鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥基因及檢測手段

朱奕衡 竭晶 宋磊 羅招慶

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 1感染與免疫中心,吉林 長春 130021;2呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科)

鮑曼不動(dòng)桿菌是一種普遍存在的革蘭陰性需氧球桿菌。由于基因組可塑性強(qiáng),在遺傳學(xué)水平上鮑曼不動(dòng)桿菌的不同分離株之間存在高度異質(zhì)性〔1,2〕。作為“逃逸”菌株之一,鮑曼不動(dòng)桿菌擁有多重耐藥性和很強(qiáng)的抗逆性,從而避免抗菌劑的作用。由于其對(duì)大腸桿菌素,替加環(huán)素和碳青霉烯類等最后抗生素方案的耐藥性,因而被世界衛(wèi)生組織和美國疾病控制和預(yù)防中心列為“高度優(yōu)先”,成為最具有威脅性的ESKAPE病原體之一〔3〕。其可以透過皮膚或呼吸道缺陷的病人進(jìn)行傳播,也會(huì)經(jīng)由重癥監(jiān)護(hù)室中呼吸機(jī)呼吸的患者進(jìn)行進(jìn)一步的院內(nèi)傳播,老年人因多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌引起的菌血癥使得其死亡風(fēng)險(xiǎn)增加近5倍,鮑曼菌血癥是引起30 d住院死亡率最高的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,因此鮑曼不動(dòng)桿菌感染成為重癥監(jiān)護(hù)患者或易受感染患者的主要風(fēng)險(xiǎn)因素。鮑曼不動(dòng)桿菌感染一般會(huì)引起皮膚,軟組織或傷口感染、菌血癥、心內(nèi)膜炎、尿路感染、腦膜炎和肺炎。鮑曼不動(dòng)桿菌的血液感染導(dǎo)致的死亡率為28%～43%〔4,5〕。本文總結(jié)了目前藥物抗菌活性的常用測定方法,并對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥基因及檢測方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,以期為研究鮑曼不動(dòng)桿菌感染的臨床與科研工作者做參考。

1 鮑曼不動(dòng)桿菌的抗藥性檢測

2.1體外抗菌活性的測定 體外抗菌活性測定可以直接評(píng)估抗菌藥物的有效性,并確定抗菌劑對(duì)相應(yīng)菌株的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)。目前有大量的方法用于確定病原體對(duì)于何種抗生素敏感,這些方法被統(tǒng)稱為抗微生物藥敏試驗(yàn)。

上述技術(shù)都是基于微生物生長表型進(jìn)行的,是普遍表型敏感性測試,這種方式具有普適性,機(jī)制已知且獨(dú)立具有明確的表型分類。但這種檢測手段依賴細(xì)菌的生長和相關(guān)產(chǎn)物的表達(dá),因而需要不斷摸索合適的實(shí)驗(yàn)條件及檢測手段?，F(xiàn)如今已經(jīng)開發(fā)出多種檢測手段包括但不限于以下方法:圓盤管法〔6〕:基于生長介質(zhì)濁度評(píng)估;pH指示劑比色法〔7〕:含酚紅指示劑培養(yǎng)基中測定細(xì)菌生長;氧化還原劑比色法〔8〕:含氧化還原指示劑培養(yǎng)基中測定細(xì)菌生長;培養(yǎng)盤擴(kuò)散法〔9〕:短暫孵育到含抗菌劑的培養(yǎng)盤中對(duì)抑制區(qū)進(jìn)行視覺評(píng)估;微流瓊脂糖通道系統(tǒng)〔10〕:微流體通道中固定在瓊脂糖基質(zhì)中的細(xì)菌并使用顯微鏡檢測單個(gè)細(xì)胞生長;前向激光散射〔11〕:使用激光的散射率測定細(xì)菌生長;數(shù)字延時(shí)顯微鏡〔12〕:液體樣品中的連續(xù)成像光學(xué)檢測;微生物細(xì)胞質(zhì)量測量〔13〕:通過微通道測定細(xì)菌生長;恒溫微量熱測定〔14〕:通過產(chǎn)熱測定細(xì)菌生長;實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)〔15〕:在液體培養(yǎng)基中孵育后實(shí)時(shí)定量測定16 S RNA基因或rpoB的DNA拷貝;ATP熒光定量〔16〕:熒光素-熒光素酶與細(xì)菌ATP反應(yīng)生成光,通過此測定細(xì)菌生長;熒光素酶報(bào)告噬菌體〔17〕:使用包含熒光素酶報(bào)告基因的噬菌體感染細(xì)菌,通過定量光的程度推定細(xì)菌生長程度;形態(tài)動(dòng)力學(xué)細(xì)胞分析〔18〕:將細(xì)菌固定在平面并用數(shù)字顯微鏡記錄微生物對(duì)單一濃度抗生素的反應(yīng);流式細(xì)胞術(shù)〔19〕:通過評(píng)估細(xì)胞形態(tài)功能等參數(shù)判別藥物對(duì)細(xì)菌的損傷;MALDI-TOF MS直接靶向微滴生長測定〔20〕:將微生物作為微滴培養(yǎng)在MALDI靶上并使用MALDI-TOF MS測量。

