基于花粉微觀特征的芒果屬種質(zhì)孢粉學(xué)研究及聚類分析

羅世杏 覃昱茗 黃國弟 唐玉娟 張宇 李日旺

關(guān)鍵詞：芒果屬；花粉形態(tài)；電鏡掃描；聚類分析

漆樹科（Anacardiaceae）芒果屬（Mangifera），約有69個種[1]。芒果在我國栽培歷史悠久，傳統(tǒng)栽培生產(chǎn)過程中存在許多天然雜交種，形成了野生、半野生和野生近源種等獨具特色的地方資源。目前在芒果遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建等方面仍以SSR[2]、SRAP[3-4]及ISSR[4]等分子標(biāo)記的手段分析為主，而分子標(biāo)記本身受環(huán)境條件、標(biāo)記類型等差異而導(dǎo)致分析結(jié)果不穩(wěn)定。許文天等[1]和施宗明等[5]簡要描述過花粉量及花粉形態(tài)特征，但未深入描述花粉超微形態(tài)特征，花粉形態(tài)指標(biāo)且品種數(shù)量涉及范圍也較小。芒果花粉超微結(jié)構(gòu)在植物系統(tǒng)分類的研究報道較少。植物隨著漫長的歷史演變而不斷與環(huán)境協(xié)調(diào)發(fā)展，其花粉在保持遺傳保守性和穩(wěn)定性下形成了獨特的形態(tài)特征，國內(nèi)外許多專家對柚[6]、棗[7]、菊芋[8]、懸鉤子[9]、梨[10]等樹種的花粉形態(tài)進行觀察，對其品種的分類鑒定、起源演化等方面進行了研究。對芒果屬植物進行聚類分析前，先把花粉形態(tài)學(xué)特征的觀測數(shù)據(jù)采用數(shù)量化分析的手段進行結(jié)構(gòu)化處理，該方式可成為人們對芒果屬植物進行科學(xué)研究的一個新手段[11]。本研究對芒果屬2個種32份種質(zhì)資源花粉進行調(diào)查研究，可在孢粉學(xué)領(lǐng)域為芒果的系統(tǒng)分類、優(yōu)特品種選育提供研究依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

32份供試芒果花粉均于2021年采自廣西亞熱帶作物研究所芒果種質(zhì)資源圃（表1）。于盛花期隨機采集樹冠外圍不同方向中上部雄蕊成熟的正?；ǘ?，用滅菌鑷子將成熟破裂的灰白色花藥放入電鏡固定液中，搖勻固定后，于4℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

花電鏡觀察方法參照方仁等[12]的方法，選擇紫紅色的花朵，將成熟的灰白色花粉進行脫水處理并干燥，用離子濺射儀對導(dǎo)電膠上緊貼的干燥花粉進行真空噴金鍍膜、移入發(fā)射掃描電鏡觀察并拍照。每份芒果供試材料均選取具有代表性的視野觀察記錄8個花粉形態(tài)特征數(shù)據(jù)，每個特征3次重復(fù)。300倍觀察花粉粒的群體形態(tài)，3000倍觀察花粉的極面和赤道面，15000倍觀察花粉的外壁紋飾特征，并測量極軸長（P）、赤道軸長（E）、萌發(fā)脊寬度（W）及網(wǎng)孔直徑（D）大小?；ǚ哿５男螤钣脴O軸長和赤道軸長的比值來表示（P/E），1.14＜P/E≤2為長球形，0.88

1.3數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差；選取極軸長、赤道軸長、萌發(fā)脊寬度、網(wǎng)孔直徑、網(wǎng)孔密度值共5個定量特征用IBMSPSS19.0軟件的組間聯(lián)接法進行系統(tǒng)聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.1芒果屬花粉形態(tài)特征比較

由圖1A～圖1C可知，供試芒果花粉粒形狀規(guī)則，大小勻稱，均為3條花粉萌發(fā)孔溝，大部分花粉粒萌發(fā)溝孔開裂度幾乎到達花粉粒的兩極，萌發(fā)溝以等間距環(huán)狀分布，萌發(fā)點凸起。對照NPC分類系統(tǒng)可知芒果花粉屬于N3P4C5型。其赤道觀大多數(shù)為橢圓形，萌發(fā)孔呈裂開狀；其極面觀為3裂三角形；條紋狀或網(wǎng)狀紋飾和紋孔布滿花粉粒表面。芒果花粉的形狀大小、萌發(fā)脊寬窄、網(wǎng)孔直徑和密度存在不同程度的差異。32個芒果材料花粉除白花本地芒、百東扁桃–芒19-24花粉粒的溝孔在極面有輕微的匯合外，其他花粉粒溝孔在極面均不匯合。根據(jù)花粉性狀P/E分級標(biāo)準(zhǔn)，云南土芒P/E值為1.56，屬長球形花粉；扁桃1號、扁桃2號、東水一號、桂熱芒23號、扁桃3號、土芒、扁桃4號、四季蜜芒和紫薇芒等9份材料花粉P/E值范圍0.76～0.87，屬扁球形花粉，其余的22份芒果材料屬于近球形花粉。從赤道軸長看，云南土芒的最小，為15.05μm，顯著小于其他芒果資源。從萌發(fā)脊寬來看，象牙芒26號最小，為13.77μm，與恒寧扁桃–芒19-3、百東扁桃–芒19-27、桂熱芒82號、云南土芒、龍眼香芒、布魯斯和秋實1號無差異，但顯著小于其余24份芒果資源。從網(wǎng)孔密度來看，馬切蘇、暹羅芒網(wǎng)孔密度均為37μm2，與百東扁桃–芒19-26、恒寧扁桃–芒19-3、百東扁桃–芒19-13、百東扁桃–芒19-12、百東扁桃–芒19-27、東水一號、象牙芒26號、龍眼香芒、帕拉英達、土芒、秋實1號、桂熱芒289號、四季蜜芒、仁和呂宋和紅花本地芒無差異，但顯著大于其余15份芒果資源。

