金屬抗菌肽SIF4對(duì)大腸桿菌拓?fù)洚悩?gòu)酶活性及胞內(nèi)核酸合成的影響

李玉珍，肖懷秋, ，周慧恒，李 籃，匡 燕，劉 淼，趙謀明

（1.湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥與生物工程學(xué)院，湖南 株洲 412000；2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510000）

大腸桿菌（Escherichia coli）是引起食品公共安全事故與食物中毒的重要致病菌，已成為當(dāng)前食品公共衛(wèi)生主要威脅之一[1]，特別是多重交叉耐藥菌株的出現(xiàn)使食源性致病菌防控變得復(fù)雜。姜曉冰等[2]分析河南新鄉(xiāng)超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)鮮肉來(lái)源的E.coli質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥基因（PMQR）分布及耐藥決定區(qū)靶基因（QRDR）突變情況發(fā)現(xiàn)，PMQR基因陽(yáng)性菌株檢出率高達(dá)7.8%，QRDR靶位突變普遍存在；徐旭等[3]采集陜西寶雞地區(qū)冷凍食品樣本360 份，E.coli檢出率為13.6%，毒力基因以腸外致病性相關(guān)基因FyuA和iss檢出率最高，部分菌株對(duì)13 種抗生素耐藥；楊承霖等[4]對(duì)從四川不同養(yǎng)殖場(chǎng)患病動(dòng)物樣本分離的444 株E.coli分析發(fā)現(xiàn)，雞源和豬源樣本超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株檢出率分別為42.2%和12.8%，耐藥基因以blaTEM-1、blaTEM-52、blaCTX-M-55、blaCTX-M-65和blaCTX-M-14為主要流行亞型并以水平傳播為主。

拓?fù)洚悩?gòu)酶是所有細(xì)菌DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄、染色體分離、基因表達(dá)調(diào)控及細(xì)胞分裂等過(guò)程的關(guān)鍵代謝調(diào)控酶，且結(jié)構(gòu)相對(duì)保守，人基因組沒有編碼該基因，已成為當(dāng)前抗菌藥物研究重要且理想的新效應(yīng)靶點(diǎn)[5-6]，分為I和II兩個(gè)亞型[7]。I型拓?fù)洚悩?gòu)酶最早在E.coli中被發(fā)現(xiàn)，最初稱為ω蛋白，由topA基因編碼，分為N端催化片段（67 kDa）和C端鋅指結(jié)構(gòu)域（30 kDa），對(duì)負(fù)超螺旋DNA解鏈?zhǔn)潜匦璧腫8]。II型拓?fù)洚悩?gòu)酶含GyrA（105 kDa）和GyrB（95 kDa）兩個(gè)亞基，GyrA亞基與DNA鏈斷裂和重連有關(guān)，參與DNA結(jié)合、裂解和連接反應(yīng)，GyrB亞基有合成ATP功能，為GyrA亞基參與的DNA切割/連接反應(yīng)供能[9]。氟喹諾酮類抗生素和氨基香豆素可分別靶向作用于GyrA亞基和GyrB亞基發(fā)揮抗菌效應(yīng)[10-11]。山蒼子精油對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶I和II有抑制作用且呈良好量效正相關(guān)[12]，喜樹堿可靶向拓?fù)洚悩?gòu)酶I從而阻斷胞內(nèi)核酸合成，香豆霉素可靶向拓?fù)洚悩?gòu)酶并干擾酶DNA復(fù)合物形成[13]，三唑鄰苯二甲酸衍生物可抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II活性并能嵌入DNA與拓?fù)洚悩?gòu)酶形成復(fù)合物[14]；Polydatin僅對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶II有抑制作用，可優(yōu)先與DNA輕微凹槽結(jié)合[15]。課題組研究發(fā)現(xiàn)，金屬抗菌肽（簡(jiǎn)稱金抗肽）SIF4對(duì)E.coli有較好抑制活性，可破壞菌體細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)并誘導(dǎo)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏和造成細(xì)胞聚沉[16]，也可調(diào)控糖酵解途徑和影響呼吸代謝等發(fā)揮非細(xì)胞質(zhì)膜靶向抑菌活性[17-18]，但對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶和胞內(nèi)核酸生物合成的影響尚不明確。為闡明基于胞內(nèi)拓?fù)洚悩?gòu)酶效應(yīng)靶點(diǎn)的非細(xì)胞質(zhì)膜抑菌機(jī)理，實(shí)驗(yàn)研究金抗肽SIF4對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶I/II以及胞內(nèi)核酸合成的影響，以期為金抗肽SIF4在食源性E.coli的生物防控中提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金抗肽SIF4為課題組制備，對(duì)E.coli最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）為0.4 mg/L[16]；E.coliATCC25922 上海保藏生物技術(shù)中心；ATP、pBR322DNA、蛋白酶K、溶菌酶、RNase、溴化乙錠（ethidium bromide，EB）生工生物工程（上海）股份有限公司；牛肉膏、蛋白胨、NaCl 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；H1850R高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；Infinite F200 pro多功能酶標(biāo)儀 瑞士帝肯公司；DanoDrop超微量分光光度計(jì) 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；YXQ-LS-70A立式高壓滅菌鍋 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；瓊脂糖凝膠電泳裝置 北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取

