中山地區(qū)血小板抗體及特異性分布調(diào)查

林惠燕 吳泳倫 孫愛農(nóng) 方育如 陳前英 李喬 王玉玨 王紅梅 楊志釗簡曉毅 許先國 段生寶

（1.中山市中心血站，廣東 中山 528400；2.中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所；3.中山市人民醫(yī)院；4.中山市博愛醫(yī)院；5.浙江省血液中心）

血小板表面具有復(fù)雜的血型抗原，如紅細胞血型抗原（ABH抗原等）、人類白細胞抗原（HLA）、血小板同種異體抗原（HPA）和CD36 抗原以及其它糖蛋白（GP）抗原[1-3]。CD36又稱糖蛋白GPIV，由于其表面的抗原眾多且復(fù)雜，因此反復(fù)大量輸注血小板的患者產(chǎn)生血小板同種抗體的頻率比紅細胞產(chǎn)生同種抗體的頻率高幾十倍。對于患有血小板數(shù)量減少和血小板功能缺陷所致疾病的患者來說，血小板輸注是1種具有良好效果的治療方法，但在多次輸注血小板后，患者容易產(chǎn)生血小板抗體，引起血小板輸注無效（platelet transfusion refractoriness，PTR）的發(fā)生[2-4]。導(dǎo)致血小板輸注無效的因素包括非免疫性因素和免疫性因素，非免疫性因素是由感染、發(fā)熱、脾腫大等，免疫性因素大多是由于體內(nèi)產(chǎn)生了血小板相關(guān)抗體和/或血小板特異性抗體，患者輸注的血小板會被破壞和快速清除，導(dǎo)致血小板輸注無效的發(fā)生[5]。目前國內(nèi)外關(guān)于抗-CD36的報道較少，主要發(fā)生于PTR 及胎兒/新生兒同種免疫血小板減少癥（FNAIT）患者，獻血者抗-CD36 報道較罕見，但目前已有建立CD36 陰性血小板供者庫的研究報道[6]。在血小板相關(guān)抗體中，除了抗-HLA和未知特異性HPA 抗體，最常見的血小板抗體是抗-CD36，它是誘導(dǎo)免疫性血小板異常性疾病的重要危險因素[7]。我們通過對當(dāng)?shù)厝巳哼M行血小板抗體篩查和鑒定，研究了獻血者與患者人群中血小板抗體發(fā)生的頻率和種類，分析了對患者進行血小板交叉配型（platelet crossmatch，PXM）實驗的可行性，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

隨機選取2021年4月—2022年8月，來自中山市中心血站的無償獻血者1 049 名，平均年齡36歲，中位數(shù)40.3歲，男性542人、女性507人；選取與獻血者同一個時段中山市2 所醫(yī)院（市人民醫(yī)院、博愛醫(yī)院）的患者598 名（主要為輸注血小板或紅細胞患者），平均年齡50.6 歲，中位數(shù)53 歲，男性278 人、女性320 人；所有標(biāo)本均為靜脈血（EDTAK2抗凝），5 mL/人，4℃儲存，血站獻血者血液檢測、醫(yī)院交叉配血及其它血液檢測，均在4 d內(nèi)完成。

1.2 試劑與儀器

抗-HPA、抗-CD 36、抗-HLA 固相免疫吸附法（SPIA）檢測試劑盒（中科院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，批號：20210302、20221001）；PE-抗-IgG（Biolegend 公司，批號：B286438、403503）；PakPlus 和Pak-Lx血小板抗體鑒定試劑（Immucor公司，批號：3012777、3012305、3012026）；抗-CD36 陽性對照2份，分別由廣州血液中心和南寧市中心血站提供；血小板懸液制備用單采血小板由中山市中心血站提供。LSR Fortessa 流式細胞儀（BD 公司），Luminex 200 多功能流式點陣儀（Luminex 公司），iEMS孵育箱（Thermo公司），HYDROSPEED 洗板機和Sunrise 酶標(biāo)儀（Tecan 公司），KA-2200 和4200平板離心機（久保田公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本處理

1）血漿標(biāo)本制備：獻血者和患者標(biāo)本經(jīng)1 500×g 離心5 min，取上清進行血小板抗體檢測和PXM。2）血小板懸液制備：獻血者單采血小板用血小板稀釋液作5～10倍稀釋為（100～150）?109/L的懸液，置于室溫（20～25°C）保存并在8 h內(nèi)用于PXM。