另一類是特定抗性機(jī)制的檢測,常見方法是以靶向耐藥基因或序列進(jìn)行DNA擴(kuò)增法,免疫色譜分析或抗生素降解分析檢測特定的耐藥機(jī)制?？股亟到夥治鲋饕峭ㄟ^比色或基于基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)完成〔21〕。以上方法特點(diǎn)是可以快速篩選出特定的抗生素抗性并可以確定對(duì)應(yīng)抗生素抗性的機(jī)制,但對(duì)于某些抗生素如碳青霉烯類抗生素透性升高或降低,難以通過該方法檢測。以上方法敏感性和特異性不能達(dá)到100%,即陰性的結(jié)果并不意味著對(duì)檢測的抗生素敏感,陽性結(jié)果也無法證明對(duì)相應(yīng)的抗生素有抗性〔22〕。

通過全基因組測序(WGS)進(jìn)行多種單一耐藥測檢測仍有問題亟待解決:對(duì)于單一抗生素的耐藥基因,是否了解的全面且可靠,對(duì)于耐藥基因的檢測是否足夠靈敏專一。雖然通過機(jī)器學(xué)習(xí)算法和通過RNA測序檢測基因表達(dá)水平等方法已經(jīng)開始研究并被用于改進(jìn)全基因組測序,但這些方法仍無法取代普遍的表型敏感性測試〔23〕。

2.2耐藥基因的獲取機(jī)制和定位 鮑曼不動(dòng)桿菌株中有著多種耐藥機(jī)制,如β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷修飾酶、外排泵、滲透性缺陷和靶位點(diǎn)修飾等。鮑曼不動(dòng)桿菌抗藥基因產(chǎn)生機(jī)制主要包含3種:一是通過酶修飾抗菌藥物,這其中包含氨基糖苷修飾酶(AMEs)介導(dǎo)的抗藥產(chǎn)生,使細(xì)菌獲得氨基糖苷類抗生素抗藥性;另一種是碳青霉烯水解D類(CHDL)β-內(nèi)酰胺酶介導(dǎo)的抗藥產(chǎn)生,使細(xì)菌獲得β-內(nèi)酰胺類,碳青霉烯類,頭孢菌素類,青霉素類抗生素抗藥性。第二種抗藥產(chǎn)生機(jī)制是改變目標(biāo)靶點(diǎn)或細(xì)胞功能,這其中包含修飾宿主細(xì)胞包膜結(jié)構(gòu),主要通過改變磷脂酶作用,改變脂質(zhì)和多糖,改變生物膜的形成或產(chǎn)生多種包括激活多種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(TCS)包括AdeRS、BaeSR、pmrAB、BfmRS、GacSA等使細(xì)菌獲得氨基糖苷類,替加環(huán)素,呋喃醌類,黏菌素,多黏菌素,黏菌蛋白等抗生素的抗藥性。另一種途徑是通過突變或拓?fù)涠喾N包括青霉素結(jié)合蛋白(PBP)、DNA旋轉(zhuǎn)酶fyrA、parC、16sRNA甲基化酶或二氫葉酸還原酶等異構(gòu)酶使抗菌藥物改變作用靶點(diǎn)并獲得亞胺培南、氟喹啉、四環(huán)素、甲氧芐啶扽多種抗生素抗性。最后一種抗藥性產(chǎn)生機(jī)制是限制抗生素進(jìn)入目標(biāo)部位,主要是通過上調(diào)包括RND、MATE、MFS、SMC家族在內(nèi)的藥物外排泵排除抗生素,使細(xì)菌獲得氨基糖苷類、替吉西林、氟喹啉類、紅霉素、氯霉素抗生素抗性;另一種情況是因?yàn)镺mpA、CarO的丟失或Porin通道表達(dá)減少使細(xì)菌產(chǎn)生外膜滲透性缺陷并產(chǎn)生碳青霉烯類黏菌素,青霉素抗生素抗性。