將菌體接種至LB培養(yǎng)基，37 ℃、120 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。取10 mL菌液5 000 r/min離心10 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌菌體2 次，5 000 r/min離心10 min，菌體沉淀重懸于4 mL TE緩沖液，加入8 μL溶菌酶（50 mg/mL）37 ℃溫育30 min；加入10 μL RNAase（10 mg/mL）和0.5 mL十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）（10 g/100 mL）溶液，37 ℃溫育30 min；加入10 μL蛋白酶K（20 mg/mL），37 ℃溫育90 min，加入等體積苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）混勻，8 000 r/min離心5 min。上清液轉(zhuǎn)入離心管，加入1.8 mL乙酸鈉（3 mol/L）、18 mL冰無(wú)水乙醇，12 000 r/min離心2 min，重復(fù)抽提2 次，沉淀即基因組DNA。沉淀用70%乙醇溶液洗滌一次，室溫干燥。加入0.5 mL TE緩沖液溶解并測(cè)定OD260nm和OD280nm，－20 ℃保藏備用[19]。

1.3.2 金抗肽SIF4對(duì)基因組DNA的影響

將基因組DNA溶于TE緩沖液，加入金抗肽SIF4使終質(zhì)量濃度分別為1/2 MIC、MIC和2 MIC，以不加SIF4為對(duì)照組，混勻后室溫放置60 min。取混合液9 μL與1 μL 10×上樣緩沖液混勻，用0.8%瓊脂糖凝膠（EB，5 μg/L）電泳檢測(cè)（100 V，30 min）DNA遷移情況，初步判定SIF4與基因組DNA結(jié)合方式[20]。

1.3.3 金抗肽SIF4對(duì)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的影響

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液于6 000 r/min離心10 min，菌體沉淀用PBS清洗3 次，于TMN溶液（NaCl 0.295 g、MgCl20.072 5 g，溶于1.0 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），并定容至200 mL）中洗滌1 次，4 ℃、6 000 r/min離心15 min，沉淀重懸于1 mL粗酶提取緩沖液中，冰浴30 min。超聲破碎菌體（750 W，5 s，間隔30 s，循環(huán)10 次），破碎液于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，上清液為粗酶提取液（含拓?fù)洚悩?gòu)酶I和II），4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?）拓?fù)洚悩?gòu)酶I活性測(cè)定：在含0.50 μg pBR322 DNA的離心管中加入2.5 μL拓?fù)洚悩?gòu)酶解旋緩沖液I，用三蒸水定容至20 μL，37 ℃溫育30 min，加入2 μL SDS（10%）及1 μL蛋白酶K（10 mg/mL）終止反應(yīng)，37 ℃孵育30 min，取8 μL樣品加入2 μL 5×上樣緩沖液于1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色觀察；2）拓?fù)洚悩?gòu)酶II活性測(cè)定：在含0.50 μg pBR322 DNA的離心管中加入2.5 μL 拓?fù)洚悩?gòu)酶解旋緩沖液II，用三蒸水定容至20 μL，37 ℃孵育30 min，加入2 μL SDS（10%）和1 μL蛋白酶K（10 mg/mL）終止反應(yīng)，37 ℃孵育30 min，取8 μL樣品加入2 μL 5×上樣緩沖液于1%瓊脂糖凝膠中電泳，染色后觀察；3）SIF4對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶I和II活性影響的測(cè)定：拓?fù)洚悩?gòu)酶I反應(yīng)體系為0.5 μg pBR322 DNA、2.5 μL DNA解旋緩沖液I、2.5 μL粗酶提取液（拓?fù)洚悩?gòu)酶I活性約1.0 U），三蒸水定容至20 μL；拓?fù)洚悩?gòu)酶II反應(yīng)體系為0.5 μg pBR322 DNA、2.5 μL DNA解旋緩沖液II、2.5 μL粗酶提取液（拓?fù)洚悩?gòu)酶II活性約1.0 U）、4 mmol/L ATP，三蒸水定容至20 μL，電泳后染色觀察。

