木質(zhì)素高效降解復(fù)合菌群構(gòu)建及其降解效果

摘要：為構(gòu)建一組高效降解木質(zhì)素的復(fù)合菌群，并提高堆肥過程中辣椒秸稈內(nèi)木質(zhì)素的降解率。利用苯胺藍(lán)褪色試驗(yàn)并測(cè)定菌株木質(zhì)素降解酶（木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶、漆酶）活性，從豬糞桑枝堆肥材料中篩選木質(zhì)素降解菌株，以5株菌株為最小單位構(gòu)建符合菌群。進(jìn)行室內(nèi)發(fā)酵試驗(yàn)，以CK（自然發(fā)酵）為對(duì)照、設(shè)置7種接菌處理（接種量均為3%）即單一菌劑（CB12、CF53、CF30、CF18、CF5）、復(fù)合菌劑（CS1）、市售菌劑（EM），測(cè)定木質(zhì)素和纖維素降解率。結(jié)果表明，豬糞桑枝堆肥材料中的Achromobacter CB12、Bacillus altitudinis CB38、Bjerkandera CF5、Trichoderma harziana CF18、Myrothecium CF30、Cladsporium CF53對(duì)木質(zhì)素具有較高的降解效果。菌株CF5、CF18、CF30、CF53、CB12的組合（復(fù)合菌群CS1）對(duì)木質(zhì)素的降解能力優(yōu)于其他菌株組合。復(fù)合菌群CS1木質(zhì)素過氧化物酶活性和對(duì)辣椒秸稈中木質(zhì)素的降解率分別是7.99 U/L和40.33%，較單一菌株分別提高了1.71倍和1.51倍?？梢?，符合菌群CS1綜合表現(xiàn)良好，作為構(gòu)建出的較優(yōu)菌群，可有效提高堆肥時(shí)辣椒秸稈中木質(zhì)素的降解效果，推進(jìn)辣椒秸稈的肥料化。

關(guān)鍵詞：木質(zhì)纖維素；堆肥；復(fù)合菌群；木質(zhì)素降解；水解酶

中圖分類號(hào)：S182；S141.4" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）24-0233-08

收稿日期：2023-12-16

基金項(xiàng)目：廣西重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：桂科AB22080097）；中國科學(xué)院鄉(xiāng)村振興項(xiàng)目（編號(hào)：KFJ-XCZX-202303）。

作者簡介：高付來（1999—），男，河南南陽人，碩士，主要從事甘蔗黑穗病的生物防治技術(shù)研究。E-mail：1079679996@qq.com。

通信作者：劉秋梅，博士，副研究員，主要從事微生物肥料研究，E-mail：liuqiumie@isa.ac.cn；夏世斌，博士，教授，主要從事生態(tài)修復(fù)及碳減排研究，E-mail：xiashibin@126.com。

我國作為農(nóng)業(yè)大國，每年產(chǎn)生的農(nóng)作物秸稈數(shù)量龐大。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2021年我國秸稈產(chǎn)量約8億t，居世界首位且秸稈產(chǎn)量依然呈上升趨勢(shì)^［1-2］。秸稈中包含豐富的C、N、P等營養(yǎng)物質(zhì)和微量元素，將其肥料化還田能減少化肥施用，從而實(shí)現(xiàn)秸稈的資源化^［3-5］。然而，秸稈中的木質(zhì)纖維素降解效率較低，限制了其完全肥料化。木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等組成，其中，木質(zhì)素?fù)碛芯o密的碳水化合物結(jié)構(gòu)，并以共價(jià)鍵的形式嵌入纖維素和半纖維素之間，形成了天然的物理屏障^［6］。這限制了纖維素和半纖維素的酶解，因此，提高木質(zhì)素的降解效率是突破辣椒秸稈肥料化技術(shù)瓶頸的關(guān)鍵。

