基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討桔梗治療非小細胞肺癌分子機制

楊策，余婉瑩，王文祥，李寧，易東陽，譚小燕

1. 重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶 404120

2. 三峽庫區(qū)道地藥材開發(fā)利用重慶市重點實驗室，重慶 404120

3. 重慶文理學(xué)院，重慶 402160

非小細胞肺癌（NSCLC）是肺癌病理分類中最常見的類型，是除小細胞肺癌（SCLC）以外，所有來源于肺上皮的各種類型癌癥的集合體。NSCLC 的常見類型有鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞癌。其臨床治療以化療為主，也有多種靶向藥物治療，但預(yù)后效果并不理想[1]。因此，尋找治療NSCLC 的新靶點具有重要的臨床意義。研究顯示，多種中藥成分及其提取物具有較好的抗腫瘤作用，如苦參堿、染料木素和紫杉醇，部分已廣泛應(yīng)用于臨床[2-3]。桔梗在臨床上常用于治療咳嗽痰多、肺痛吐膿等癥，為肺經(jīng)之要藥。藥理學(xué)研究證實，桔梗具有抗氧化、抗炎、抗癌等藥理作用，能抑制多種腫瘤細胞增殖[4]。然而，桔梗治療NSCLC 的報道較少，其作用機制也尚未明確。因此，明確桔梗治療NSCLC 的分子機制可以為桔梗防治NSCLC 提供更多參考?！俺煞?靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中，多成分、多靶點、多途徑的特點體現(xiàn)了中醫(yī)治療的整體觀念。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討桔梗治療NSCLC 的活性成分和可能的分子機制，并通過體外實驗驗證了相關(guān)靶基因的相對表達量，結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料A549 細胞株（中國科學(xué)院上海細胞庫）；桔梗（中國食品藥品檢定研究院，批號121028-201612）；RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）細胞增殖檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；渦旋混合器（美國賽洛杰克儀器有限公司，MX-F）；聚合酶鏈式反應(yīng)引物（北京擎科生物科技有限公司）；ELX800TM酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；MCO-15AC 細胞培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、Trizol 試劑（碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 潛在作用靶點篩選通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺數(shù)據(jù)庫（TCMSP）（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）獲得桔梗的化學(xué)成分，根據(jù)口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18，篩選桔梗的潛在活性成分。將桔梗的潛在活性成分導(dǎo)入Swiss Target Prediction（https：//Swiss.com/）和PharmMapper 數(shù)據(jù)庫（https：//www.PharmMapper.org/）中，獲取相關(guān)的靶點信息。然后將篩選得到的靶點導(dǎo)入Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），將檢索出的蛋白名統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為基因名。在TTD（http：//db.idrblab.net/ttd）和DrugBank 數(shù)據(jù)庫（https：//www.drugbank.com）中得到與NSCLC 相關(guān)的疾病靶點信息。最后通過Venny 2.1.0在線平臺（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）篩選桔梗活性成分靶點與NSCLC 疾病靶點的交集靶點，得到桔梗治療NSCLC 的潛在作用靶點。

1.3 蛋白-蛋白相互作用（PPI） 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建在STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）中導(dǎo)入交集靶點。置信度設(shè)定為“high confidence=0.4”，生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，其余的相關(guān)設(shè)置均為默認設(shè)置，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)及相關(guān)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)文件。將網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入CytoScape 3.9.1 軟件（https：//cytoscape.org/），建立PPI 網(wǎng)絡(luò)可視化圖。用Network Analyzer模塊進行網(wǎng)絡(luò)可視化分析，獲得度值（Degree）、節(jié)點介度（Betweenness）、節(jié)點緊密度（Closeness）的信息。度值越大表明該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中越重要。

1.4 基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析將篩選的桔梗治療NSCLC 的潛在靶點導(dǎo)入DAVID 6.8 平臺中，通過GO功能及KEGG 通路進行富集分析。對潛在靶點進行GO 功能分析，以研究桔?；钚猿煞种委烴SCLC 的主要生物功能，如生物過程（BP）、細胞組分（CC）和分子功能（MF），并根據(jù)P值使用生物信息分析平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn/）繪制柱狀圖。進行KEGG 通路分析，通過Omicshare（https：//www.omicshare.com/）繪制氣泡圖，將結(jié)果進行可視化，以分析桔梗治療NSCLC 的潛在作用機制。