2.2.1β-內(nèi)酰胺酶抗性基因的定位 不動(dòng)桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的耐藥性部分是固有的,如銅綠假單胞菌中AmpC型頭孢菌素酶賦予其β-內(nèi)酰胺酶耐藥性已經(jīng)被證實(shí)。鮑曼不動(dòng)桿菌通過頻繁的基因水平轉(zhuǎn)移使之高頻率與外源DNA結(jié)合獲得β-內(nèi)酰胺酶的耐藥性。β-內(nèi)酰胺酶是在鮑曼不動(dòng)桿菌中發(fā)現(xiàn)最多的一類耐藥基因〔24〕。β-內(nèi)酰胺酶的耐藥基因檢測大部分基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的靶向宏基因組學(xué),通過追蹤不同生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)部和系統(tǒng)之間的抗性基因或家族進(jìn)行對(duì)應(yīng)抗性基因引物的設(shè)計(jì)從而確定待測菌落包含相應(yīng)基因的有無〔25〕。同樣也可以使用實(shí)時(shí)PCR以獲得半定量數(shù)據(jù)從而確定出不同生態(tài)系統(tǒng)中不同基因的相對(duì)豐度,部分的基因是通過微列陣技術(shù)檢測〔26〕。

β-內(nèi)酰胺酶主要分為4類,A類是經(jīng)典β-內(nèi)酰胺酶,包括抑制青霉素和窄譜頭孢菌素的TEM和SHV家族,這其中也有部分成員擁有滅活廣譜β-內(nèi)酰胺酶的能力,如頭孢噻肟酶(CTX)-M類被稱為廣譜β-內(nèi)酰胺酶ESBLs。A類β-內(nèi)酰胺酶也包括碳青霉烯酶如肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC),亞胺培南水解(IMI)型β-內(nèi)酰胺酶和黏質(zhì)沙雷菌酶(SME)等。除了少數(shù)KPC型酶外,A類碳青霉烯類主要被克拉維酸抑制,并可以更加有效地水解青霉素或頭孢霉素〔27〕。在鮑曼不動(dòng)桿菌中已發(fā)現(xiàn)多種包括TEM、SHV、圭亞那超廣譜(GES)型β-內(nèi)酰胺酶、CTX-M、SCO、假單胞菌擴(kuò)展耐藥性(PER)、越南超廣譜(VEB)型β-內(nèi)酰胺酶、KPC和羧青霉素水解(CARB)型β-內(nèi)酰胺酶在內(nèi)的多種A類β-內(nèi)酰胺酶〔2〕。B類β-內(nèi)酰胺酶是一種需要鋅離子或其他金屬離子催化的金屬β-內(nèi)酰胺酶,主要包含新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶(NDM)、維羅納整合素編碼金屬(VIM)型β-內(nèi)酰胺酶和亞胺培南耐藥假單胞菌(IMP)家族〔27〕。在鮑曼不動(dòng)桿菌已鑒定出多種包括IMP、VIM、NDM家族和SIM-1在內(nèi)的多種B類β-內(nèi)酰胺酶〔2〕。C類β-內(nèi)酰胺酶一般被稱為頭孢菌素(AmpC)酶,代表性的C類β-內(nèi)酰胺酶包括頭孢霉毒水解(CMY)型β-內(nèi)酰胺酶,AmpC(ACT)型β-內(nèi)酰胺酶和沙特阿拉伯達(dá)蘭醫(yī)院(DHA)型β-內(nèi)酰胺酶。通常具有C類β-內(nèi)酰胺酶的革蘭氏陰性菌具有青霉素和部分頭孢霉素的抗性,但不會(huì)對(duì)克拉維酸顯著抑制〔27〕。在鮑曼不動(dòng)桿菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)AmpC型β-內(nèi)酰胺酶〔2〕。D類β-內(nèi)酰胺酶包含苯唑西林酶(OXA)家族,其成員具有青霉素類,頭孢菌素類和碳青霉烯類的抗性〔27〕。400多種OXA型酶已經(jīng)在鮑曼不動(dòng)桿菌中被鑒定。

