山奈酚調(diào)控ROS/TXNIP通路對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細(xì)胞氧化及炎性損傷的改善作用

王飛 梅群超 馮晶 李宏軍 汪伯毅 李含章

(1武漢市第一醫(yī)院中醫(yī)部,湖北 武漢 430022;2湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院;武漢市第一醫(yī)院 3骨科;4創(chuàng)面修復(fù)與周圍血管科)

膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)是骨性關(guān)節(jié)炎(OA)的一種,常見于中老年人群。關(guān)節(jié)軟骨的退變與繼發(fā)性骨質(zhì)增生是KOA的主要病變特征,而關(guān)節(jié)疼痛、腫脹及晨僵是KOA的典型表征〔1〕。由于已經(jīng)損壞的關(guān)節(jié)軟骨不能修復(fù),所以KOA不能徹底治愈。目前,臨床上常采用藥物治療來緩解KOA患者病癥,傳統(tǒng)中藥不僅價(jià)格低廉、副作用低,還具有明顯的治療效果〔2〕。山奈酚是在多種中藥和食物中廣泛存在的黃酮類化合物,具有多種生理作用,如抗炎、抗氧化、抗腫瘤等〔3〕。已有研究〔4,5〕表明,山奈酚能夠通過抑制絲裂原激活蛋白激酶相關(guān)的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶和P38信號(hào)通路,抑制IL-1β誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),進(jìn)而對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞OA產(chǎn)生保護(hù)作用。然而,目前有關(guān)山奈酚治療KOA的研究較少。活性氧/硫氧還原蛋白相互作用蛋白(ROS/TXNIP)通路是研究較多的與炎性反應(yīng)相關(guān)的信號(hào)通路。相關(guān)文獻(xiàn)〔6,7〕顯示,ROS/TXNIP通路的阻滯對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注損傷及急性胰腺炎肺損傷有改善作用。本研究將通過構(gòu)建KOA大鼠模型探討山奈酚對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織損傷的影響,并進(jìn)一步探究其與ROS/TXNIP通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1主要試劑、儀器 山奈酚(成都儀睿生物科技有限公司);ROS/TXNIP通路激活劑氧化三甲胺(TMAO,武漢鼎信通藥業(yè)有限公司);蘇木素-伊紅染色液(北京中杉金橋生物技術(shù)公司);活性氧熒光探針DCFH-DA(購自北京百奧萊博科技有限公司);一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑盒(武漢賽培生物科技有限公司);腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-6 ELISA試劑盒上海酶聯(lián)生物科技有限公司);TXNIP、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白(NLRP)3一抗及相應(yīng)二抗(美國(guó)Abcam公司)。倒置熒光顯微鏡,購自日本奧林巴斯;流式細(xì)胞儀,購自貝克曼庫爾特公司;凝膠成像儀,購自美國(guó)伯樂公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 45只7～8周齡健康雄性SPF級(jí)SD大鼠,體質(zhì)量為210～230 g,購自北京科興中維生物技術(shù)有限公司,動(dòng)物許可證號(hào)為SYXK(京)2020-0054。本研究獲得醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組、模型構(gòu)建與給藥方法 45只大鼠隨機(jī)分為即假手術(shù)組、模型組、山奈酚組、TMAO組和山奈酚+TMAO組,每組各9只。假手術(shù)組除外,其余各組均參考Wang等〔8〕使用的改良Hulth法構(gòu)建KOA大鼠模型。模型構(gòu)建成功后,山奈酚組灌胃50 mg/kg山奈酚〔9〕,TMAO組灌胃110 mg/kg ROS/TXNIP通路激活劑TMAO〔10〕,山奈酚+TMAO組灌胃50 mg/kg山奈酚和110 mg/kg ROS/TXNIP通路激活劑TMAO,模型組和假手術(shù)組分別灌胃等量的生理鹽水,1次/d,持續(xù)8 w。

