(fā)性物質(zhì)[5],其中酚類是不可皂化部分含量最高的成分,尤其是裂環(huán)烯醚萜類(橄欖裂環(huán)烯醚萜、刺激醛、橄欖苦苷苷元、女貞子苷元),在橄欖油的營養(yǎng)價值和感官特性方面發(fā)揮著重要作用,是橄欖油中主要的抗氧化成分[6]。這些化學(xué)成分的組成狀況受品種和種植環(huán)境影響,并決定油脂的氧化穩(wěn)定性。近些年,橄欖油中化學(xué)成分與氧化穩(wěn)定性的關(guān)系引起了科研人員的廣泛研究[7]。盡管脂肪酸、總酚含量與橄欖油氧化穩(wěn)定性的相關(guān)性得到了分析,但具體單個成分的貢獻(xiàn)還需要進(jìn)一步研究。厘清品種、化學(xué)成分及油脂氧化穩(wěn)定性的關(guān)系有助于橄欖油品質(zhì)提升和貯藏管理。雖然地中海國家對橄欖油中脂肪酸和多酚的組成與含量研究較多,但化學(xué)成分的表達(dá)受品種、氣候環(huán)境、栽培方式、加工工藝等多方面因素的影響[8-9]。我國作為非典型地中海氣候國家,引種種植油橄欖已有60余年,隴南武都區(qū)是油橄欖種植一級適生區(qū),但所產(chǎn)橄欖油化學(xué)成分的研究大多集中在脂肪酸、簡單酚酸及揮發(fā)性化合物,對裂環(huán)烯醚萜類成分鮮見報道[10]。因此,本研究對比分析了武都常見的14個品種初榨橄欖油的脂肪酸、酚類含量及氧化穩(wěn)定性,并基于化學(xué)指標(biāo)建立氧化穩(wěn)定性預(yù)測模型,旨在為地方農(nóng)業(yè)部門篩選品種和貯藏橄欖油的指導(dǎo)工作提供理論基礎(chǔ)。

1 實 驗

1.1 原料、試劑與儀器

14個油橄欖品種(白橄欖、恩帕特雷、奇跡、阿斯、中山24、云臺14、皮瓜爾、豆果、小蘋果、鄂植8、阿爾伯薩拉、科拉蒂、萊星、佛奧)收集于隴南市經(jīng)濟(jì)林研究院大堡油橄欖品種示范園,采集時間為2021年10月7日至2021年11月15日,每個品種手工采摘收集成熟度為3的果實約6 kg,采摘12 h內(nèi)全部榨取完畢。羥基酪醇、酪醇、香蘭素、香草酸、咖啡酸、對香豆素、松脂酚、木犀草素、芹菜素、乙酸、沒食子酸、橄欖苦苷(純度≥98%),阿拉丁公司;脂肪酸甲酯混合物,美國Sigma-Aldrich公司;乙腈、甲醇均為色譜純;石油醚、甲醇、氫氧化鈉、碳酸鈉均為分析純;橄欖裂環(huán)烯醚萜、刺激醛(純度≥98%),由希臘雅典大學(xué)Maria課題組提供。

Trace 1300 ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)儀、LTQ-Orbitrap XL質(zhì)譜儀,美國賽默飛世爾公司;Abencor橄欖油提取系統(tǒng)(該系統(tǒng)包括一個錘磨機(jī),配備可交換的篩子,一個融合攪拌機(jī)和一個離心機(jī)),西班牙MC2 INGENIERIA公司;LC-20AT-DAD型高效液相色譜(HPLC)儀,日本島津公司;892 Rancimat油脂氧化穩(wěn)定性測定儀,瑞士萬通中國有限公司;UV-1800(PC)紫外分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1初榨橄欖油的提取 根據(jù)Miho等[11]提取方法,采用Abencor提取系統(tǒng)提取橄欖油。750 g油橄欖果經(jīng)碾磨機(jī)破碎后形成糊狀物,轉(zhuǎn)移糊狀物至水浴系統(tǒng),28 ℃下攪拌60 min,隨后移至離心機(jī),3 500 r/min條件下離心2次,每次1 min,收集離心液于量筒中,靜置分層,收集上層油相于棕色瓶中,-20 ℃保存,備用。

1.2.2脂肪酸組成與含量的測定 根據(jù)閆輝強(qiáng)等[12]描述的方法,采用酯交換法對脂肪酸進(jìn)行甲酯化,采用脂肪酸甲酯混合物標(biāo)準(zhǔn)品來確定GC-MS條件。GC條件:色譜柱AE-FFAP毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),分流進(jìn)樣,進(jìn)樣量為1 μL,分流比30∶1。柱初溫70 ℃保持4 min,以10 ℃/min的速率升至190 ℃,保持8 min,再以4 ℃/min的速率升至250 ℃,保持5 min;載氣模式為恒流模式,載氣流速1.0 mL/min。MS條件:采用EI電離模式,電離電壓為70 eV,傳輸線溫度和離子源溫度分別為250和280 ℃。質(zhì)譜設(shè)置為全掃描模式,掃描范圍為50～800,溶劑延遲2 min;質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫為NIST 2011版標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜檢索庫。