1.5 “成分-靶點-通路”構(gòu)建與分析將活性成分與潛在作用靶點通過CytoScape 3.9.1 軟件篩選結(jié)果導(dǎo)入，并展開網(wǎng)絡(luò)可視化分析，根據(jù)節(jié)點和邊顯示靶點與關(guān)鍵化合物間的關(guān)系。再利用Network Analyzer功能進行網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析，其中分析參數(shù)含節(jié)點介度中心性、節(jié)點緊密度和度值等，經(jīng)拓撲學(xué)參數(shù)比對，確定化合物在網(wǎng)絡(luò)中的重要性，分析主要活性成分及核心靶點。

1.6 分子對接篩選出桔梗治療NSCLC 的活性成分和核心靶點，通過RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org）下載核心靶點的3D 結(jié)構(gòu)。將核心靶點的3D結(jié)構(gòu)導(dǎo)入分子對接軟件進行去水、加氫、能量最小化等操作，通過Glide Dock 模塊進行分子對接，以對接評分評價活性成分與核心靶點結(jié)合的穩(wěn)定性。

1.7 體外實驗驗證

1.7.1 細胞分組及給藥37 ℃、5%二氧化碳（CO2）飽和濕度下，將A549 細胞培養(yǎng)于RPMI 1640 培養(yǎng)液中（10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素及0.1 mg/mL 鏈霉素）。實驗組別設(shè)置為空白對照組（A549 細胞，不加藥物干預(yù)），桔梗提取物低劑量組（40 μg/mL），桔梗提取物高劑量組（80 μg/mL）。

1.7.2 細胞活性實驗采用CCK-8 試劑盒進行細胞活性檢測。將A549 細胞濃度調(diào)至1×104個/mL，以100 μL/孔接種于96 孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h 后，對各組細胞進行藥物處理，每組6 個復(fù)孔。藥物作用24 h 后，每孔加入CCK-8 試劑10 μL 并搖勻，于CO2培養(yǎng)箱孵育1 h，于450 nm 下測定吸光度值，每孔測3 次，取平均值并計算細胞存活率。

1.7.3 桔梗提取物對調(diào)控通路基因的mRNA 相對表達的影響A549 細胞經(jīng)桔梗提取物干預(yù)24 h 后，棄去培養(yǎng)基，以PBS 清洗5 次，并加入Trizol 試劑1 mL，室溫放置10 min 后，收集至2 mL EP 管中，于260 nm 處測吸光度值，并確定RNA 濃度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄至cDNA。逆轉(zhuǎn)錄后采用20 μL 體系進行qPCR 檢測，測定mRNA 相對表達量，結(jié)果采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法使用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較使用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 研究結(jié)果

2.1 桔梗治療NSCLC 潛在作用靶點通過TCMSP檢索共得到102 個桔梗化學(xué)成分。符合篩選條件的潛在活性成分共7 個，見表1。合并Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫和PharmMappe 數(shù)據(jù)庫中桔梗活性成分的靶點信息，去重復(fù)后獲得285 個藥物靶點。合并DrugBank 數(shù)據(jù)庫和TTD 數(shù)據(jù)庫的疾病靶點信息，去重后獲得165 個與NSCLC 相關(guān)的疾病靶點。將桔梗活性成分靶點與NSCLC 疾病靶點取交集，得到桔梗治療NSCLC 的靶點35 個，交集靶點韋恩圖見圖1。

圖1 交集靶點韋恩圖

表1 桔?；钚猿煞职悬c信息

2.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點代表交集靶點蛋白，節(jié)點顏色越深代表相互關(guān)聯(lián)度越強，見圖2。從圖中可知，白蛋白（Alb）、表皮生長因子受體（EGFR）、乳腺癌抵抗蛋白（ABCG2）、前列腺素內(nèi)過氧化合物酶2（PTGS2）、P-糖蛋白（ABCB1）、非受體酪氨酸激酶（SRC）等可能是桔梗治療NSCLC 的關(guān)鍵靶點。

圖2 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 GO 功能富集分析設(shè)定P＜0.05，總共得到167 條富集通路，其中94 個通路與BP 相關(guān)，26 個通路與CC 相關(guān)，47 個通路與MF 相關(guān)。根據(jù)P值由小到大排列，分別選取BP、CC、MF 中前10 條繪制柱狀圖，見圖3。BP 主要涉及異生刺激的反應(yīng)（response to xenobiotic stimulus）、藥物反應(yīng)（response to drug）、凋亡信號通路（negative regulatioin of apoptotic process）等；CC 主要涉及質(zhì)膜（plasma membrane）、細胞核（nucleus）、細胞質(zhì)（cytoplasm）等；MF 主要涉及三磷酸腺苷結(jié)合（ATP binding）、蛋白結(jié)合（identical peotein binding）等。

