牛腸道大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

鄭啟銘，梁纖纖，李曉卓，李 月，劉文鍇，韓翔舒，馮繼紅，翟少華*，夏 俊*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830000；2.新疆草食動物新藥研究與創(chuàng)制自治區(qū)重點實驗室，烏魯木齊 830000；3.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所/新疆畜牧科學(xué)院動物臨床醫(yī)學(xué)研究中心，烏魯木齊 830000；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草食動物疫病防控重點實驗室（省部共建），烏魯木齊 830000；5.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832061；6.新疆維吾爾自治區(qū)呼圖壁縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，新疆 昌吉 831100）

細菌性疾病引起的犢牛腹瀉，其多數(shù)由大腸桿菌、沙門氏菌、彎曲桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等腸道致病菌引起[1]，其中大腸桿菌是引起腹瀉的主要病原菌。犢牛大腸桿菌病又稱犢牛白痢，在臨床上是一種常見疾病，一年四季均可發(fā)生，一般在氣溫多變的冬末春初發(fā)病率較高。感染途徑主要是通過消化道，子宮和臍帶。該病一旦發(fā)生，病死率很高，有時可達100%，牛羊發(fā)病時呈地方流行性[1]。犢牛感染后主要臨床表現(xiàn)為體溫升高、腹瀉、脫水等急性腸炎癥狀。腹瀉糞便的狀態(tài)多變，有腐臭味，且會黏附在犢牛尾部和后肢。病牛精神沉郁，繼而發(fā)生脫水和酸中毒[2]。輕度感染的犢?？赡茏杂?，嚴重感染的犢牛如果不及時治療，幾天內(nèi)就會死亡。

大腸桿菌根據(jù)致病性分型為腸致病性大腸埃希菌（EPEC）、產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌（STEC）、產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌（ETEC）、腸聚集性大腸埃希菌（EAEC）、腸出血性大腸埃希菌（EHEC）、侵襲性大腸埃希菌（EIEC）等[3]。各種致病類型的大腸桿菌中的毒素和黏附素等毒力因子是導(dǎo)致牛發(fā)生腹瀉等癥狀的主要原因。黏附素性菌毛是產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌特有的一類菌毛，主要包括K88（F4）、K99（F5）、987P（F6）及F41，其中以K99 和F41 最為常見[4]。本研究對新疆昌吉地區(qū)某牛場腹瀉犢牛的分離菌株進行致病性試驗、耐藥性分析，為該地區(qū)牛場治療犢牛腹瀉提供用藥依據(jù)，同時為該地區(qū)致病性大腸桿菌的進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

采自新疆昌吉市某牛場腹瀉犢牛糞便樣品（包括稀便、血便），共30份。

1.1.2 主要試劑

BHI 液體培養(yǎng)基、馬丁肉湯瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒、DL2000 核酸Marker、200 μL 移液器、100 μL 移液器、10 μL 移液器、藥敏紙片。50×TAE 電泳液按本實驗室常規(guī)方法配置，1×TAE：用規(guī)格100 mL 的量筒稱取20 mL 的50×TAE，再加入980 mL 的蒸餾水混勻，使其稀釋到1×TAE備用。

1.1.3 試驗動物

清潔級昆明雄鼠10 只，35 日齡，體重大致在22～25 g，購自新疆疾病預(yù)防與控制中心實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離

將每份糞便樣品加入5 mL BHI 液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后，采用固體平板劃線法將菌液接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基中，經(jīng)37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)后，挑取粉紅色單菌落接種于5 mL BHI液體培養(yǎng)基進行純化，置于37 ℃恒溫搖床培養(yǎng)18 h并觀察細菌生長情況。

1.2.2 革蘭氏染色及鏡檢

移液器取適量純化培養(yǎng)后的細菌培養(yǎng)液，依據(jù)革蘭氏染色試劑盒的染色步驟進行革蘭氏染色，染色完成后經(jīng)顯微鏡鏡檢觀察細菌形態(tài)特征。

1.2.3 細菌及毒力基因鑒定

1.2.3.1 引物設(shè)計與合成 參考文獻進行設(shè)計引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物合成后按照所提供的引物合成單進行各引物稀釋，將上、下游引物稀釋成10 μM濃度，稀釋完后將其置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｒ镄蛄幸姳?。

表1 引物列表

1.2.3.2 PCR 擴增 使用大腸桿菌鑒定引物用于PCR 鑒定，經(jīng)鑒定為大腸桿菌后再使用K88、K99、F41 毒力基因引物進行PCR 鑒定。采取25 μL 的常規(guī)反應(yīng)體系，上、下游引物各1 μL，2×Taq MasterMix12.5 μL，模板1 μL，水9.5 μL，瞬離后混勻置于PCR擴增儀中進行PCR擴增。擴增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，之后94 ℃循環(huán)變性30 s，退火溫度為58 ℃，復(fù)性20 s，72 ℃延伸1 min，共進行30個循環(huán)，72 ℃終延伸5 min，最后于4 ℃保存。

1.2.4 致病性試驗

10 只小鼠隨機分為試驗組及對照組，每組5 只。試驗組小鼠腹腔注射分離菌株菌液，每只0.2 mL；對照組小鼠腹腔注射無菌PBS，每只0.2 mL。

1.2.5 藥敏試驗

采用K-B 紙片法對分離菌株進行抗菌藥物敏感試驗。用移液器吸取200 μL 細菌培養(yǎng)液，之后均勻涂布于馬丁肉湯瓊脂培養(yǎng)基上，待吸收完全后，將藥敏片等距放置于培養(yǎng)基上進行藥敏試驗。于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)18 h后判定其結(jié)果，藥敏結(jié)果判定按CLSI標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離