1.2.3多酚類成分組成與含量的測定 根據(jù)Deiana等[8]的方法提取酚類化合物并測定酚類組成與含量(稍作修改)。稱取約3 g初榨橄欖油與5 mL 80%甲醇水溶液渦旋混合,置于搖床30 ℃水浴振蕩30 min,10 000 r/min離心混合液3 min,收集甲醇/水層移至60 ℃真空干燥至液體揮干,最后用1 mL甲醇定容,過0.22 μm濾膜,得多酚提取物溶液,-20 ℃保存,備用。

采用HPLC-MS確定橄欖苦苷苷元、女貞子苷元、8-乙酰氧基松脂酚的保留時間。HPLC條件如下:色譜柱Nuclosil 100-5 C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為0.2%的乙酸水溶液(A)和乙腈/甲醇(體積比1∶1)(B),流速為1 mL/min,檢測波長為280 nm。梯度洗脫程序為:0～40 min,4%～50%B;40～50 min,50%～40%B;50～60 min,100%B;60～70 min,100%～4%B;70～82 min:4%B。MS條件:負(fù)離子模式,離子源為ESI源(源加熱器溫度300 ℃,鞘氣流量700 L/h,錐氣流量50 L/h,毛細(xì)管溫度320 ℃,毛細(xì)管電壓-10 V,離子噴射電壓2.9 kV),掃描范圍(m/z)100～800。采用外標(biāo)法基于HPLC對多酚類化合物進(jìn)行定量分析,橄欖苦苷苷元和女貞子苷元的含量根據(jù)橄欖苦苷定量,乙酰氧基松脂酚的含量根據(jù)松脂酚定量。

總酚測定采用福林酚法,精密吸取50 μL上述提取物溶液于10 mL試管內(nèi),依次加入1 mL 20%現(xiàn)配福林酚試劑、 2.5 mL 0.15 g/mL碳酸鈉溶液,渦旋混勻,加水定容至10 mL,室溫下避光反應(yīng)120 min后,采用分光光度計測定750 nm處吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液沒食子酸質(zhì)量濃度和吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4油脂氧化穩(wěn)定性的測定 氧化穩(wěn)定性測定參照Miho等[11]方法,通過油脂氧化穩(wěn)定性測定儀進(jìn)行,取3.0 g的油樣置于試管中,在(120±1.6) ℃下加熱,通入空氣,氣流速度20 L/h,記錄結(jié)果,以誘導(dǎo)時間(t)表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

利用Microsoft excel匯總處理數(shù)據(jù),采用Simca-P14.0軟件進(jìn)行主成分分析。單因素試驗方差分析和逐步回歸分析采用SPSSAU在線軟件(https:∥spssau.com/)處理,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,差異顯著性水平小于5%(p<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 脂肪酸的組成與含量

14個品種初榨橄欖油的主要脂肪酸組成與含量見表1。由表1可知,所有樣品均符合歐盟特級初榨橄欖油標(biāo)準(zhǔn)[13]。品種間脂肪酸組成相似但含量存在顯著差異(p<0.05),表明脂肪酸是區(qū)分品種非常有用的參數(shù)。主要脂肪酸分成單不飽和脂肪酸(MUFA)、多不飽脂肪酸(PUFA)和飽和脂肪酸(SFA)3大類,初榨橄欖油中油酸、亞油酸、棕櫚酸依次為3大類中含量最高的脂肪酸。油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在56.12%(豆果)和71.45%(科拉蒂)之間,亞油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在5.73%(皮瓜爾)和15.80%(阿斯)之間,棕櫚酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在12.67%(科拉蒂)和18.76%(豆果)之間。中山24是阿斯的改良品種,與原品種阿斯相比,改良品種中山24油酸和棕櫚酸的含量均更高。MUFA/PUFA的比值是鑒別品種和評估油脂氧化穩(wěn)定性的重要指標(biāo),如表2所示,14個品種初榨橄欖油的MUFA/PUFA的比值從最低的阿斯為3.59到最高的皮瓜爾為11.04。與地中海國家所產(chǎn)橄欖油相比,武都所產(chǎn)橄欖油呈現(xiàn)出低油酸和高亞油酸含量的特征,這些結(jié)果與Gao等[14]結(jié)果一致,主要原因可能是武都的氣溫低于同期的地中海國家,而低溫有利于多不飽和脂肪酸的合成以提高細(xì)胞膜的流動性[15]。

表2 14個品種初榨橄欖油中不同飽和度脂肪酸的分布情況1)