生物法降解木質(zhì)素具有能耗小、無污染、成本低的特點(diǎn)，是近年來國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)^［7］。木質(zhì)素降解菌的來源多為腐爛的樹葉和木材，其中白腐真菌、褐腐真菌和鏈霉菌是目前廣泛研究的菌種。白腐菌可以分泌漆酶和木質(zhì)素過氧化物酶，選擇性破壞木質(zhì)素單體間的醚鍵（C—O—C）和碳碳（C—C）鍵，以提高木質(zhì)素的降解率^［8-9］，如Ceriporiopsis subvermispora、Dichomitus squalens和Phanerochaete chrysosporium。此外，Trametes versicolor和Fomes fomentarius等白腐菌對(duì)纖維素和半纖維素也有一定的降解作用^［10］。褐腐菌通過產(chǎn)生羥基自由基（·OH）氧化木質(zhì)素和分泌胞外酶2種方式降解木質(zhì)素^［11］。鏈霉菌能通過分泌漆酶和過氧化物酶破壞木質(zhì)素中的羰基（CO）和甲氧基（—OCH3）^［12］。此外，部分類芽孢桿菌屬和木霉屬的微生物也具有一定的木質(zhì)素降解能力^［13-14］。已發(fā)掘的微生物中，真菌的木質(zhì)素降解能力通常強(qiáng)于細(xì)菌。但是，細(xì)菌具有繁殖快、環(huán)境耐受性強(qiáng)以及基因組小的優(yōu)勢(shì)。多項(xiàng)研究表明，復(fù)合菌群具有更加完備的協(xié)同酶系統(tǒng)，對(duì)木質(zhì)素的降解效率高于單一菌株^［15-18］。如，將2株芽孢桿菌復(fù)合后對(duì)木質(zhì)素的降解效果有所提升；利用康寧木霉（Trichoderma koningiopsis）和黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）構(gòu)建的復(fù)合菌劑對(duì)木質(zhì)素和纖維素的降解能力優(yōu)于單一菌株；將毛曲菌（Trametes hirsuta）S13和平菇菌（Pleurotus ostreatus）S18復(fù)合后，結(jié)木質(zhì)素降解酶活力得到了提升，并且煙桿中木質(zhì)素的降解率提高到了41.1%^［16-18］。因此，構(gòu)建高效復(fù)合菌群是提高木質(zhì)素生物降解率的有效途徑。在湖南省，辣椒作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，每年產(chǎn)生大量辣椒秸稈。然而，當(dāng)前對(duì)木質(zhì)素降解菌群的研究主要集中在玉米秸稈和小麥秸稈上，對(duì)辣椒秸稈的研究尚顯不足。此外，在現(xiàn)有的研究中，所使用的菌株大多并非來源于堆肥材料，這使得研究的實(shí)用性和針對(duì)性受到限制。

本研究以堿木質(zhì)素為唯一碳源，采用褪色試驗(yàn)和木質(zhì)素降解酶活力檢測(cè)的方法，從豬糞堆肥樣品中分離篩選出具有木質(zhì)素降解能力的菌株。通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)這些菌株進(jìn)行鑒定，并以木質(zhì)素降解酶活力為篩選指標(biāo)，構(gòu)建了高效復(fù)合菌群CS1。通過室內(nèi)發(fā)酵試驗(yàn)，明確了該復(fù)合菌群對(duì)辣椒秸稈的降解效果，為辣椒秸稈的肥料化和資源化利用提供了理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株樣品來源

菌株來自腐熟期的堆肥試驗(yàn)堆樣品（材料以豬糞桑枝為主），取各個(gè)部位均勻混合后采用四分法混合收集樣品。碳氮比為15.51、pH值為9.78、含水量為24.00%、總氮含量為22.09%、總碳含量為22.09%。辣椒秸稈和玉米秸稈來源于長沙附近農(nóng)戶，粉碎后過20目篩備用。所有試驗(yàn)均在中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所（湖南省長沙市芙蓉區(qū)遠(yuǎn)大二路644號(hào)）進(jìn)行，試驗(yàn)時(shí)間為2020年6月至2021年12月。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）-苯胺藍(lán)培養(yǎng)基：馬鈴薯200.00 g/L、葡萄糖 20.00 g/L、瓊脂20.00 g/L、苯胺藍(lán)0.10 g/L，加入 1 L 蒸餾水，115 ℃滅菌30 min，用于真菌的初篩。