1.4膝關(guān)節(jié)軟骨組織損傷評(píng)分 各組使用3%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉,然后解剖兩側(cè)膝關(guān)節(jié),取出左后肢內(nèi)踝軟骨,分成兩份,1份用于制備石蠟切片,另1份置于-80 ℃冰箱中保存待用。甲醛固定軟骨組織將其制備成石蠟切片,脫蠟后采用蘇木素溶液染色30 min,自來水沖洗后將切片置于乙醇溶液中靜置10 s,取出后用伊紅溶液染色3 min,酒精脫水后利用倒置熒光顯微鏡觀察大鼠軟骨組織形態(tài)變化,并對(duì)其退變程度進(jìn)行Mankin評(píng)分。

1.5ROS水平測(cè)定 取出-80℃冰箱中保存的各組大鼠部分軟骨組織,勻漿后,將其置于稀釋過的DCFH-DA中,上下顛倒混勻,20 min后使用磷酸(PBS)清洗3次,然后采用流式細(xì)胞儀在488和525 nm激發(fā)光處觀察熒光強(qiáng)度。

1.6NO、SOD、MDA和GSH-Px含量測(cè)定 取出-80 ℃冰箱中保存的各組軟骨組織,采用組織磨碎儀磨成勻漿,然后進(jìn)行離心,取上清,按照Griess法測(cè)定NO水平,并按照SOD、MDA和GSH-Px檢測(cè)試劑盒說明測(cè)定。

1.7TNF-α、IL-1β和IL-6含量測(cè)定 按照ELISA試劑盒方法檢測(cè)軟骨組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.8TXNIP和NLRP3蛋白表達(dá)水平的測(cè)定 提取各組大鼠的軟骨組織勻漿總蛋白,定量后進(jìn)行電泳,經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、封閉后,依次加入TXNIP、NLRP3一抗及相應(yīng)二抗,孵育后加入ECL發(fā)光試劑顯影,然后以β-actin作為內(nèi)參蛋白,利用凝膠成像儀分析TXNIP和NLRP3蛋白表達(dá)水平。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析,進(jìn)一步兩兩比較使用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1山奈酚對(duì)各組膝關(guān)節(jié)軟骨損傷的影響 假手術(shù)組膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞排列整齊;與假手術(shù)組比較,模型組和TMAO組膝關(guān)節(jié)軟骨損傷嚴(yán)重,細(xì)胞排列紊亂;與模型組相比,山奈酚組膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù),軟骨細(xì)胞也恢復(fù)整齊排列;而與山奈酚組比較,山奈酚+TMAO組膝關(guān)節(jié)軟骨損傷加重,見圖1。模型組Mankin評(píng)分顯著高于假手術(shù)組(P<0.05);山奈酚組Mankin評(píng)分顯著低于模型組(P<0.05);山奈酚+TMAO組Mankin評(píng)分顯著高于山奈酚組(P<0.05);TMAO組與模型組Mankin評(píng)分無顯著變化(P>0.05),見表1。

2.2山奈酚對(duì)各組軟骨組織中ROS水平的影響 與假手術(shù)組相比,模型組ROS水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,山奈酚組ROS水平顯著降低(P<0.05),TMAO組ROS水平無明顯變化(P>0.05);與山奈酚組相比,山奈酚+TMAO組ROS水平顯著升高(P<0.05),見表1。

2.3山奈酚對(duì)各組軟骨組織氧化損傷的影響 與假手術(shù)組相比,模型組軟骨組織中NO和MDA含量明顯增加,SOD和GSH-Px含量明顯減少(P<0.05);與模型組相比,山奈酚組軟骨組織中NO和MDA含量明顯下降,SOD和GSH-Px含量明顯上升(P<0.05),而TMAO組軟骨組織中NO、MDA、SOD和GSH-Px含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與山奈酚組相比,山奈酚+TMAO組軟骨組織中NO和MDA含量明顯升高,SOD和GSH-Px含量明顯降低(P<0.05),見表1。

圖1 各組膝關(guān)節(jié)軟骨損傷比較(蘇木素-伊紅染色,×200)