2.2芒果屬花粉的外壁紋飾

從圖1D可見，從花粉外壁紋飾來看，大多數(shù)芒果花粉屬于網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)孔形狀多樣，主要是圓形和長條形，紋脊粗糙，網(wǎng)孔分布密度在不同材料間存在差異。32個供試芒果種質(zhì)材料花粉壁的表面紋飾都非常明顯，但網(wǎng)紋特征存在一定的差異，且萌發(fā)脊寬窄不一。大致可將這32個芒果花粉壁的紋飾分為以下4類：（1）花粉粒極軸部呈網(wǎng)狀紋飾，赤道面紋飾縱向成條紋狀，與網(wǎng)紋結(jié)合。網(wǎng)孔呈圓形或者超長圓形，大小，形狀差異大，網(wǎng)孔深。如白花本地芒（圖1D-1）、扁桃1號（圖1D-2）、扁桃2號（圖1D-6）、云南土芒（圖1D-19）、帕拉英達（圖1D-21）、布魯斯（圖1D-22）、土芒（圖1D-4）、秋實1號（圖1D-25）、桂熱芒289號（圖1D-26）、扁桃3號（圖1D-23）、扁桃4號（圖1D-27）。（2）網(wǎng)紋呈腦紋狀，紋路大而凸起，網(wǎng)孔較小，網(wǎng)孔密度稀疏，花粉粒表面粗糙，如金煌芒（圖1D-5）、百東扁桃–芒19-24（圖1D-8）、百東扁桃–芒19-16（圖1D-9）、恒寧扁桃–芒19-3（圖1D-10）、馬切蘇（圖1D-16）、象牙芒26號（圖1D-18）、紫薇芒（圖1D-32）、仁和呂宋（圖1D-30）、暹羅芒（圖1D-28）。（3）花粉粒極面和赤道面均為網(wǎng)紋狀，網(wǎng)孔呈近圓形，大小相對均勻，如臺農(nóng)1號（圖1D-3）、南逗邁4號（圖1D-4）、龍眼香芒（圖1D-20）、四季蜜芒（圖1D-29）、桂熱芒23號（圖1D-17）、紅花本地芒（圖1D-31）；條紋狀紋飾呈交叉彎曲，紋脊粗大且連片，偶見紋孔。如百東扁桃–芒19-26（圖1D-7）、百東扁桃–芒19-13（圖1D-11）、百東扁桃–芒19-12（圖1D-12）、百東扁桃–芒19-27（圖1D-13）、桂熱芒82號（圖1D-14）、東水一號（圖1D-15）。

2.3芒果花粉形態(tài)特征數(shù)量性狀的聚類分析

根據(jù)表2中的極軸長/赤道軸長（P/E）、萌發(fā)脊寬、網(wǎng)孔密度等6個花粉形態(tài)特征數(shù)量性狀，對32份芒果材料進行聚類分析。在相似距離為15時，32份芒果材料分為三大類群（圖2）。

第一類包括馬切蘇、暹羅芒、仁和呂宋3份材料，這3份材料都是來自東南亞的品種，從聚類圖來看，其親緣關(guān)系較接近。腦紋，其網(wǎng)孔直徑較小，網(wǎng)孔密度較大。第二類是云南土芒、布魯斯和象牙芒26號，其萌發(fā)脊寬度較窄。其余的26份芒果資源歸為第三類，其中扁桃1號、扁桃2號、扁桃3號和白花本地芒單獨成組，該組是最原始的野生芒果，其花粉紋飾是網(wǎng)紋和條紋的結(jié)合；四季蜜芒、南逗邁4號和桂熱芒23號聚為一組，其花粉粒紋飾為網(wǎng)紋紋飾，網(wǎng)孔近圓形，大小相對均勻。