（2）LB-苯胺藍(lán)培養(yǎng)基：蛋白胨10.00 g/L、酵母膏5.00 g/L、NaCl 10.00 g/L、瓊脂20.00 g/L、苯胺藍(lán)0.10 g/L，加入1 L蒸餾水，115 ℃滅菌30 min，用于細(xì)菌的初篩。

（3）液態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：堿木質(zhì)素 2.00 g/L、K2HPO4 1.00 g/L、MgSO4·7H2O 0.10 g/L、CaCl2 0.08 g/L、FeSO4·7H2O 0.05 g/L、MnCl2 0.02 g/L、KH2PO4 1.00 g/L、蛋白胨2.00 g/L，用于檢測(cè)木質(zhì)素降解菌的產(chǎn)酶能力。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 木質(zhì)素降解菌的篩選

（1）初篩：將單菌株接種于PDA-苯胺藍(lán)或LB-苯胺藍(lán)培養(yǎng)基，每種菌株設(shè)置3個(gè)平行樣本，在30 ℃恒溫、避光條件下進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)菌樣本培養(yǎng)36 h后進(jìn)行觀察，真菌樣本培養(yǎng)3 d后進(jìn)行觀察，確認(rèn)是否存在褪色圈^［17］。若存在褪色圈，以A值來判斷菌株降解木質(zhì)素的能力，A值越大表明菌株的降解能力越強(qiáng)。A=D/d，其中d代表菌株直徑，D代表變色圈直徑。

（2）復(fù)篩：選取Agt;1的真菌和Agt;3的細(xì)菌作為樣本，接種在液態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng)基上，30 ℃下在180 r/min搖床中分別培養(yǎng)3 d、36 h，然后測(cè)定木質(zhì)素降解酶活力。

1.2.2 酶活力測(cè)定

取發(fā)酵培養(yǎng)液在4 ℃、12 000 r/min 條件下離心10 min，取其上清液作為粗酶液。利用藜蘆醇（VA）氧化法分光光度法、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）氧化法分光光度法和2，6-甲氧基苯酚（2，6-DMP）氧化法分光光度法，分別測(cè)定漆酶（Laccase，Lac）、錳過氧化物酶（Mn-dependent peroxidase，Mnp）、木質(zhì)素過氧化物酶（Lignin Peroxidase，LiP）的活力。酶活性單位（U）分別為 1 min 氧化1 μmol VA、ABTS和2，6-DMP所需酶量^［19］。

1.2.3 木質(zhì)素降解菌的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)觀察：將菌株CB38、CB12、CF53、CF30、CF18、CF5分別接種在PDA培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫避光條件下培養(yǎng)3 d，并觀察菌落形態(tài)特征。

（2）分子生物學(xué)鑒定：按照快速DNA提取試劑盒的說明提取菌株DNA。以提取的DNA為模板，利用真菌、細(xì)菌通用引物對(duì)菌株的18S rDNA或者16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后的產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，并基于比對(duì)結(jié)果構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)發(fā)育樹。

（3）引物序列如下：真菌18S rDNA引物序列為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）；細(xì)菌16S rDNA引物序列為27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR反應(yīng)程序：97 ℃預(yù)變性3 min；97 ℃ 變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次；72 ℃終末延伸10 min。

1.2.3 高效降解木質(zhì)素復(fù)合菌群的構(gòu)建

將互不拮抗的單菌株懸液以等體積隨機(jī)配對(duì)的方式混合，然后按3%接種量接入堿木質(zhì)素液體培養(yǎng)基。在 30 ℃ 恒溫、避光條件下培養(yǎng)，每12 h取1次樣，連續(xù)收集7 d并測(cè)定木質(zhì)素降解酶活性。

