牛肉中三種β-受體激動劑的質(zhì)譜檢測方法

張睿泓，張成成，張炳玨，王成艷，馬永順，王昕澤，杜光光，李海霞*

（1.長春市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，長春 130000；2.杭州譜育科技發(fā)展有限公司，杭州 310000）

β-受體激動劑藥物，屬于腎上腺素類的合成藥物[1]，于90年代末流入我國，廣泛用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)中，此類藥物并非自然產(chǎn)物，而是人工合成的化學(xué)藥物[2]。它們的主要作用是促進畜禽快速生長，并顯著提高瘦肉率。但因為此類藥物在動物體內(nèi)代謝慢，殘留時間長，人類長期食用后可能引起心悸、惡心并可伴有肌肉震顫等中毒癥狀，對人類健康構(gòu)成嚴重危害[3]，因此全世界各個國家均將其列為禁用藥物。至今，主要有氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測技術(shù)GC-MS[4-5]、酶標抗體法ELISA[6-7]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)HPLC-MS/MS[8-10]等檢測方法，但這些方法大多存在樣品提取凈化過程復(fù)雜、成本高、再現(xiàn)性差等缺陷，另有一些檢測方法雖然提取過程簡單但是存在樣品假陽性率高的問題，不適用于準確定量檢測。因此，本方法以現(xiàn)有國家標準為基準，優(yōu)化檢測方法，不僅高效準確的完成檢測過程，更能減少有機試劑的用量，安全環(huán)保，更好的滿足牛肉樣品的大批量檢驗檢測要求。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與供試材料

乙腈、甲酸、正己烷、乙酸純度均為色譜純；沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺濃度均為1 000 mg/L；萊克多巴胺-D6、沙丁胺醇-D3、克倫特羅-D9 濃度均為100 mg/L。購買來源：上海安譜有限公司。QC樣品：稱?。?0±0.01）g牛肉新鮮樣品，攪碎至均勻糜狀，冷凍保存。

1.2 主要儀器設(shè)備

EXPEC 5210 超高效液相—三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（杭州譜育科技發(fā)展有限公司）、真空脫氣機、自動進樣器、二元泵、柱溫箱、AL104-IC 型分析天平、H1750R 型高速臺式冷凍離心機、EOFO-945617型渦旋混合器、N-EVAP112型氮吹儀、NL1E-63型超聲清洗機。

1.3 試驗過程

1.3.1 標準曲線的配置

精確量取三種目標物混合標準溶液及其對應(yīng)內(nèi)標混合標準溶液，經(jīng)0.1%甲酸水稀釋至1.0～50.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)的標準工作液。

1.3.2 目標物提取

準確稱量（2.00±0.01）g 均勻試樣置于50 mL 離心管中，加入內(nèi)標標液，混勻，靜置30 min，加10 mL 0.1%乙酸乙腈溶液，震蕩混勻，再超聲提取，高速離心5 min（轉(zhuǎn)速為：10 000 r/min），40℃，取全部上清液氮氣吹干，加入4 mL 水以飽和正己烷，渦旋混勻，繼續(xù)加0.5 mL 0.1%甲酸水溶液，劇烈震蕩，取水層經(jīng)濾膜凈化后，待測。

1.3.3 色譜和質(zhì)譜條件

1.3.3.1 液相色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18 分離分析柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；柱溫：40℃；流動相A：0.1%甲酸水；B：乙腈；柱流速：0.4 mL/min，進樣量：10 μL；洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表

1.3.3.2 質(zhì)譜條件 依據(jù)廠商推薦及進一步優(yōu)化后設(shè)定質(zhì)譜條件，具體參數(shù)見表2

表2 正離子模式下三種β-受體激動劑的MRM參數(shù)（ESI+）

1.3.3.3 特征離子色譜圖和定量離子對 圖1中a、b和c為1 ng/mL 的克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇以及對應(yīng)內(nèi)標定量離子流色譜圖，圖2分別為3種β-受體激動劑的兩個選擇離子質(zhì)譜圖。

圖1 定量色譜圖

圖2 三種β-受體激動劑的2種選擇性離子質(zhì)譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍、檢出限和定量限

用0.1%甲酸水準確配置標準序列曲線濃度，經(jīng)儀器檢驗分析，采用空白基質(zhì)添加標準溶液的方法，結(jié)果見表3。

表3 三種β-受體激動劑的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、LOD和LOQ

2.2 回收率和精密度

分別向牛肉樣品添加3水平的混合標準溶液。并重復(fù)測定6次，內(nèi)標法定量。回收率和相對標準偏差（RSD）見表4。最后得出克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的回收率依次為92.2%～105.7%、94.3%～107.9%和92.2%～102.3%，回收率范圍均在60%～120%之間，重復(fù)測定下計算精密度結(jié)果具體為1.1%～4.2%、2.2%～3.7%和1.7%～3.0%，完全滿足標準GB/T 27417-2017[11]中對于準確度的相關(guān)要求，同時對質(zhì)控樣品進行試驗分析，所得結(jié)果見表5。結(jié)果表明，質(zhì)控樣品結(jié)果均在特性值區(qū)間內(nèi)，回收率滿足檢驗要求，依次判斷檢測方法可靠，有效。

表4 三種目標物在牛肉中的加標回收率和精密度

表5 質(zhì)控樣品檢測結(jié)果

3 討 論

3.1 樣品處理與儀器條件的優(yōu)勢

本方法選用0.1%乙酸乙腈溶液為提取液，高速離心振蕩提取。與傳統(tǒng)方法相比，省去過凈化柱這一步驟，在節(jié)省試劑耗材成本的同時縮短了檢驗時間，提高了檢測效率。對HPLC-MS/MS 色譜條件進行優(yōu)化，以0.1%甲酸水溶液和乙腈為流動相，通過系統(tǒng)優(yōu)化后目標物均在7 min內(nèi)檢測完畢，有效縮短檢驗時間，減少有機試劑的使用，從而減少了對環(huán)境的污染。

3.2 前處理過程注意要點

選用水飽和正己烷作為去脂溶液，且為了避免復(fù)溶后樣品乳狀嚴重的問題，需要注意應(yīng)先加入水飽和正己烷混勻后再加入復(fù)溶液的方法。此方法不僅復(fù)溶液雜質(zhì)更少，又能避免乳狀物的形成，進一步縮短了檢驗時間。

4 結(jié) 論

本試驗創(chuàng)建了一套檢測牛肉中β-受體激動劑的快速分離方法，該方法精簡了前處理提取步驟、優(yōu)化了色譜和質(zhì)譜條件，最終得到了較為高效、便捷靈敏、可靠、準確的樣品分析檢驗方法，該方法有助于提升牛肉產(chǎn)品的安全性，避免因殘留超標而對消費者健康造成潛在威脅。