2.2.2外排泵耐藥基因的定位 在革蘭陰性菌中,細(xì)胞外膜限制了抗菌劑進(jìn)入細(xì)胞的速度,外排泵也會(huì)主動(dòng)將多種結(jié)構(gòu)不同的抗菌藥物排出細(xì)胞外。外排泵在細(xì)菌致病性和多藥耐藥中被反復(fù)提及,外排泵排出的最常見的抗菌藥物包含大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、喹諾酮類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、氯霉素、紅霉素、替加環(huán)素等,鮑曼不動(dòng)桿菌被證實(shí)對(duì)基于外排泵機(jī)制的抗菌藥物如替加環(huán)素和亞胺培南具有耐藥性〔28,29〕。

外排泵一般有6類:ATP結(jié)合盒(ABC)家族、耐藥結(jié)節(jié)化因子(RND)超家族、主要促生因子(MFS)超家族、多藥及毒性化合物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MATE)家族、藥物/代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(DMT)超家族和小多藥耐藥(SMR)家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白〔30〕。與鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性相關(guān)的是RND超家族、MFS超家族、MATE家族和SMR家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白〔2〕?；蚨ㄎ皇侄晤愃朴讦?內(nèi)酰胺酶類家族,通過靶向PCR或全基因組測序得知相應(yīng)的抗性基因。

第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)因?yàn)橥馀疟枚a(chǎn)生耐藥性的基因是AdeABC。擁有該基因的鮑曼不動(dòng)桿菌首先被發(fā)現(xiàn)具有氨基糖苷類耐藥性,而部分RND型外排泵被證明具有氨基糖苷類耐藥性。后續(xù)通過靶向PCR證明了鮑曼不動(dòng)桿菌中包含了adeB基因,隨后通過基因測序發(fā)現(xiàn)3個(gè)相鄰基因adeA、adeB和adeC的推斷產(chǎn)物與構(gòu)成RND型多藥外派系統(tǒng)的蛋白質(zhì)高度類似,因此推斷鮑曼不動(dòng)桿菌中包含AdeABC泵。通過RNA雜交發(fā)現(xiàn)AdeRS雙組分系統(tǒng)嚴(yán)格調(diào)控AdeABC的表達(dá),僅當(dāng)AdeRS雙組分系統(tǒng)功能缺失時(shí)導(dǎo)致AdeABC泵組成性表達(dá),從而導(dǎo)致抗生素耐藥性〔29〕。溴化乙錠是RND多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的有效且常見底物。使用溴化乙錠篩選鮑曼式桿菌的選定分離株,以確定是否存在外排泵〔31〕。由于RND系統(tǒng)在革蘭陰性菌中普遍存在,因此不斷有新的RND家族的成員被發(fā)現(xiàn),后來有研究人員開發(fā)了一種居于寡核苷酸的DNA微陣列,用于評(píng)價(jià)鮑曼不動(dòng)桿菌外排泵基因的表達(dá),大大加速了外排泵相關(guān)研究的進(jìn)程〔26〕。