圖3 GO 富集分析圖

2.4 KEGG 通路富集分析設(shè)定P＜0.05，采用KEGG 通路富集對35 個潛在作用靶點進行分析，共獲得42 條富集通路，按照P值依次增大的排列順序，篩選出前20 條與NSCLC 相關(guān)的通路。氣泡的顏色代表富集的顯著性，氣泡越紅說明差異基因在這個通路上富集越顯著。見圖4。

圖4 KEGG 富集通路氣泡圖

2.5 “成分-靶點-通路”可視化網(wǎng)絡(luò)見圖5。獲得7 種化學(xué)成分，包括刺槐黃素、菠菜甾醇、花旗松素、2-O-甲基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基桔梗酸酯A、木犀草素、3-O-β-D-吡喃葡萄糖基桔梗酸A 二甲酯、刺槐素。與化學(xué)成分相互作用聯(lián)系的35 個基因靶點主要有ABCB1、PTGS2、EGFR、Alb、SRC、ABCG2 等。與桔梗治療NSCLC 有關(guān)聯(lián)的信號通路主要有癌癥通路（pathway in cancer）、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、MAPK 信號通路（MAPK signaling pathway）、Rap1 信號通路（Pap1 signaling pathway）、FoxO 信號通路（FoxO signaling pathway）等。

圖5 成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)

2.6 分子對接見圖6。花旗松素與PTGS2、木犀草素與ABCB1 和PTGS2、刺槐素與EGFR 等對接評分較高。選取ABCB1、EGFR、PTGS2 與其對接評分最高的活性成分進行可視化，見圖7。

圖6 分子對接評分熱圖

圖7 分子對接可視化圖

2.7 體外實驗驗證見圖8。給藥24 h 后，與空白對照組相比，桔梗提取物低劑量組A549 細胞活性下降（P＜0.05），桔梗提取物高劑量組A549 細胞活性低于桔梗提取物低劑量組（P＜0.05）。qPCR 實驗結(jié)果顯示，與空白對照組相比，桔梗提取物低劑量組A549 細胞中ABCB1、EGFR、PTGS2 mRNA 表達量均降低（P＜0.05），桔梗提取物高劑量組A549 細胞中ABCB1、EGFR、PTGS2 mRNA 表達量均低于桔梗提取物低劑量組（P＜0.05）。

圖8 桔梗提取物對A549 細胞活性及核心靶點基因表達的影響

3 討論

中醫(yī)藥作為補充和替代醫(yī)學(xué)被廣泛用于改善接受腫瘤切除術(shù)后化療、放療或免疫治療的NSCLC 患者的生活質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，桔梗中的桔梗皂苷D 與異類葉升麻苷可通過調(diào)控EphA2/AKT/mTOR 通路和調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6 來抑制A549 細胞增殖、遷移和侵襲[5]。桔梗皂苷D 還可以通過下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）mRNA和蛋白的表達及抑制其上游ERK 信號通路和p-AKT表達，進而抑制NSCLC H460 和A549 細胞的黏附、侵襲和遷移[6]。但迄今為止桔梗治療NSCLC 的作用機制仍不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)，為系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)中藥活性成分及作用靶點提供新的策略[7]。因此，本研究結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接及分子生物學(xué)等方法，深入挖掘桔梗的有效成分，闡明其治療NSCLC 可能的作用機制。

從TCMSP 中檢索得到102 個桔?；瘜W(xué)成分，根據(jù)OB 和DL 篩選得到7 個潛在活性成分。其中刺槐黃素具有抗氧化和抗炎作用，有研究表明刺槐黃素顯著降低了p38 α-cDNA 轉(zhuǎn)染細胞中磷酸化p38 α 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、MMP-2/MMP-9 及尿激酶型纖溶酶原激活劑（u-PA）水平，從而顯著降低了NSCLC A549 細胞的侵襲及遷移[8-9]。花旗松素可以通過促進胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶（PI3K）和OCT4 失活來抑制肺癌細胞干性和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用，同時能通過降低SOX2 和OCT4 表達來抑制A549 異種移植BAlb/c小鼠的腫瘤生長[10]。木犀草素可以通過抑制Hsp90 與突變型EGF 受體的結(jié)合來誘導(dǎo)EGF 受體降解，從而阻止PI3K/Akt/mTOR 信號傳導(dǎo)，加速NSCLC A549細胞凋亡[11]。其余潛在活性成分未見治療NSCLC 的相關(guān)報道。

