多種微生物菌株在鎘污染土壤修復(fù)中的效能比較研究

摘 要：當(dāng)前，土壤重金屬污染，特別是鎘污染，日趨嚴(yán)重，對(duì)生態(tài)和人類(lèi)健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。本實(shí)驗(yàn)成功篩選出5種具有鎘耐受和吸收能力的微生物菌種，包括韓國(guó)假單胞菌、賴(lài)氏菌屬等。深入研究它們的鎘耐受程度與吸收機(jī)制，并利用專(zhuān)業(yè)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和可視化，不僅為重金屬污染土壤治理提供理論依據(jù)，還為未來(lái)篩選高效微生物菌種應(yīng)對(duì)鎘污染問(wèn)題奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：土壤重金屬污染；鎘污染；微生物菌種；數(shù)據(jù)分析；土壤治理

中圖分類(lèi)號(hào)：X53 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號(hào)：2095–3305（2024）11–0-03

當(dāng)前，土壤重金屬污染問(wèn)題愈發(fā)嚴(yán)重，其中鎘污染尤為嚴(yán)重，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類(lèi)健康構(gòu)成巨大威脅[1]。從鎘污染的農(nóng)田土壤中分離出具有鎘耐性和鎘吸附性的微生物菌種，精心篩選，期望找到能夠有效應(yīng)對(duì)鎘污染的菌種資源。同時(shí)，深入探究不同細(xì)菌對(duì)鎘離子的吸收動(dòng)力學(xué)規(guī)律，以便更好地理解它們?cè)谕寥乐械男袨槟Ｊ絒2-4]。希望這些研究能夠?yàn)殒k污染土壤的修復(fù)提供有力的理論依據(jù)，為改善土壤環(huán)境、保護(hù)人類(lèi)健康作出積極貢獻(xiàn)。

1 實(shí)驗(yàn)材料、設(shè)計(jì)與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 水稻品種

實(shí)驗(yàn)采用的水稻品種，是由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所提供的特殊品種——具有鎘高積累特性的水稻材料IR34582。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

為了確保水稻幼苗茁壯成長(zhǎng)，精心選擇了木村B營(yíng)養(yǎng)液，其濃度從初始的1/8逐步提升至1/4、1/2，直至全濃度，以滿足水稻幼苗在不同生長(zhǎng)階段的需求。同時(shí)，為了增強(qiáng)水稻抗性，特別采用了微生物菌液進(jìn)行接種。在細(xì)菌培養(yǎng)方面，本實(shí)驗(yàn)選用了含有胰蛋白胨、酵母提取物和NaCl的LB培養(yǎng)基，以確保細(xì)菌正常繁殖。此外，還準(zhǔn)備了充足的超純水，以備實(shí)驗(yàn)所需，確保實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行[5]。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 微生物分離與培養(yǎng)

對(duì)水稻植株懸濁液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)坎加诤煌瑵舛孺k（0.889 7～5.338 2 mmol/L）的LB平板上，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行，觀察生長(zhǎng)狀況以篩選鎘耐性微生物。分離到的菌株通過(guò)Sanger測(cè)序確定屬種，并用甘油保存。

1.2.2 營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

消毒后的水稻種子育苗至三葉期，逐步增加營(yíng)養(yǎng)液濃度至全量培養(yǎng)約2周。之后接種微生物菌懸液，每個(gè)月3次，1個(gè)月后測(cè)定水稻地上部與根系鎘含量，篩選降鎘菌株。

1.2.3 水稻水培實(shí)驗(yàn)

選取飽滿的水稻種子，消毒催芽后暗黑育苗于珍珠巖基質(zhì)上。7 d后移至光照培養(yǎng)室，用營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)至兩葉一心時(shí)移栽至培養(yǎng)盆。每盆3株，預(yù)培養(yǎng)14 d。隨后分為接菌組（BA）和不接菌組（CK），添加鎘處理[6-7]。

本實(shí)驗(yàn)于2022年12月—2023年4月進(jìn)行，每組重復(fù)4次以確保結(jié)果準(zhǔn)確性。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌對(duì)鎘耐受性與吸附能力測(cè)定

（1）耐受性測(cè)定：通過(guò)不同鎘濃度（0～6 mmol/L）的LB培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，比較OD600值判斷菌株耐鎘能力。

（2）吸附能力測(cè)定：在固定鎘濃度（0.2～0.8 mmol/L）

下培養(yǎng)，離心后利用ICP-MS測(cè)定上清液鎘含量，評(píng)估菌株吸附能力。

（3）不同脅迫時(shí)間耐受性：在0.2 mmol/L鎘濃度下，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)（12～48 h）的OD600值，分析菌株生長(zhǎng)情況。

（4）不同脅迫時(shí)間吸附能力：同樣在0.2 mmol/L鎘濃度下，不同時(shí)間點(diǎn)收集上清液測(cè)定鎘含量，研究菌株吸附動(dòng)態(tài)。