表1 各組膝關(guān)節(jié)軟骨損傷、ROS水平、軟骨組織氧化損傷指標(biāo)

2.4山奈酚對(duì)各組軟骨組織炎性損傷的影響 模型組軟骨組織TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯高于假手術(shù)組(P<0.05);山奈酚組軟骨組織TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯低于模型組(P<0.05),而TMAO組與模型組軟骨組織TNF-α、IL-1β和IL-6含量無明顯差異(P>0.05);山奈酚+TMAO組軟骨組織TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯高于山奈酚組,明顯低于TMAO組(P<0.05),見表2。

表2 各組軟骨組織炎性 損傷指標(biāo)

2.5山奈酚對(duì)各組軟骨組織中TXNIP和NLRP3蛋白表達(dá)水平的影響 與假手術(shù)組比較,模型組軟骨組織中TXNIP和NLRP3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05);與模型組比較,山奈酚組軟骨組織中TXNIP和NLRP3蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05),而TMAO組與模型組軟骨組織中TXNIP和NLRP3蛋白表達(dá)差異不明顯(P>0.05);與山奈酚組比較,山奈酚+TMAO組軟骨組織中TXNIP和NLRP3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05),見圖2、表3。

1～5:假手術(shù)組、模型組、山奈酚組、TMAO組、山奈酚+TMAO組圖2 各組軟骨組織中TXNIP和NLRP3蛋白表達(dá)

表3 各組軟骨組織中TXNIP和 NLRP3蛋白表達(dá)水平

3 討 論

KOA發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,年齡、肥胖、炎癥等因素均能導(dǎo)致KOA的發(fā)生,但目前尚無將其治愈的有效方法。近年來,從傳統(tǒng)中藥或者食物中提取的生物活性成分備受關(guān)注。一些文獻(xiàn)〔11～13〕顯示,川皮苷、芹菜素、山茱萸新苷Ⅰ等活性成分均能改善KOA。山奈酚是一種天然黃酮類物質(zhì),在抵抗氧化、炎癥、腫瘤等方面具有一定的效果〔14〕。目前研究較多的是山奈酚對(duì)心肌細(xì)胞的影響,而對(duì)KOA影響的研究甚少。本研究結(jié)果提示,山奈酚可使KOA大鼠軟骨組織損傷得到改善。

有資料〔15〕顯示,氧化應(yīng)激是影響KOA發(fā)展的重要因素之一。NO、MDA、SOD和GSH-Px是氧化應(yīng)激標(biāo)志物。NO能促進(jìn)自由基的生成,而MDA和SOD分別用來反映機(jī)體承受自由基攻擊的能力和清除自由基的能力,二者可作為KOA治療效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)。在KOA狀態(tài)下,NO和MDA含量明顯升高,SOD含量明顯降低〔16〕。GSH-Px含量的降低會(huì)導(dǎo)致機(jī)體損傷加重〔17〕。本研究結(jié)果說明,山奈酚能夠抑制KOA大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng),進(jìn)而改善其氧化造成的損傷。除了氧化應(yīng)激外,TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子是影響KOA病理進(jìn)程的又一大因素。以往研究〔18〕表明,TNF-α、IL-1β和IL-6水平的降低有利于預(yù)防KOA。本研究提示,山奈酚具有良好的抗炎作用,可通過降低炎性因子的含量改善KOA大鼠軟骨組織的炎性損傷。

有研究〔19〕表明,機(jī)體的炎癥反應(yīng)與ROS/TXNIP通路關(guān)系密切。ROS的大量產(chǎn)生使TXNIP表達(dá)上調(diào),進(jìn)而激活NLRP3炎癥小體并增加炎性因子的分泌,從而使機(jī)體損傷加重。Gu等〔20〕通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ROS/TXNIP通路的阻滯可抑制OA小鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明,山奈酚能夠抑制KOA大鼠體內(nèi)ROS/TXNIP通路的激活,改善KOA大鼠軟骨細(xì)胞的氧化和炎性損傷。