2.2 多酚化合物的組成與含量

13種酚類物質(zhì)的質(zhì)譜圖(圖1)和定性分析結(jié)果見表3,具體含量分析結(jié)果見表4和表5。品種對所有酚類化合物含量均具有顯著影響(p<0.05)。橄欖油中酚類化合物主要分為裂環(huán)烯醚萜、黃酮、酚醇、酚酸、木脂素5大類,其中裂環(huán)烯醚萜類是橄欖油中含量最高的酚類物質(zhì)。在橄欖油生產(chǎn)第一階段,內(nèi)源性的β-糖苷酶催化油橄欖果實中的橄欖苦苷與女貞子水解生成橄欖苦苷苷元和女貞子苷元,隨后經(jīng)內(nèi)源性甲基酯酶催化,快速脫羧產(chǎn)生橄欖裂環(huán)烯醚萜和刺激醛[16]。刺激醛與布洛芬化學(xué)結(jié)構(gòu)相似,被認(rèn)為是一種天然甾醇類藥物,且具有抗炎、抗衰老的功效,是橄欖油辛辣味的主要來源,而橄欖裂環(huán)烯醚萜是橄欖油苦味的主要來源[6]。武都所產(chǎn)橄欖油中裂環(huán)烯醚萜類化合物組成與地中海國家橄欖油一致,但是含量與其他文獻(xiàn)報道數(shù)據(jù)存在差異,這些差異可以用作物季節(jié)、農(nóng)藝管理和氣候條件等其他外部因素來解釋[9]。橄欖裂環(huán)烯醚萜的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在43.89 mg/kg(豆果)和205.90 mg/kg(奇跡)之間,刺激醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在25.65 mg/kg(鄂植8)和123.41 mg/kg(中山24)之間,說明奇跡和中山24是生產(chǎn)高閾值苦味和辛辣味初榨橄欖油的優(yōu)勢品種。橄欖苦苷苷元的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在12.91 mg/kg(豆果)到98.38 mg/kg(科拉蒂)之間,女貞子苷元的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在12.17 mg/kg(阿爾伯薩拉)到33.81 mg/kg(奇跡)之間。可以看出,裂環(huán)烯醚萜類化合物含量為奇跡最高,而豆果最低。

圖1 中山24初榨橄欖油80%甲醇提取物的質(zhì)譜Fig.1 Mass spectrogram of 80% methanol extract of Zhongshan24 virgin olive oils

表3 13種主要酚類化合物的質(zhì)譜信息

表4 初榨橄欖油中裂環(huán)烯醚萜類和黃酮類化合物組成與含量

表5 初榨橄欖油酚醇類、酚酸類、木脂素化合物組成與含量

木脂素類是橄欖油中質(zhì)量分?jǐn)?shù)第2高的酚類物質(zhì),阿斯和改良品種中山24都含有較高的木脂素,分別為25.98和22.53 mg/kg,展現(xiàn)了品種的同源性。根據(jù)歐洲食品安全局(EFSA)對橄欖油多酚的健康聲明,每20 g橄欖油中至少需含有5 mg的羥基酪醇及其衍生物(如橄欖苦苷復(fù)合物和酪醇)[17]。阿斯含有最高的羥基酪醇和酪醇,分別為3.21和12.32 mg/kg。關(guān)于黃酮類,科拉蒂的芹菜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,為6.62 mg/kg,阿爾伯薩拉的木犀草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,為2.81 mg/kg。酚酸類化合物中香草酸、咖啡酸、香蘭素、對香豆酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高依次為4.67 mg/kg(云臺14)、 3.03 mg/kg(豆果)、 2.59 mg/kg(云臺14)和3.47 mg/kg(小蘋果)。對于總酚的分布,奇跡的總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,為471.35 mg/kg,而豆果中總酚最低,為165.65 mg/kg,這與橄欖油中裂環(huán)烯醚萜含量密切相關(guān)。低含量的酚類成分影響橄欖油的品質(zhì),不利于橄欖油的保存。值得注意的是,與原品種阿斯相比,改良品種中山24的總酚含量增加了60.39%,表明改良育種對橄欖油中酚類化合物的提升具有積極的作用,對于鄂植8、豆果、佛奧等酚類含量較低的品種改良具有指導(dǎo)意義。

2.3 油脂氧化穩(wěn)定性的分析

采用Rancimat法測試14個品種42個油樣的氧化穩(wěn)定性,誘導(dǎo)時間越長,表明油脂氧化穩(wěn)定性越高,結(jié)果見表6。由表可知,品種對油脂氧化穩(wěn)定性具有顯著影響(p<0.05),誘導(dǎo)時間在39.93 h(奇跡)與7.11 h(豆果)之間,平均值19.29 h,變異系數(shù)為46.32%。14個品種中50%的品種誘導(dǎo)時間在10～20 h,21.43%的品種誘導(dǎo)時間在20～30 h?？评俸推孥E具有更高的氧化穩(wěn)定性,誘導(dǎo)時間在30 h以上,而豆果和阿斯的氧化穩(wěn)定性較低,誘導(dǎo)時間在10 h以下,結(jié)果與之前研究一致[18]。改良品種中山24的氧化穩(wěn)定性是原品種阿斯的2.93倍。