（5）pH變化測(cè)定：通過(guò)對(duì)比BA與CK處理的pH值，

分析細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中pH的變化，判斷其產(chǎn)酸或產(chǎn)堿能力。

1.3.2 韓國(guó)假單胞菌對(duì)水稻與鎘吸收的影響

溶液培養(yǎng)試驗(yàn)表明，韓國(guó)假單胞菌在鎘濃度為

0.005 mmol/L條件下對(duì)水稻生長(zhǎng)具有積極影響。通過(guò)對(duì)比CK與BA處理，觀察水稻長(zhǎng)勢(shì)并測(cè)量生物量株高、根長(zhǎng)等生理指標(biāo)，評(píng)估菌株對(duì)水稻生長(zhǎng)和鎘吸收的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物分離和培養(yǎng)

經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)、分離純化，篩選出5株對(duì)鎘離子具有較高耐性的細(xì)菌菌株能在較高鎘濃度的平板上生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)初步鑒定，5種菌株如圖1所示：菌劑5為韓國(guó)假單胞菌，菌劑7為賴(lài)氏菌，菌劑11為不動(dòng)桿菌，菌劑13為熒光假單胞菌，菌劑22則為溶血葡萄球菌。這5種菌株各具特色，為后續(xù)研究提供了豐富的素材和可能。

2.2 細(xì)菌對(duì)鎘耐受性和吸附能力測(cè)定

2.2.1 水培實(shí)驗(yàn)

水培實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)行降低水稻鎘含量的根際促生菌的初步篩選。鎘以CdCl2·2.5H2O的形式施入，培養(yǎng)結(jié)束后發(fā)現(xiàn)，在鎘脅迫下，接菌5、7、11、13、22根系的鎘含量相較于CK顯著降低，符合微生物分離和培養(yǎng)的結(jié)果，篩選出以上5種菌株進(jìn)行下一步研究。

2.2.2 不同鎘濃度、48 h鎘脅迫時(shí)間各菌株對(duì)鎘的耐受性

實(shí)驗(yàn)設(shè)置了不同鎘濃度梯度，脅迫處理48 h后，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，隨著鎘濃度上升，菌株生長(zhǎng)受抑制。

1 mmol/L鎘濃度下，菌株生長(zhǎng)顯著受抑，耐鎘能力各異。高濃度鎘下，各菌株生長(zhǎng)抑制加劇，但13菌株在6 mmol/L下仍生長(zhǎng)，表現(xiàn)出最強(qiáng)耐鎘性。

2.2.3 不同鎘濃度、48 h鎘脅迫時(shí)間各菌株的吸鎘能力

通過(guò)初步實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)鎘濃度為1 mmol/L時(shí)，各菌株的生長(zhǎng)均顯著受到抑制。為了更精確地探究不同菌株的鎘吸收能力，調(diào)整了鎘的濃度梯度，將其設(shè)定為0.2～0.8 mmol/L，并進(jìn)行了吸鎘率的測(cè)定。

通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)隨著鎘濃度的逐漸降低，各菌株的吸鎘能力顯著增強(qiáng)。在0.8 mmol/L鎘脅迫下，5菌株和13菌株展現(xiàn)出最強(qiáng)的吸鎘能力，其次是11、22和7菌株。當(dāng)鎘濃度降至0.6 mmol/L時(shí)，各菌株的吸鎘能力進(jìn)一步提升，尤其13菌株最為顯著。降低至0.4 mmol/L后，各菌株的吸鎘能力繼續(xù)增強(qiáng)，13菌株仍領(lǐng)先，其后是7、22、5和11菌株。在最低的0.2 mmol/L鎘濃度下，各菌株的吸鎘能力達(dá)到新高，5菌株和13菌株再次表現(xiàn)出最強(qiáng)的吸鎘能力，7、22和11菌株緊隨其后。

2.2.4 相同鎘濃度、不同鎘脅迫時(shí)間各菌株對(duì)鎘的耐受性

調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件，將鎘濃度統(tǒng)一設(shè)定為0.2 mmol/L，并在不同時(shí)間段對(duì)菌株的鎘吸收和OD600進(jìn)行了測(cè)定。通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，隨著鎘脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，各菌株的生長(zhǎng)總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。特別是在鎘脅迫18～24 h，13和5菌株的生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期；而7菌株則在18～36 h內(nèi)生長(zhǎng)迅速，之后也進(jìn)入穩(wěn)定期；11菌株則在24～36 h內(nèi)達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定。結(jié)果表明，不同菌株在相同鎘濃度下的生長(zhǎng)響應(yīng)和穩(wěn)定期存在差異。