1.3.2 血小板抗體篩查

采用SPIA法檢測。

1.3.3 血小板抗體復(fù)查

首先采用SPIA 法復(fù)查，其次再使用流式細胞術(shù)（flow cytometry,FCM，又稱流式細胞法）對19 份血漿量充足的標(biāo)本進行復(fù)查。

1.3.4 血小板抗體鑒定

采用FCM復(fù)查后，因?qū)嶒灪膿p有3份標(biāo)本血漿量不足，最終對16 份標(biāo)本采用ELISA 法進行了抗體鑒定。

1.3.5 抗-CD36再鑒定

對血小板抗體鑒定為抗-CD36 陽性的先證者標(biāo)本，由廣州血液中心和南寧中心血站采用ELISA法（PakPlus試劑）檢測以及浙江省血液中心采用流式細胞法（Pak-Lx 試劑）做2 次重復(fù)檢測，完成抗-CD36鑒定。

1.3.6 PXM

將8～16份單采血小板按1.3.1節(jié)方法獲得血小板懸液，分別包被到SPIA試劑盒相應(yīng)的微量孔中，再加入獻血者或患者血漿進行交叉配型。相容性的配型率=相合供者數(shù)/供者總數(shù)。配型標(biāo)本來源為上述醫(yī)院提供的14 份血小板抗體（非抗-CD36）陽性且血小板輸注無效患者標(biāo)本。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 26.0分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料采用百分比（%）表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血小板抗體篩查結(jié)果 見表1。

表1 獻血者與患者血小板抗體篩查結(jié)果Table 1 Platelet antibody screening results of blood donors and patients

2.2 血小板抗體復(fù)查

獻血者篩查陽性的6 份標(biāo)本均為陽性?；颊吆Y查陽性的49份標(biāo)本SPIA復(fù)查全部陽性?；颊吆Y查陽性且血漿量充足的標(biāo)本19份用FCM復(fù)查陽性18 份、陰性1 份，陽性符合率95%。血小板抗-CD36 FCM檢測結(jié)果見圖1。

圖1 血小板抗-CD36 FCM檢測結(jié)果Figure 1 Detection results of platelet anti-CD36 by FCM method

2.3 血小板抗體鑒定

獻血者篩查陽性的6 份標(biāo)本中5 份為HLA Ⅰ抗體占83%（5/6），1份為抗-CD36（GPIV）占17%（1/6），這份標(biāo)本FCM 檢測抗-CD36效價2，為CD36 Ⅰ型缺失。獻血者中抗-CD36 人群發(fā)生率為0.10%（1/1 049）?；颊叱鹾Y陽性且血漿足量的16份標(biāo)本進行了抗體鑒定，ELISA檢測2份陰性，14份陽性，陽性符合率88%（14/16）。14 份ELISA 陽性標(biāo)本中，2 份抗-GPⅡb/Ⅲa，1 份抗-GP Ⅰa/Ⅱa，8 份抗-HLA Ⅰ，3 份為混合抗體（抗-HLA Ⅰ和抗-GP Ⅱb/Ⅲa、GPⅠa/Ⅱa），按抗體種類計算，HLA Ⅰ抗體最多占65%（11/17），其次是抗-GP占35%（6/17）。

2.4 抗-CD36再鑒定

上述這份抗-CD36 標(biāo)本分別由廣州血液中心和南寧中心血站用PakPlus 試劑檢測，結(jié)果仍然為抗-CD36。但浙江省血液中心用Pak-Lx試劑2次重復(fù)檢測，結(jié)果顯示雖然未檢出抗-CD36，但該份GPIV（CD36）熒光強度（MFI：489），高于陰性對照和其它的糖蛋白的熒光強度（MFI：104～289）。

2.5 PXM

2.5.1 抗-CD36陽性獻血者PXM結(jié)果

上述抗-CD36陽性獻血者血漿分別與CD36陽性和陰性獻血者血小板進行交叉配血，結(jié)果顯示，和CD36陽性血小板反應(yīng)為陽性（不相容），同CD36陰性血小板無反應(yīng)性（相容）。

2.5.2 普通血小板抗體（非抗-CD36）陽性患者PXM結(jié)果

見表2。

表2 患者血小板交叉配血情況Table 2 Cross matching of platelets in patients

3 討論

人類血小板抗原主要分為2類，一類是非特異性抗原或血小板相關(guān)抗原，與ABO 血型系統(tǒng)和HLA 有關(guān)，另一類是血小板特異性抗原[1-3]。人類血小板特異性抗原（HPA）具有遺傳多態(tài)性，國內(nèi)已能進行HPA-1—6/10/15/21 基因分型鑒定[8]。正是由于這些不同特異性抗原的存在，導(dǎo)致患者輸血時可能出現(xiàn)排異反應(yīng)及血小板減少癥狀。