采用單因素試驗(yàn)對(duì)復(fù)合菌群的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，初始pH值設(shè)置為7，接種量設(shè)置為3%，培養(yǎng)溫度設(shè)置為 30 ℃。采用控制變量法，在單一條件下分別考察初始pH值（4、5、6、7、8、9）、接菌量（1%、3%、5%、7%、9%）對(duì)于復(fù)合菌群木質(zhì)素降解酶（錳過氧化物酶、過氧化物酶、漆酶酶）活性的影響。根據(jù)復(fù)合菌群的動(dòng)態(tài)變化曲線，在培養(yǎng)第6天時(shí)進(jìn)行取樣測(cè)定。

1.2.4 室內(nèi)發(fā)酵試驗(yàn)

設(shè)置不接菌（C）、單一菌劑（CB12、CF53、CF30、CF18、CF5）、復(fù)合菌劑（CS1）、市售菌劑（EM）共8個(gè)處理，進(jìn)行為期28 d的室內(nèi)發(fā)酵試驗(yàn)。辣椒秸稈和玉米秸稈按照2 ∶1的比例作為發(fā)酵材料，調(diào)節(jié)含水量至55%～65%。每個(gè)處理組稱取30 g混勻后的材料置于500 mL錐形瓶中，115 ℃滅菌30 min，烘干后按照處理組分別接種3%的菌液。接種后，用紗布包裹瓶口，在 30 ℃ 下避光培養(yǎng)28 d。

試驗(yàn)前和結(jié)束時(shí)，利用范氏（Van Soest）洗滌分析法測(cè)定辣椒秸稈的木質(zhì)素、纖維素含量，并計(jì)算降解率。同時(shí)，利用掃描電子顯微鏡觀察試驗(yàn)結(jié)束時(shí)秸稈的結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用IBM SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。運(yùn)用Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 木質(zhì)素降解菌的產(chǎn)酶能力

經(jīng)過苯胺藍(lán)培養(yǎng)基培養(yǎng)，篩選了具有木質(zhì)素降解能力的11株真菌和7株細(xì)菌（表1）。酶活性測(cè)定結(jié)果表明，18株菌株的木質(zhì)素降解酶活性存在顯著差異。其中，菌株CB38、CB12、CF30的Lip活性顯著高于其他菌株，分別為8.41、6.59、6.32 U/L。菌株CF18、CB12、CF30的Mnp活性均顯著高于其他菌株，分別為1.08、0.97、0.95 U/L。另外，菌株CF18和CF5的Lac活力顯著高于其他菌株，分別為10.20、10.04 U/L（圖1）。經(jīng)過比較，篩選出6株具有較高木質(zhì)素降解酶活性的菌株，分別為CB38、CB12、CF53、CF30、CF18、CF5。

2.2 木質(zhì)素降解菌的鑒定

這6株菌株具有各自獨(dú)特的形態(tài)特征（圖2-a）和分子水平（圖2-b）。菌株CB38在培養(yǎng)基上呈現(xiàn)米黃色不透明鋸齒狀的圓形菌落，其序列與Bacillus altitudinis（高地芽孢桿菌）具有高達(dá)99%的同源性。菌株CB12與Achromobacter（無色桿菌屬）的同源性超過99%，在培養(yǎng)基上呈現(xiàn)米黃色透明整齊的圓形菌落。菌株CF53生長緩慢，表面無菌絲，孢子為綠色，其序列與Cladsporium sp.（枝孢霉屬）具有99%的同源性。菌株CF30具有白色棉絮狀菌絲，邊緣呈現(xiàn)波紋狀，其序列與Myrothecium（漆斑菌屬）的同源性超過97%。菌株CF18的菌落呈圓形，菌絲生長較為稀疏、顏色為米色，產(chǎn)綠色孢子，其序列與Trichoderma harzianum（哈茨木霉菌）的同源性為97%以上。而菌株CF5的菌落為毛茸茸的白色網(wǎng)狀圓形狀態(tài)，不產(chǎn)孢子，其序列與Bjerkandera（煙管菌屬）具有98%以上的同源性。