在功能性宏基因組中,從待檢測的細(xì)菌混合物中提取DNA并將其鳥槍克隆到合適的載體中以生成基因文庫。通過對(duì)轉(zhuǎn)入基因文庫的大腸桿菌進(jìn)行氯霉素篩選發(fā)現(xiàn)了TetA基因〔32〕。這種方法不同于以往的靶向PCR,該方法可以篩選出未知的抗性基因。其中AbeM的發(fā)現(xiàn)同樣使用了類似的思路〔33〕。隨后在2012年發(fā)明了一種新的高通量功能宏基因組的方法,這是一種大規(guī)模平行的,可同時(shí)進(jìn)行多功能進(jìn)行選擇的平臺(tái),可以對(duì)數(shù)百個(gè)獨(dú)立選擇的抗性片段進(jìn)行復(fù)制,被稱為功能性宏基因組的平行注釋和重組的篩選(PARFuMS)〔34〕。后續(xù)發(fā)現(xiàn)的外排泵耐藥基因多是通過基于同源搜索或比較基因組學(xué)的方法對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌中可能的外排泵進(jìn)行搜尋或通過靶向PCR進(jìn)行定位并尋找〔35〕。

2.2.3滲透性缺陷相關(guān)基因的定位 孔蛋白形成的通道對(duì)分子跨越外膜運(yùn)輸和毒力發(fā)揮起到重要作用。當(dāng)一些孔蛋白表達(dá)減少時(shí)(CarO、Omp家族)導(dǎo)致鮑曼桿菌與碳青霉烯類抗生素(如亞胺培南,氨曲南,氯霉素和萘啶酸等)抗性增加〔36〕。研究發(fā)現(xiàn),OmpA和CarO與OXA-23碳青霉烯酶發(fā)生物理相互作用,這種相互作用和抗生素耐藥性相關(guān)〔37〕。除外膜蛋白外,LPS或肽聚糖缺失也會(huì)影響鮑曼不動(dòng)桿菌抗藥性,如LPS的缺失或修飾會(huì)降低鮑曼不動(dòng)桿菌膜的完整性并增加大腸桿菌素抗性〔38〕。

2000年首次發(fā)現(xiàn)OmpA表達(dá)的減少與碳青霉烯的耐藥性相關(guān)〔39〕。后續(xù)的多個(gè)Omp家族的蛋白都是通過質(zhì)譜比較菌株之間的外膜蛋白的表達(dá)差異,測序和蛋白數(shù)據(jù)庫等方法來確認(rèn)相關(guān)基因〔40〕。一種典型的參與鮑曼不動(dòng)桿菌亞胺培南和美羅培南耐藥性的孔蛋白CarO的發(fā)現(xiàn)是通過對(duì)比兩株菌株的OMP表達(dá)差異時(shí)發(fā)現(xiàn)亞胺培南的耐藥性和29 kD的外膜蛋白的缺失相關(guān)。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這29 kD的OMP缺失增加了與亞胺培南的抗性并通過實(shí)驗(yàn)定位到了CarO這個(gè)基因上,同時(shí)發(fā)現(xiàn)多種天然鮑曼不動(dòng)桿菌的碳青霉烯耐藥性是由于不同的插入元件破壞了CarO的完整性導(dǎo)致的〔41〕。