根據(jù)相關(guān)文獻報道，血小板抗體陽性率在獻血者中為0.55%[9]，患者中為10.27%[10]，輸注血小板患者中15.0%[11]，血液病患者中26.9%[12]，血小板輸注無效患者中高達92%[3]。本研究中獻血者和患者的血小板抗體陽性率分別是0.57%、8.2%，患者陽性率較獻血者高，可能是患者遭遇免疫機會（輸血等）較多，容易刺激免疫系統(tǒng)進而產(chǎn)生抗體。本研究中6名血小板抗體陽性獻血者中，有3名無免疫史（輸血、妊娠），其抗體產(chǎn)生機理不明確，由于患者資料不詳細，未能確定其準(zhǔn)確的免疫史和籍貫。有研究比較固相酶聯(lián)免疫吸附法、液相芯片法、固相凝集捕獲法、Pak-Lx 微球珠法等檢測血小板抗體，結(jié)果與本次研究SPIA 和FCM 及ELISA 法的結(jié)果類似，不同方法結(jié)果不完全一致，說明不同方法有各自局限性，可能使用的血小板抗原存在差異[13-14]。

本研究結(jié)果顯示廣東省中山地區(qū)獻血者中血小板抗體以HLA-Ⅰ為主，個別為罕見的抗-CD36；本地患者中血小板抗體也以HLA-Ⅰ為主，同時還含有HPA 抗體相關(guān)的抗-GP，由于檢測標(biāo)本數(shù)量少，不能排除其它未檢患者中含有抗-CD36，后續(xù)研究我們將增加患者檢測數(shù)量和疾病的分類研究，統(tǒng)計豐富相關(guān)數(shù)據(jù)。另鑒于PakPlus試劑盒的檢測局限性，未能鑒定抗-GP具體的HPA特異性。

PakPlus ELISA可檢測出抗-CD36，而Pak-Lx熒光標(biāo)記的微球珠經(jīng)2次檢測均未檢出，但其結(jié)果顯示該例GPIV（CD36）熒光強度明顯高于陰性對照和其它的糖蛋白的熒光強度，提示有低于Cutoff 值的低濃度抗-CD36，推測可能是由于Pak-Lx檢測使用了較長時間保存和運輸后的反復(fù)凍融標(biāo)本，且該標(biāo)本抗-CD36濃度低（效價2）。

王宏陽等[3]研究表明，血小板抗體檢測陽性程度越高其配型率越低，本研究中未考慮供受者HLA、HPA 血型相同，低于30%配型率占到71.4%（10/14），再次證明血小板抗體陽性患者交叉配型相容仍有一定難度，今后還應(yīng)該進行血小板配合后輸注療效的觀察。

Chapman 等[15]認為，反復(fù)進行血小板輸注的患者可能對這些輸注變得難以控制，血小板抗體篩查、血小板交叉配血試驗和HLA 抗體檢測通常用于這些患者的檢測。Attieh等[16]發(fā)現(xiàn)血小板輸注難治性（PR）患者輸注血小板后未達到預(yù)期的Plt，通過輸血后Plt、血小板抗體篩查HLA Ⅰ抗體檢測和血小板交叉配血研究，結(jié)果表明PXM 可以出現(xiàn)假陽性或假陰性，試劑敏感性不夠可導(dǎo)致HLA 抗體漏檢。

遇到PTR患者，應(yīng)首先對患者進行血小板抗體檢測，在條件允許的情況下采用敏感性高、特異性強的方法，必要時聯(lián)合多種檢測方法使用可有效診斷血小板抗體。應(yīng)對患者進行PXM，給患者輸注配型相合的血小板，提高療效和安全性，預(yù)防和減少患者PTR的發(fā)生，避免浪費血小板資源。今后在血小板配合性輸注中，應(yīng)關(guān)注供者血小板基因庫的庫容量提升和信息化建設(shè)，在庫存和待檢血小板檢索和配合，將會明顯縮短血小板配合性輸注所需時間[2]。

綜上所述，中山地區(qū)患者血小板抗體陽性率明顯高于無償獻血者，多為抗-HLAⅠ、抗-GP，而抗-CD36 發(fā)生率極低，因此應(yīng)重點關(guān)注建立HLAⅠ、HPA血型供者庫，同時應(yīng)開展患者血小板抗體檢測及其配型，有助于解決PTR問題。