2.3 最優(yōu)木質(zhì)素降解菌群的確定

2.3.1 復(fù)合菌群的組成 表2中數(shù)據(jù)顯示，篩選出的木質(zhì)素降解菌株之間不存在拮抗關(guān)系。因此，根據(jù)最小復(fù)合菌群體系的構(gòu)建方法 將這6種菌株進(jìn)行隨機(jī)組合^［20］。共組成6組復(fù)合菌群，編號(hào)分別為CS1、CS2、CS3、CS4、CS5、CS6（表3）。

2.3.2 復(fù)合菌群的產(chǎn)酶能力

不同菌群木質(zhì)素降解酶活性變化趨勢(shì)相同，所有菌群Lip和Mnp活性都呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢(shì)，而Lac活性整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。此外，所有菌群木質(zhì)素降解酶活性均在第6天達(dá)到峰值（圖3）。

取菌群最佳酶活性值點(diǎn)，與單一菌株最高酶活性值作為對(duì)照進(jìn)行比較。結(jié)果表明，6組復(fù)合菌群的Mnp最佳活性值均低于Lip和Lac。其中，菌群CS1的Lip和Lac最佳酶活性值顯著高于其他復(fù)合菌群，分別為7.99、8.74 U/L，較單一菌株分別提高了56.52%、35.15%，其中CS1的Lip活性是單一菌株的1.71倍。然而，復(fù)合菌群CS2、CS3、CS4、CS5的木質(zhì)素降解酶活性值反而低于單一菌株（圖4）。以上結(jié)果表明，菌群CS1具有較高的木質(zhì)素降解酶活性，而其他復(fù)合菌群的酶活性并不理想。因此，后續(xù)研究將僅針對(duì)構(gòu)成菌群CS1的單一菌株以及菌群CS1進(jìn)行辣椒秸稈降解效果探究。

2.3.3 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

菌群CS1的木質(zhì)素降解酶活性受培養(yǎng)條件影響（圖5）。隨著pH值的升高，菌群CS1的木質(zhì)素降解酶活性先升高后下降，在初始pH值為7時(shí)木質(zhì)素降解酶活性達(dá)到最高，其Mnp、Lip、Lac的活性分別為0.95、6.42、8.27 U/L。這表明偏酸或偏堿的條件對(duì)于菌群CS1的酶活性影響較大（圖5-b）。

另外，在接種量大于3%后，菌群CS1的木質(zhì)素降解酶活性出現(xiàn)了顯著降低的情況。在接種量為3%時(shí)，菌群CS1的Mnp、Lip、Lac活性分別達(dá)到了1.24、8.82、9.09 U/L（圖5-a）。

2.4 最優(yōu)菌群CS1的辣椒秸稈降解效果

在對(duì)照組、單一菌劑處理和復(fù)合菌劑處理間，辣椒秸稈中木質(zhì)素的降解效果存在顯著差異（圖6）。對(duì)照組辣椒秸稈中木質(zhì)素的降解率僅為4.4%。在單一菌劑處理組中，木質(zhì)素降解率由大到小依次是CF5、CF30、CF18、CF53、CB12，分別為26.8%、24.6%、23.2%、18.9%、13.9%，顯著高于對(duì)照組（Plt;0.05）。這一結(jié)果表明，單一菌株對(duì)辣椒秸稈中木質(zhì)素的降解具有促進(jìn)作用。菌群CS1處理后辣椒秸稈中木質(zhì)素的降解率為40.33%，是菌株CF5的1.51倍，顯著高于其他處理（Plt;0.05）。與單菌株相比，菌群CS1對(duì)木質(zhì)素的降解率提高了13.57%，同時(shí)對(duì)纖維素的降解率也有所提高。與市售菌劑相比，菌群CS1的木質(zhì)素降解率提高了15.97%，纖維素降解率降低了7.5%。這一結(jié)果表明菌群CS1在促進(jìn)辣椒秸稈中木質(zhì)素降解方面的效果顯著，且優(yōu)于市售菌劑。