1.3.4 金抗肽SIF4對(duì)胞內(nèi)DNA和RNA生物合成的影響

將菌種接種至LB液體培養(yǎng)基中，加入金抗肽SIF4至終質(zhì)量濃度分別為1/2 MIC、MIC和2 MIC，以未添加SIF4為對(duì)照組，37 ℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12 h。1）總DNA提?。喝【? mL于5 000 r/min離心10 min，PBS洗滌3 次，菌體沉淀重懸于567 μL TE緩沖液（含10 g/L溶菌酶），室溫處理5 min；加入30 μL SDS（100 g/L）和3 μL蛋白酶K（20 mg/mL），37 ℃溫育60 min，加入100 μL NaCl（5 mol/L），再加入80 μL十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）溶液（50 g/L CTAB、0.5 mol/L NaCl），65 ℃溫育10 min。加入等體積苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）抽提，加入60%體積異戊醇混勻并沉淀DNA，用70%乙醇溶液洗沉淀2 次后用TE溶解沉淀，4 ℃?zhèn)溆没颍?0 ℃保存[21]。用酶標(biāo)儀測(cè)定樣本230、260 nm和280 nm波長(zhǎng)處吸光度。2）總RNA提取：取菌液3 mL于5 000 r/min離心10 min，PBS洗滌3 次，將菌體沉淀重懸于200 μL TE緩沖液（含10 g/L溶菌酶），室溫處理5 min。加入1 mL TRIzol試劑并反復(fù)抽吸，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至離心管中，室溫靜置5 min，加入1/5體積的氯仿用力振搖15 s，室溫靜置2～3 min。4 ℃、12 000 r/min離心15 min，轉(zhuǎn)水相至新離心管并加入等體積異丙醇，上下輕輕顛倒混勻，室溫靜置10 min；4 ℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入1 mL 75%預(yù)冷乙醇溶液（DEPC水配制），混勻，4 ℃、7 500 r/min離心5 min，棄上清液，室溫倒置于紙巾上5～10 min使乙醇揮發(fā)，用30～50 μL RNase-free水重溶，55～60 ℃溫育10 min，加入1 μL RNA酶抑制劑后于4 ℃?zhèn)溆没颍?0 ℃保存?zhèn)溆肹22]。

1.3.5 胞內(nèi)總DNA和總RNA含量的測(cè)定

根據(jù)Lambert-Beer定律可知，A＝εcp，因此，c＝1/εp×A，式中，c為樣本濃度，A為樣本吸光度，ε為樣本中物質(zhì)的摩爾消光系數(shù)，p為光程/cm。令1/εp為系數(shù)f（ng·cm/μL），則c＝f×A。對(duì)于Nanodrop，dsDNA的系數(shù)f＝50 ng·cm/μL，ssDNA的系數(shù)f＝33 ng·cm/μL，RNA的系數(shù)f＝40 ng·cm/μL[23]。核酸最大吸收峰為260 nm，上式中A為260 nm波長(zhǎng)處吸光度，根據(jù)吸光度A260nm和f可計(jì)算出樣本中總DNA和總RNA含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 SIF4對(duì)基因組DNA的影響