2.2.5 相同鎘濃度、不同鎘脅迫時(shí)間各菌株的吸鎘能力

調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件，將鎘濃度統(tǒng)一設(shè)定為0.2 mmol/L，并在不同時(shí)間段對(duì)菌株的吸鎘能力進(jìn)行了測(cè)定。通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在鎘脅迫時(shí)間不斷延長(zhǎng)的情況下，各菌株對(duì)鎘的吸附能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)鎘脅迫達(dá)到50 h時(shí)，各菌株的吸附能力均達(dá)到頂峰。在所有菌株中，13菌株和5菌株的吸附能力尤為突出，位列前二，其次是7菌株和11菌株，它們的吸附能力也相當(dāng)可觀。

2.2.6 細(xì)菌生長(zhǎng)引起的培養(yǎng)基pH變化情況

通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，各BA的培養(yǎng)基pH值均顯著高于CK，這表明各菌劑均具備產(chǎn)堿能力。值得注意的是，當(dāng)培養(yǎng)基pH偏堿性時(shí)，鎘主要呈現(xiàn)為氧化物結(jié)合態(tài)和殘留態(tài)，這兩種形態(tài)下的鎘相對(duì)穩(wěn)定，從而有效降低了鎘的吸收。特別值得一提的是，5號(hào)菌劑在降低鎘吸收方面的效果相較于13號(hào)菌劑更為顯著，顯示出其在應(yīng)對(duì)鎘污染問(wèn)題上的優(yōu)越性能。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于今后利用微生物技術(shù)處理鎘污染具有重要指導(dǎo)意義。

2.3 韓國(guó)假單胞菌對(duì)水稻農(nóng)藝性狀的影響

2.3.1 生物量

觀察圖2可以發(fā)現(xiàn)，BA水稻的根系干重顯著高于CK。具體來(lái)說(shuō)，BA的根系干重約為0.04 g/株，而CK僅為0.025 g/株。同樣的，BA的地上部干重也明顯高于CK，前者約為0.1 g/株，后者僅為0.05 g/株。由此可以看出，BA水稻的生物總量明顯高于CK，且其長(zhǎng)勢(shì)也更為旺盛，顯示接菌處理對(duì)水稻生長(zhǎng)的積極促進(jìn)作用。

2.3.2 株高、根長(zhǎng)

對(duì)比CK與BA兩組水稻實(shí)驗(yàn)（圖3）發(fā)現(xiàn)，在0.005 mmol/L的鎘添加濃度下，BA的水稻長(zhǎng)勢(shì)顯著優(yōu)于CK。觀察根系掃描儀圖像發(fā)現(xiàn)，BA水稻地上部長(zhǎng)度約為21 cm，根系長(zhǎng)度約為19 cm，顯示出較小的鎘抑制。相比之下，CK與水稻地上部長(zhǎng)度僅約15 cm，根系長(zhǎng)度約13 cm，長(zhǎng)勢(shì)明顯較差，鎘抑制效應(yīng)更為顯著。這一結(jié)果凸顯了接菌處理在緩解鎘脅迫、促進(jìn)水稻生長(zhǎng)方面的積極作用。

2.3.3 水稻不同器官鎘含量測(cè)定

由圖4可以觀察到，BA與CK的根系鎘含量大致相當(dāng)，均保持在約670 mg/kg的水平。然而，在地上部的鎘含量方面，BA卻展現(xiàn)出了顯著的優(yōu)勢(shì)。具體而言，BA的地上部鎘含量約為120 mg/kg，明顯低于CK的187 mg/kg。這一結(jié)果表明，韓國(guó)假單胞菌菌株在吸收鎘方面具有較強(qiáng)的能力，能夠有效降低地面鎘含量，對(duì)減輕鎘污染具有積極意義。

2.3.4 水稻根系生長(zhǎng)發(fā)育測(cè)定

由根系掃描圖（圖5）可知水稻根系的長(zhǎng)度、表面積、體積和水稻根尖數(shù)量等基本生長(zhǎng)情況。BA水稻根系長(zhǎng)度達(dá)175 cm，遠(yuǎn)超CK的68 cm。BA的根系表面積與體積也顯著增大，分別為17 cm2和0.36 cm3，而CK僅為6 cm2和0.08 cm3。此外，BA根尖數(shù)量也顯著多于CK，分別為430根和210根。這些數(shù)據(jù)凸顯了接菌處理對(duì)水稻根系生長(zhǎng)的明顯促進(jìn)作用。

3 結(jié)論

從農(nóng)田土壤樣本中篩選出了5種能有效降低水稻鎘吸收能力的菌種。這些菌種在治理鎘污染中展現(xiàn)出獨(dú)特潛力，特別是韓國(guó)假單胞菌，其能促進(jìn)水稻側(cè)根形成并降低鎘的生物有效性，顯著提高水稻抗鎘性。該發(fā)現(xiàn)不僅揭示了這些菌種在水稻降鎘中的關(guān)鍵作用，還為應(yīng)對(duì)土壤鎘污染提供了新的視角。未來(lái)，這些菌種的進(jìn)一步研究和應(yīng)用有望在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境保護(hù)中發(fā)揮重要作用。

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