在電子顯微鏡觀察下，對(duì)照組、菌群CS1處理組、EM菌劑處理組的辣椒秸稈表面結(jié)構(gòu)存在顯著差異（圖7）。在對(duì)照組中，辣椒秸稈表面平坦光滑，木質(zhì)素以平行的方式緊密排列。而在菌群EM處理組中，辣椒秸稈表面呈現(xiàn)疏松狀態(tài)，內(nèi)部存在碎片化跡象，部分木質(zhì)素已發(fā)生降解。而在菌群CS1處理組中，辣椒秸稈表面存在微生物定殖的情況，木質(zhì)素被大量破壞，產(chǎn)生了大范圍的空腔。經(jīng)過EM菌劑和復(fù)合菌群CS1處理后，均能破壞木質(zhì)素形成的天然屏障，使易降解的物質(zhì)暴露出來，進(jìn)而促進(jìn)辣椒秸稈的發(fā)酵。

3 討論與結(jié)論

在好氧堆肥過程中，存在大量能夠降解木質(zhì)素的微生物，且與白腐菌、褐腐菌等常見木質(zhì)素降解菌相比，能更好地適應(yīng)辣椒秸稈肥料化過程中多變的環(huán)境條件。微生物主要通過胞外酶來降解木質(zhì)素，其降解能力與酶活性呈正相關(guān)關(guān)系^［21-23］。因此，通過測(cè)量酶活性，可以反映出微生物的分解能力。本研究發(fā)現(xiàn)，Trichoderma harzianum（哈茨木霉）CF18和Bjerkandera（煙管菌）CF5是堆肥過程中降解木質(zhì)素能力最強(qiáng)的菌株，主要通過分泌Lac來降解木質(zhì)素。同時(shí)，土壤中的哈茨木霉菌也具有產(chǎn)Lac能力和較強(qiáng)的木質(zhì)素降解能力^［14］。而在汪文強(qiáng)等的試驗(yàn)中煙管菌主要通過分泌Mnp降解木質(zhì)素，這可能與菌株產(chǎn)酶時(shí)的生存環(huán)境有關(guān)^［24］。此外，本研究發(fā)現(xiàn)Bacillus altitudinis CB38（高地芽孢桿菌）具有較高的Lip酶活性。但是，Bacillus altitudinis CB38參與構(gòu)成的復(fù)合菌群木質(zhì)素降解酶活性降低，與前人的結(jié)果存在一定差異^［25］。這可能是因?yàn)椴糠志甑拇x產(chǎn)物抑制了木質(zhì)素降解酶活性，后續(xù)可以通過代謝組學(xué)的手段，研究菌株代謝產(chǎn)物對(duì)木質(zhì)素降解酶生成過程的影響^［26］。16S rDNA測(cè)序結(jié)果表明，無色桿菌是腐爛木材木質(zhì)素降解菌群的主要優(yōu)勢(shì)菌屬之一^［27］，本研究的結(jié)果與之相符。最后，本研究還在堆肥中發(fā)現(xiàn)了Myrothecium（漆斑菌）CF30和Cladsporium（枝孢霉菌）CF53這2種具備較強(qiáng)木質(zhì)素降解能力的菌種。特別是Cladsporium CF53，它還具備降解纖維素的能力，這與前人的研究結(jié)果^［28-29］一致。