2.2.4氨基糖苷修飾酶相關(guān)基因的定位 氨基糖苷類修飾酶是鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)氨基糖苷類抗生素耐藥的主要機(jī)制,酶是機(jī)制不通順。氨基糖苷類修飾酶主要分為乙酰轉(zhuǎn)移酶,腺苷轉(zhuǎn)移酶和磷酸轉(zhuǎn)移酶〔34〕。編碼氨基糖苷修飾酶的基因可以位于質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上,有研究發(fā)現(xiàn)在Ⅰ類整合子上也出現(xiàn)了氨基糖苷修飾酶,在鮑曼不動(dòng)桿菌中已鑒定出了6種編譯氨基糖苷修飾酶的基因,都是通過靶向PCR鑒定并得到的,其中磷酸纖維素紙可以用于鑒定氨基糖苷修飾酶的活性〔42〕。

2.2.5抗生素靶點(diǎn)的轉(zhuǎn)變相關(guān)基因的定位 抗菌劑的靶點(diǎn)的重要特征是在微生物的生長生存中起到重要作用,因此會(huì)造成對(duì)應(yīng)微生物破裂死亡或者抑制生長并且該靶點(diǎn)不應(yīng)該存在于哺乳動(dòng)物中或與哺乳動(dòng)物中相應(yīng)靶點(diǎn)充分不同〔5〕。例如作用于轉(zhuǎn)肽酶或轉(zhuǎn)糖酶的抗生素僅作用于微生物,而類似作用域蛋白質(zhì)合成相互作用的藥物,如氨基糖苷類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類等;或作用于RNA聚合酶;如利福梅素;或作用于染色體分離(喹諾酮類)和完整性(甲硝唑);或作用于葉酸代謝如三聚體和嘧啶,其雖在哺乳動(dòng)物中存在相應(yīng)靶點(diǎn),但差異性足以選擇性抑制細(xì)菌的對(duì)應(yīng)生理反應(yīng)〔2〕。

因此,在長期抗生素的選擇壓力下,部分生物體相應(yīng)的靶點(diǎn)發(fā)生突變并降低對(duì)應(yīng)抗生素的敏感性并保證細(xì)胞的基本生理功能。最先被發(fā)現(xiàn)因?yàn)榭股匕悬c(diǎn)轉(zhuǎn)變導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性是青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)的改變。在檢測不到β-內(nèi)酰胺酶的情況下,鮑曼不動(dòng)桿菌中改變后的低親和力的PBPs過度表達(dá)增加了對(duì)亞胺培南的抗性,因而推測PBPs的改變?cè)黾恿缩U曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南的抗性〔43〕。隨后多個(gè)參與抗生素靶點(diǎn)改變的基因,如DNA旋轉(zhuǎn)酶GyrA/ParC,二氫葉酸還原酶DHFR和FolA,脂多糖PmrC等都是通過靶向PCR或測序等手段定位到對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵耐藥基因〔44〕。

綜上,由于臨床多藥耐性鮑曼不動(dòng)桿菌的流行,嚴(yán)重威脅重癥監(jiān)護(hù)室中危重患者和老年患者的生命健康,因此對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的研究刻不容緩,無論是臨床還是科研對(duì)于鑒定菌株的耐藥和相關(guān)基因都是必要的。鮑曼不動(dòng)桿菌具有所有細(xì)菌耐藥機(jī)制,并且所有的β-內(nèi)酰胺酶在鮑曼不動(dòng)桿菌都得到了檢測。除此之外,幾乎所有的鮑曼不動(dòng)桿菌中都包含氨基糖苷修飾酶,眾多外排泵介導(dǎo)的耐藥也陸續(xù)地得到檢測?，F(xiàn)如今最有效的治療手段依舊停留在黏桿菌素與其他抗生素聯(lián)合治療,鮑曼不動(dòng)桿菌的致病機(jī)制已進(jìn)行了廣泛研究,多種毒力蛋白被發(fā)現(xiàn),但其無窮無盡的獲取抗生素的能力在世界范圍內(nèi)引起臨床耐藥株檢出率越來越高,致死率也在不斷升高。