小分子物質(zhì)與基因組DNA結(jié)合后會(huì)使DNA在瓊脂糖凝膠上的遷移率出現(xiàn)不同程度的滯后。SIF4與基因組DNA結(jié)合凝膠阻滯電泳結(jié)果如圖1所示。可以看出，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組DNA電泳圖譜均呈現(xiàn)單一條帶，無(wú)明顯彌散現(xiàn)象，各條帶明暗無(wú)顯著差異，說(shuō)明SIF4與基因組DNA結(jié)合后并未破壞基因組DNA結(jié)構(gòu)完整性，與brevilaterin作用一致[24]，但與ε-聚賴氨酸作用機(jī)制不同，ε-聚賴氨酸與基因組DNA結(jié)合后可破壞其雙螺旋結(jié)構(gòu)[25]；研究還發(fā)現(xiàn)，SIF4與基因組DNA結(jié)合后，出現(xiàn)明顯阻滯現(xiàn)象，阻滯程度與金抗肽SIF4質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，2 MIC組的基因組DNA樣本在瓊脂糖凝膠上遷移距離最短，其次為MIC組，1/2 MIC組遷移距離最長(zhǎng)，推測(cè)抗菌肽SIF4可與基因組DNA以類似EB嵌插方式強(qiáng)力結(jié)合并影響基因組DNA在瓊脂糖凝膠中的遷移速率[26]。

圖1 SIF4與基因組DNA結(jié)合凝膠阻滯圖Fig.1 Gel retardation analysis of SIF4 binding to genomic DNA

2.2 SIF4對(duì)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I的影響

拓?fù)洚悩?gòu)酶I是細(xì)菌胞內(nèi)廣泛存在的非ATP依賴型酶，催化DNA單鏈斷裂和重連，主要參與DNA超螺旋解旋及復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和重組等反應(yīng)。超螺旋狀態(tài)（Form I）是pBR322 DNA主要存在形式，在拓?fù)洚悩?gòu)酶的催化作用下可解旋形成線性或缺口形式（Form II）。分析金抗肽SIF4處理后pBR322 DNA狀態(tài)的變化可解析SIF4對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶I活性的影響（圖2）。

圖2 SIF4對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶I結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effect of SIF4 on topoisomerase I structure

由圖2可以看出，對(duì)于拓?fù)洚悩?gòu)酶I，空白對(duì)照組pBR322 DNA主要以Form I形式存在，電泳條帶明亮。金抗肽SIF4處理后，實(shí)驗(yàn)組在拓?fù)洚悩?gòu)酶I作用下，F(xiàn)orm II條帶變亮，F(xiàn)orm I條帶變暗，說(shuō)明pBR322 DNA在拓?fù)洚悩?gòu)酶I作用下，DNA存在形式發(fā)生了顯著變化，拓?fù)洚悩?gòu)酶I將超螺旋Form I形式解鏈成線性或缺口的Form II形式[27]。由圖2還可以看出，1/2 MIC、MIC和2 MIC組的pBR322 DNA解旋作用被不同程度抑制，與陰性對(duì)照組相比，F(xiàn)orm I增多，F(xiàn)orm II減少，1/2 MIC、MIC和2 MIC組的Form II條帶漸暗，表明金抗肽SIF4可抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I活性。

2.3 SIF4 對(duì)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II的影響

拓?fù)洚悩?gòu)酶II可斷裂DNA雙鏈并重連，是一種ATP依賴性酶，主要介導(dǎo)DNA解旋、斷裂和重排[28]。分析SIF4處理后pBR332 DNA存在形式的變化可解析其對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶II的影響。

由圖3可以看出，對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶II來(lái)說(shuō)，空白對(duì)照組Form I條件較亮，實(shí)驗(yàn)組中Form II條帶比Form I條帶明亮，說(shuō)明pBR332 DNA存在形式發(fā)生改變，超螺旋的Form I形式解鏈成了線性或缺口的Form II形式。由圖3可以看出，在1/2 MIC、MIC和2 MIC組別中，F(xiàn)orm I條帶相對(duì)較亮，而Form II條帶較暗，說(shuō)明pBR322 DNA仍以超螺旋的Form I形式為主，線性或缺口的Form II形式較少，據(jù)此可推斷金抗肽SIF4對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制作用相對(duì)較弱，主要抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I的活性，借此影響DNA單鏈斷裂和重連，影響超螺旋解鏈，從而調(diào)控DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)翻譯等生物過(guò)程[29]。