3討論

攜帶大量遺傳信息的花粉使植物在進化過程中保持較強的保守性和穩(wěn)定性，為利用孢粉學(xué)進行遺傳關(guān)系的分析提供了理論依據(jù)[14]。近年來屬間及種間的分類研究工作已經(jīng)在部分作物中展開，并已見利用孢粉學(xué)手段開展親緣關(guān)系研究的報道。張梅等[15]對繡球?qū)偌敖墝倩ǚ坌螒B(tài)的研究表明繡球?qū)俚慕壏N屬花粉形態(tài)的變異范圍被繡球?qū)僦参锘ǚ坌螒B(tài)的變異幅度覆蓋了，且繡球?qū)倩ǚ厶卣餍誀钤诜N內(nèi)變異相對穩(wěn)定，而種間差別明顯。

本研究中參試的32份芒果種質(zhì)資源分屬2個種，其花粉在微觀形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)出一定的共性，其赤道觀為圓形或橢圓形，呈裂開狀；其極面觀為3裂三角形；表面具腦紋狀、條紋狀或網(wǎng)狀紋飾，屬于N3P4C5型。但各芒果資源在花粉粒大小、萌發(fā)脊寬等指標(biāo)存在著一定的差異，大小、深淺、疏密不等的穿孔分布在花粉粒表面。花粉粒大小與品種演化存在一定的關(guān)系，陳薇薇等[16]對當(dāng)歸屬植物的研究顯示花粉演化趨勢經(jīng)歷了原始、中等進化和進化3種類型，花粉粒的極軸變長，形狀由球形向超長球形演變。本研究通過電鏡掃描觀察發(fā)現(xiàn)，芒果屬花粉粒主要為近球形或扁球形，只有云南土芒的花粉形狀為長球形，這一現(xiàn)象與其研究不一致，可能是因為目前的芒果栽培種遺傳關(guān)系復(fù)雜，是經(jīng)過長年的自然雜交和人工雜交育種而得。

芒果屬芒果種在我國已有上千年的栽培種植史，在多年的馴化引種過程中，可能存在親緣關(guān)系背景雜合等現(xiàn)象，較近地區(qū)的大范圍引種種植使得這些芒果種（M.indicaL.）資源與本土的芒果屬扁桃種（M.persiciformisC.）資源可能產(chǎn)生了自然雜交，存在適應(yīng)性進化，形成了扁桃-芒。扁桃-芒的外觀表型例如葉片呈現(xiàn)出扁桃種的表觀性狀，葉薄革質(zhì)，狹披針形或線狀披針形，長11～20cm，寬2～2.8cm[17]。但其在孢粉學(xué)形態(tài)上與芒果種更為接近。本研究中觀察發(fā)現(xiàn)百東扁桃-芒19-13號與龍眼香芒聚在一起、桂熱芒82號在遺傳相似系數(shù)為3時與秋實一號聚在一起，同時與其聚為一類的還有百東扁桃–芒19-27、百東扁桃–芒19-26、百東扁桃–芒19-12，而桂熱芒82號與秋實一號都是印度芒901的實生后代，這表明了扁桃種和芒果種之間可能不存在雜交障礙。

根據(jù)花粉粒大小、花粉形態(tài)、萌發(fā)脊寬、網(wǎng)孔大小和網(wǎng)孔密度等數(shù)量性狀對參試材料進行聚類分析，在相似距離為15時，32份芒果屬資源可分為三大類群。32個芒果屬種質(zhì)資源花粉形態(tài)特征具有一定的共性，同時來源地較為接近的芒果屬種質(zhì)資源在進化樹上被聚為一類，例如馬切蘇、暹羅芒、仁和呂宋等東南亞來源地的芒果屬資源劃分特征較為一致，顯示出一定的地域特征，在譜系圖中聚為一類，這與采用SRAP分子標(biāo)記手段進行分類的結(jié)果基本一致[3]。而白花本地芒、扁桃1號、扁桃2號、扁桃3號、扁桃4號的資源具有一定的相似性，該類資源具有原始型、野生型的特點。

芒果屬資源的高度雜合背景使其花粉具有一定共性，為其分類和利用帶來一定困難。因此，芒果種質(zhì)資源花粉的電鏡分析結(jié)果可以作為芒果鑒定分類的依據(jù)之一。但對從分類學(xué)的角度來看，單憑花粉形態(tài)對遺傳背景高度復(fù)雜的芒果屬資源進行數(shù)量化分類，還不能確定其分類地位，因此必須還要結(jié)合其各自的生物學(xué)特性對芒果屬種質(zhì)資源的鑒定和分類進行確認(rèn)?？傮w而言，采用孢粉學(xué)手段，利用基因?qū)W、分子生物學(xué)和細胞學(xué)方法，結(jié)合芒果生物學(xué)性狀進行綜合分析揭示芒果屬種質(zhì)資源的親緣演化關(guān)系，對高度進化的芒果屬資源分類研究更有現(xiàn)實意義。