本研究構(gòu)建了6種復(fù)合菌群，其中復(fù)合菌群CS1是本研究構(gòu)建的最優(yōu)菌群，包含1種細(xì)菌（Achromobacter CB12）和4種真菌（Bjerkandera CF5、Trichoderma harzianum CF18、Myrothecium CF30、Cladsporium CF53）。所有菌群的木質(zhì)素降解酶活性都在第6天左右達(dá)到峰值，與前人的研究展現(xiàn)了相似的趨勢(shì)^［29］。pH值和溶氧量是菌株酶活性出現(xiàn)峰值的重要因素，木質(zhì)素降解前期產(chǎn)生了NH3導(dǎo)致pH值升高并逐漸達(dá)到菌株最佳生長條件，這一過程中菌株產(chǎn)酶能力隨之上升，而隨后菌株數(shù)量的增長引起了培養(yǎng)液中溶氧量和營養(yǎng)物質(zhì)的減少從而導(dǎo)致酶活性降低^［30］。在單因素試驗(yàn)中 也發(fā)現(xiàn)pH值會(huì)對(duì)復(fù)合菌群的木質(zhì)素降解酶活性造成較大影響，這可能與菌群自身的最佳生長條件有關(guān)。同時(shí)，所有菌群Mnp活性較低，可能是因?yàn)橐詨A木質(zhì)素為碳源的液態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng)基和生長條件使得菌株更偏向于產(chǎn)Lip和Lac^［30］。本研究中菌群CS1的木質(zhì)素降解酶活性是單一菌株的1.2倍，但其他菌群的木質(zhì)素降解酶活性反而低于單菌株?？赡苁且?yàn)榻M合菌群的次生代謝產(chǎn)物存在差異，部分次生代謝會(huì)抑制酶活性，從而導(dǎo)致了這一結(jié)果的產(chǎn)生^［25］。

本研究結(jié)果表明，無論是單菌株還是復(fù)合菌群，均具有降解辣椒秸稈的能力。其中，復(fù)合菌群CS1的降解效果比單一菌株高出1.51倍，這進(jìn)一步驗(yàn)證了不同菌種之間酶系互補(bǔ)、相互促進(jìn)的重要性^［31］。這種優(yōu)勢(shì)使得復(fù)合菌群在辣椒秸稈發(fā)酵和肥料化過程中更具效率。然而，本研究中菌株的木質(zhì)素降解酶活性較低，初步的單因素試驗(yàn)表明，初始培養(yǎng)條件可能是導(dǎo)致這一結(jié)果的關(guān)鍵因素。此外，本研究還觀察到菌群CS1能在辣椒秸稈表面形成生物膜，這有助于破壞辣椒秸稈的細(xì)胞壁，增加其表面空隙，從而增大菌株與木質(zhì)素、纖維素等物質(zhì)的接觸面積。復(fù)合菌群CS1主要通過產(chǎn)生Lip和Lac來氧化木質(zhì)素中的酚類物質(zhì)和非酚類物質(zhì)間的化學(xué)鍵，破壞木質(zhì)素組成的天然屏障，進(jìn)一步促進(jìn)纖維素的降解，進(jìn)而提高辣椒秸稈的發(fā)酵過程和肥料化效果。

由于不同秸稈中木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)和致密性存在差異，導(dǎo)致秸稈的降解效果存在一定的差異。因此，本研究中菌群對(duì)辣椒秸稈的降解效果與梅新蘭等的結(jié)果^［32］存在一定差異。在木質(zhì)素降解過程中，細(xì)菌和真菌具有?；浴Ｅc市面在售的菌劑EM相比，復(fù)合菌群CS1對(duì)木質(zhì)素的降解率提高了16%，但纖維素的降解效果不如市售菌劑。這表明復(fù)合菌群CS1對(duì)木質(zhì)素具有一定的選擇性。

本研究結(jié)果表明，從腐熟期堆肥材料中篩選了木質(zhì)素降解菌株：無色桿菌CB12、芽孢桿菌CB38、煙管菌CF5、哈茨木霉CF18、漆斑菌CF30以及枝孢霉菌CF53?；谶@些菌株，構(gòu)建了復(fù)合菌群CS1。復(fù)合菌群CS1的構(gòu)建能顯著提升木質(zhì)素降解酶的活性，并進(jìn)一步提高辣椒秸稈的降解效率。

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