表6 14個品種初榨橄欖油油脂氧化穩(wěn)定性

然而,阿斯的總酚含量與皮瓜爾、阿爾伯薩拉、鄂植8相近,但具有不同的氧化穩(wěn)定性。奇跡與萊星脂肪酸組成相似,但氧化穩(wěn)定性存在差異。為揭示氧化穩(wěn)定性、化學(xué)成分以及品種之間的相關(guān)性,對數(shù)據(jù)集進(jìn)行主成分分析。根據(jù)交叉驗證,前3個主成分可以解釋63.2%的變異性(表7)。圖2(a)為橄欖油組分與抗氧化活性指標(biāo)關(guān)系的載荷圖,圖中顯示氧化穩(wěn)定性與橄欖苦苷苷元、女貞子苷元、芹菜素、油酸、橄欖裂環(huán)烯醚萜的含量呈正相關(guān),與之前的研究一致。相反,氧化穩(wěn)定性與刺激醛、酪醇、羥基酪醇、亞油酸、棕櫚酸的含量呈負(fù)相關(guān),其中羥基酪醇的負(fù)相關(guān)與Mateos等[19]報道不一致,主要因為Mateos討論的是單個化合物在油脂中的抗氧化行為,而實際抗氧化行為發(fā)生在復(fù)合體系中,酚類化合物的抗氧化效應(yīng)受分子間相互作用影響,可能產(chǎn)生相反的抗氧化行為,Miho等[11]的研究也得到了相似的結(jié)果。顯然,油脂的氧化穩(wěn)定性與具體化學(xué)成分相關(guān)。根據(jù)化學(xué)成分分布,品種可以被分成3類(圖2(b)),第1組樣品(紅色標(biāo)記)氧化穩(wěn)定性較高,有較高含量的橄欖苦苷苷元、女貞子苷元、橄欖裂環(huán)烯醚萜、油酸;第2組樣品(藍(lán)色標(biāo)記)氧化穩(wěn)定性較低,富含棕櫚酸、亞油酸、酪醇、羥基酪醇;第3組樣品(綠色標(biāo)記)誘導(dǎo)時間在10～30 h之間,代表了隴南地區(qū)橄欖油氧化穩(wěn)定性71.43%的水平。

TPP:總酚含量 total phenolic content; IT:誘導(dǎo)時間 induction time

表7 PCA特征值及方差貢獻(xiàn)率

2.4 多元線性回歸建立油脂氧化穩(wěn)定性預(yù)測模型

表8 線性回歸分析結(jié)果(n=42)

3 結(jié) 論

3.1對武都種植的14個常見品種初榨橄欖油的化學(xué)成分和油脂氧化穩(wěn)定性進(jìn)行分析,結(jié)果表明:武都橄欖油的脂肪酸和多酚組成與地中海地區(qū)的橄欖油一致,品種間多酚和脂肪酸含量及油脂氧化穩(wěn)定性存在顯著性差異(p<0.05)。與地中海地區(qū)相比,武都初榨橄欖油的油酸含量略低,亞油酸含量略高,但均符合特級初榨橄欖油的脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)。油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在(56.12±0.24)%(豆果)與(71.45±0.42)%(科拉蒂)之間,亞油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在(5.73±0.06)%(皮瓜爾)與(15.80±0.05)%(阿斯)之間?？偡拥馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)在(165.65±8.08)mg/kg(豆果)和(471.35±29.34)mg/kg(奇跡)之間。奇跡和科拉蒂的氧化穩(wěn)定性最高,豆果和阿斯的氧化穩(wěn)定性最低。該研究結(jié)果為不同功能價值和風(fēng)味特性的初榨橄欖油的生產(chǎn)提供了參考。

3.2主成分分析表明橄欖苦苷苷元、女貞子苷元、芹菜素、油酸、橄欖裂環(huán)烯醚萜可以提高油脂氧化穩(wěn)定性,而刺激醛、酪醇、羥基酪醇、亞油酸、棕櫚酸會降低油脂氧化穩(wěn)定性。基于逐步線性回歸分析,建立了以芹菜素、橄欖裂環(huán)烯醚萜、木犀草素和亞油酸為解釋變量的回歸模型,該模型可以預(yù)測初榨橄欖油的氧化穩(wěn)定性,為橄欖油保質(zhì)期的預(yù)測提供了一定的理論基礎(chǔ)。