圖3 SIF4對(duì)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effect of SIF4 on DNA topoisomerase II structure

2.4 SIF4對(duì)胞內(nèi)總DNA和總RNA生物合成的影響

質(zhì)量較好的基因組DNA其OD260nm/OD280nm比值范圍為1.6～1.8，小于1.6可能受蛋白質(zhì)污染，大于1.8可能含RNA，通常情況下，OD260nm/OD230nm應(yīng)大于2，若比值小于1.8，可能含有胍鹽等污染物[30]。RNA樣本OD260nm/OD280nm比值范圍一般為1.9～2.1，小于1.9可能有蛋白質(zhì)殘留，大于2.1時(shí)RNA可能發(fā)生降解，若OD260nm/OD230nm比值小于2.0，可能殘留異硫氰酸胍和β-巰基乙醇等試劑[22]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，抽提的各實(shí)驗(yàn)組DNA樣本，其OD260nm/OD280nm比值范圍在1.95～1.97，OD260nm/OD230nm比值均大于2，RNA樣本OD260nm/OD280nm和OD260nm/OD230nm均大于2.0，說(shuō)明抽提的DNA和RNA樣本質(zhì)量較好。經(jīng)金抗肽SIF4處理12 h后，E.coli各實(shí)驗(yàn)組樣本總DNA和總RNA含量如圖4所示。

圖4 SIF4對(duì)總DNA（A）和總RNA（B）的影響Fig.4 Effect of SIF4 on total DNA (A) and RNA (B)

由圖4A可以看出，1/2 MIC組與對(duì)照組相比，胞內(nèi)總DNA含量無(wú)顯著差異（P＞0.05），MIC組和2 MIC組間總DNA含量有顯著差異（P＜0.05），且與對(duì)照組相比，胞內(nèi)總DNA含量均顯著降低（P＜0.05），表明經(jīng)1/2 MIC金抗肽SIF4處理12 h后，胞內(nèi)總DNA合成量并沒有顯著降低，但經(jīng)MIC和2 MIC金抗肽SIF4處理后，胞內(nèi)DNA合成受到明顯抑制，與金抗肽SIF4對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶作用趨勢(shì)一致。由圖4B可以看出，1/2 MIC組與對(duì)照組胞內(nèi)RNA含量也無(wú)顯著差異（P＞0.05），而相比對(duì)照組，MIC組和2 MIC組胞內(nèi)RNA含量顯著降低（P＜0.05），且MIC組和2 MIC組組間也存在顯著差異（P＜0.05），由此可說(shuō)明，金抗肽SIF4對(duì)E.coli胞內(nèi)總DNA和總RNA合成的抑制效應(yīng)與處理劑量存在正相關(guān)關(guān)系，與拓?fù)洚悩?gòu)酶活性抑制規(guī)律基本一致。

3 討論與結(jié)論

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶主要通過(guò)改變DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)影響基因復(fù)制、表達(dá)和調(diào)控。拓?fù)洚悩?gòu)酶I近似球形，直徑約65 ?，由4 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，酶促活性位點(diǎn)包埋于結(jié)構(gòu)域I和III之間（圖5）。N端67 kDa多肽片段是原核生物幾乎所有該類型酶的同源保守序列，可作為抗菌藥物效應(yīng)靶點(diǎn)[30]，C端鋅指結(jié)構(gòu)域可結(jié)合鐵，結(jié)合后表現(xiàn)為拓?fù)浠钚詼p弱或喪失[31]。