PPI 網(wǎng)絡(luò)分析表明，Alb、EGFR、ABCG2、PTGS2、ABCB1 及SRC 為桔梗治療NSCLC 的核心靶點。研究表明，EGFR 靶點聯(lián)合檢測血清ProGRP、NSE 可有效提高診斷晚期NSCLC 的效能[12]。NSCLC 患者體內(nèi)Alb 降低是發(fā)生癌痛的獨立危險因素[13]。ABCG2靶點的高表達與肺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)關(guān)系，表明ABCG2 靶點可作為預(yù)測肺癌復(fù)發(fā)的重要指標[14]。SRC 蛋白激酶在正常組織的細胞中廣泛表達，當SRC 過度表達時，可能會導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。在NSCLC 患者機體中，SRC 的過度表達與不良的預(yù)后以及促進遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥有關(guān)[15]。

通過GO 和KEGG 通路富集分析交集靶點，結(jié)果表明桔梗主要通過作用于癌癥通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、MAPK 信號通路、Rap1 信號通路、FoxO 信號通路等發(fā)揮治療NSCLC 的作用。相關(guān)研究表明，桔?？赏ㄟ^激活T 細胞促進抗腫瘤作用，癌癥通路的調(diào)節(jié)至關(guān)重要[16]；EGFR 信號通路也能影響到突變晚期NSCLC 的表達[17]；桔梗還可通過抑制MAPK 通路及PI3K/AKT 通路的活化治療NSCLC小鼠肺組織部位[18]；桔?？梢种萍毎|(zhì)Rap1 靶點，進而介導(dǎo)下游炎癥及凋亡通路，有效提升機體對NSCLC 化療藥物的耐藥性[19]；化療藥物具有細胞毒性，可促使細胞凋亡，桔梗能抑制FoxO 信號通路，從而降低細胞對化療藥物的敏感性，提升治療NSCLC 的藥效[20]。

針對以上預(yù)測結(jié)果，以qRT-PCR 進行驗證實驗，結(jié)果表明ABCB1、EGFR、PTGS2 等核心靶點可能是桔梗治療NSCLC 的有效靶點。EGFR 是受體酪氨酸激酶ErbB 家族的一員，可以與受體特異性配體結(jié)合形成同源和異源二聚體，二聚體的形成可以促進酪氨酸激酶的激活。酪氨酸殘基的自動磷酸化啟動了一系列下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。EGFR 信號通路對細胞生長、增殖和分化的生理過程有重要影響，EGFR是抗NSCLC 藥物的最佳靶點[21]。MAPK 和PI3K-AKT信號通路是EGFR 的主要下游通路，分別參與細胞增殖、細胞存活和運動[22]。ERK 和AKT 的激活在腫瘤的細胞生長和細胞分裂中起重要作用。抑制MAPK和PI3K-AKT 信號通路有望成為治療NSCLC 的有效方法[23]。SRC 的過度表達與促進遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥有關(guān)，SRC 被多種受體酪氨酸激酶（RTKs）激活時，與局部粘著斑激酶（FAK）相互作用，然后通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）和Raf 蛋白激酶（RAF）導(dǎo)致絲裂原活化蛋白激酶激酶(MAPK)-磷酸化絲裂原活化蛋白激酶激酶1/2（MEK1/2）和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1/2）的激活，最終促進腫瘤細胞的增殖、遷移和血管生成[24]。PCR 實驗結(jié)果表明，桔梗提取物能夠有效調(diào)控以上靶點，進而改善NSCLC，且可能呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接及分子生物學(xué)的方法探討了桔梗治療NSCLC 的分子機制。研究表明桔?？赡芡ㄟ^靶向ABCB1、EGFR、PTGS2 等靶點調(diào)節(jié)MAPK 等信號通路，進而發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖的作用。桔梗可通過多成分、多靶點、多途徑發(fā)揮治療NSCLC 的作用。然而，由于本研究是基于基因?qū)用娣治觯€需要來自體外和體內(nèi)更加深層次的研究來驗證。