細菌在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上為邊緣整齊、表面光滑的圓形或橢圓形粉紅色菌落，見圖1。革蘭氏染色鏡檢可見單個存在的紅色革蘭氏陰性短桿菌，見圖2。

圖1 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果

圖2 革蘭氏染色鏡檢圖片（100×）

2.2 細菌及毒力基因鑒定

進行大腸桿菌及毒力基因的PCR檢測后，結(jié)果顯示有效擴增出大小為200 bp和543 bp的目的條帶，見圖3、圖4，分離菌株為攜帶毒力基因K99的大腸桿菌。

圖3 細菌大腸桿菌PCR鑒定結(jié)果

圖4 細菌毒力基因PCR鑒定結(jié)果

2.3 致病性試驗

試驗組小鼠腹腔注射菌液4 h后，陸續(xù)開始出現(xiàn)精神沉郁、排黏液性糞便、被毛粗亂等癥狀，12 h后開始陸續(xù)死亡。對照組5只全程健康狀況良好，無死亡。

2.4 藥敏試驗

藥敏試驗結(jié)果顯示，該分離株對多黏菌素B 中介；對青霉素、氨芐西林、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢哌酮、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、四環(huán)素、阿奇霉素、克林霉素、氯霉素、氟苯尼考、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星等抗菌藥物耐藥，見表2、圖5、圖6。

圖5 藥敏試驗1

圖6 藥敏試驗2

表2 藥敏試驗結(jié)果

3 討 論

犢牛腹瀉是基層牛場常見的流行病，多發(fā)于冬末春初等氣溫多變的季節(jié)。根據(jù)犢牛腹瀉的發(fā)病原因及發(fā)病特點，可將其分為消化不良腹瀉與傳染性腹瀉。消化不良性腹瀉常呈現(xiàn)散發(fā)性，一般出現(xiàn)一過性腹瀉，對牛場養(yǎng)殖不會造成較大的損失。傳染性腹瀉又可分為病毒性腹瀉、細菌性腹瀉、寄生蟲性腹瀉以及混合感染性腹瀉。其中較常引起細菌性腹瀉的病菌包括大腸桿菌、沙門氏菌、彎曲桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等腸道致病菌[5]。這些致病菌中，大腸桿菌為引起犢牛腹瀉最主要的致病菌。以產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌最為常見，導(dǎo)致犢牛發(fā)生腹瀉的原因主要為產(chǎn)腸毒素大腸桿菌所攜帶的毒素及黏附素基因，主要包括K88（F4）、K99（F5）、987P（F6）及F41，其中以K99 和F41 最為常見[6]。此次在牛源腹瀉糞樣中檢出的E.coli攜帶的毒力因子為K99，通過致病性試驗結(jié)果表明此次分離菌株有致病性。

對本次分離出的K99 菌毛大腸桿菌進行藥物敏感試驗，結(jié)果顯示該分離菌株對青霉素、氨芐西林、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢哌酮、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、四環(huán)素、阿奇霉素、克林霉素、氯霉素、氟苯尼考、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星等抗菌藥物均耐藥。以上十七種抗菌藥物涉及八類，但均顯示不同程度的耐藥。該分離菌株只對多黏菌素b 中介。楊艷麗[7]等研究發(fā)現(xiàn)新疆地區(qū)牛源E.coli 對喹諾酮類藥物諾氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星均產(chǎn)生不同程度的耐藥性。許淑蕓[8]等的研究顯示石河子地區(qū)牛源E.coli 對β-內(nèi)酰胺類藥物頭孢唑林、阿莫西林、青霉素、頭孢他定等抗生素耐藥性較高。郭慶勇[9]等的研究顯示伊犁某牛場的糞源大腸桿菌不同生長階段均對氨基糖苷類及β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。本試驗檢測分離的E.coli 也對各類抗菌藥物表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，與三人的研究結(jié)果基本一致，同時對四環(huán)素類、林可酰胺類及大環(huán)內(nèi)酯類同樣存在耐藥性，這一現(xiàn)象可能是由于該地區(qū)牛場使用這些抗菌藥物較多。本次分離菌株的耐藥性試驗可為該牛場犢牛細菌性腹瀉防控工作提供用藥選擇依據(jù)，并為制定合理的抗菌治療方案提供參考。

綜上所述，在防控細菌流行病時，由于抗菌藥物濫用易導(dǎo)致致病菌耐藥性增加從而給牛場防控疫病的工作開展造成困難。在治療細菌流行病時，應(yīng)根據(jù)細菌藥敏試驗結(jié)果選擇有效抗菌藥物[10]，并且制定合理的治療方案，杜絕無理論依據(jù)和臨床指癥的抗菌治療。目前市面上已經(jīng)有效果較好的大腸桿菌疫苗及K99滅活苗，在防控大腸桿菌腹瀉病時可選擇滅活苗，有效做到未病先防。

4 結(jié) 論

本次從該牛場分離到的攜帶K99 毒力基因的大腸桿菌菌株，對小鼠有一定的致病力，并且藥物敏感試驗結(jié)果表明其對青霉素、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢哌酮、鏈霉素等多種抗菌藥物耐藥。提示該地區(qū)導(dǎo)致犢牛腹瀉的大腸桿菌耐藥嚴重，防治過程中應(yīng)根據(jù)藥物敏感試驗結(jié)果選藥，并規(guī)范使用。此外，也提示大腸桿菌疫苗的開發(fā)或引進作為防控犢牛大腸桿菌病的另一個途徑應(yīng)該得到重視。