圖5 E.coli拓?fù)洚悩?gòu)酶I的結(jié)構(gòu)Fig.5 Topoisomerase I structure from E.coli

金抗肽SIF4結(jié)合鋅指結(jié)構(gòu)域后，拓?fù)洚悩?gòu)酶I活性降低可能與亞鐵與鋅指結(jié)構(gòu)域結(jié)合而影響其拓?fù)浠钚圆⑴c影響胞內(nèi)鐵參與的氧化還原系統(tǒng)有關(guān)[32-33]。拓?fù)洚悩?gòu)酶I是一個(gè)含有3 個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域的經(jīng)典蛋白，結(jié)構(gòu)中第1個(gè)和第2個(gè)鋅是維持拓?fù)洚悩?gòu)酶I空間構(gòu)象和拓?fù)浠钚员匦璧?，?個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)常不參與鐵結(jié)合，對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶活性影響有限[34]，拓?fù)洚悩?gòu)酶I活性與結(jié)合金屬類別無(wú)關(guān)，而與結(jié)合金屬數(shù)目有關(guān)[34]。II型拓?fù)洚悩?gòu)酶含GyrA和GyrB兩個(gè)亞基，亞基間以異四聚體（A2B2）形式結(jié)合，GyrA亞基包含N末端斷裂-重聚結(jié)構(gòu)域和羧基末端結(jié)構(gòu)域（CTD），GyrB亞基包含ATP酶結(jié)構(gòu)域和Toprim結(jié)構(gòu)域（圖6），其結(jié)構(gòu)中內(nèi)源依賴DNA的ATP酶是解旋供能主要來(lái)源[35]。

圖6 E.coli拓?fù)洚悩?gòu)酶II結(jié)構(gòu)Fig.6 Topoisomerase II structure from E.coli

拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑可通過(guò)嵌入方式插入到斷裂的DNA鏈，形成抑制劑-DNA-拓?fù)洚悩?gòu)酶穩(wěn)定復(fù)合物，從而阻礙DNA重連并阻止拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)改變，使胞內(nèi)積累大量斷裂DNA并激發(fā)SOS-DNA修復(fù)反應(yīng)，若修復(fù)無(wú)法完成則誘導(dǎo)菌體細(xì)胞進(jìn)入程序性死亡[36]。研究發(fā)現(xiàn)，金抗肽SIF4對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶II活性抑制較弱，主要通過(guò)抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I活性影響DNA解鏈等發(fā)揮抑菌活性，類似茚異喹啉作用機(jī)制[37]，相異于Polydatin[15]作用機(jī)制，Polydatin僅對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶II有抑制作用。凝膠阻滯結(jié)果表明，金抗肽SIF4可與基因組DNA以嵌插方式強(qiáng)力結(jié)合。課題組認(rèn)為，金抗肽SIF4可能與DNA-拓?fù)洚悩?gòu)酶I二元復(fù)合物發(fā)生結(jié)合并形成拓?fù)洚悩?gòu)酶I-DNA-SIF4三元復(fù)合物，該復(fù)合物積累會(huì)阻止拓?fù)洚悩?gòu)酶I對(duì)DNA鏈的解鏈、斷裂DNA重連及DNA切口修復(fù)等產(chǎn)生不同程度的影響。前期研究發(fā)現(xiàn)，SIF4處理后，E.coli內(nèi)源ROS得到不同程度增強(qiáng)，可能與斷裂DNA未能得到及時(shí)修復(fù)和斷裂DNA累積有關(guān)[17]。研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)金抗肽SIF4處理后，胞內(nèi)總DNA和總RNA生物合成均受到不同程度抑制，抑制效果與處理劑量呈正相關(guān)，胞內(nèi)核酸合成生物量變化趨勢(shì)與拓?fù)洚悩?gòu)酶受抑制變化基本同步，可能是由于金抗肽SIF4抑制了DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I活性，對(duì)DNA的解鏈和拓?fù)洚悩?gòu)結(jié)構(gòu)改變產(chǎn)生了影響，DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯等下游生物活動(dòng)受到影響，從而表現(xiàn)抑制E.coli增殖的效果[38]。下一步擬將通過(guò)分子對(duì)接手段研究金抗肽SIF4與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I的對(duì)接靶點(diǎn)，以進(jìn)一步闡明金抗肽SIF4與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的互作機(jī)制[39]。