紅掌組織培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)

周 靜 周力行 周曉靜 孫 欣 沈碧君 蔣亞華

（宿遷學(xué)院，江蘇宿遷 223800）

紅掌（Anthurium andraeanumLind.）是花燭屬天南星科的一種多年生常青性草本植物，也稱安祖花、花燭。因其色彩艷麗、花期持久和花型獨特，深受人們喜愛。在紅掌組織培養(yǎng)中，外植體的選擇和處理是其組織培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)。目前組織培養(yǎng)研究選用的外植體以葉片、葉柄為主[1]。本研究選取紅掌嫩葉作為試驗材料，通過試驗對比，探討在不同生長因素影響下紅掌生長狀況，為紅掌組織培養(yǎng)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料選擇

選取株型大、花色鮮艷的紅掌盆栽品種特倫薩作為供試品種。切取紅掌基部新生幼嫩葉片，用自來水沖去雜質(zhì)、洗凈表面，再用流水沖洗30 min，瀝干后移至超凈工作臺上。

1.2 外植體滅菌

在無菌環(huán)境下，將嫩葉、葉柄和莖段分成9組并編號，均用75%乙醇浸泡30 s，再用無菌水沖洗3次。然后將1—3 組用0.5% NaCIO 溶液分別浸泡6、8 和10 min；4—6 組用1.0% NaCIO 溶液分別浸泡6、8 和10 min；7—9 組用2.0% NaCIO 溶液分別浸泡6、8 和10 min。待各組時間到后，用無菌水沖洗5次，分別放入消毒瓶中備用[2]。

1.3 培養(yǎng)基配制

培養(yǎng)基分為誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基、增殖愈傷組織的培養(yǎng)基、誘導(dǎo)叢生芽的培養(yǎng)基和叢生芽生根的培養(yǎng)基。在每個培養(yǎng)基配制好后，進行濕熱滅菌，滅菌條件如下：蒸氣壓0.105 MPa，溫度121 °C，滅菌時間15 min。充分殺菌，減少組織培養(yǎng)時的污染[3]。

1.4 愈傷組織誘導(dǎo)

以紅掌品種特侖薩的嫩葉、莖段及葉柄為材料，用于紅掌組織培養(yǎng)的主要培養(yǎng)基包括MS、1/2 MS、N6 和B5 等。在這些培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)紅掌愈傷組織的最有效培養(yǎng)基是1/2 MS[4]。因此，以1/2 MS 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以6-BA 和2，4-D 為因子，進行了四級正交雙因子檢測，設(shè)計不同6-BA 和2，4-D 濃度的培養(yǎng)基配方進行試驗。6-BA 濃度為0.2、0.5、0.8 和2.0 mg/L；2，4-D濃度為0.1、0.3、0.5和0.7 mg/L[5]。

在3 個重復(fù)中，每個處理組100 個外植體，共接種300 個外植體。培養(yǎng)30 d 后，統(tǒng)計愈傷組織的誘導(dǎo)情況并得出結(jié)論。

1.5 叢生芽誘導(dǎo)

將獲得的愈傷組織在無菌條件下切成長約3 mm的小段，將每個小瓶中的15個接種處理組織接種到誘導(dǎo)叢生芽的培養(yǎng)基中，以誘導(dǎo)叢生芽的發(fā)生，通過觀察叢生芽出芽率，比較不同激素比例對誘導(dǎo)發(fā)芽的影響。以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以6-BA和NAA為因子，建立三級兩因子正交試驗，6-BA 的濃度分別為0.3、0.5和0.7 mg/L，NAA濃度為0.1、0.2和0.3 mg/L[6]。

培養(yǎng)40 d后，統(tǒng)計合格叢生芽的數(shù)量，合格叢生芽判斷標(biāo)準(zhǔn)為苗高≥1.5 cm，葉片≥3片，葉寬≥1.5 cm，葉片嫩綠。

1.6 叢生芽生根

誘導(dǎo)叢生芽獲得大量叢生芽后，選取誘導(dǎo)的合格叢生芽無根苗，去掉黃葉和枯葉，將幼苗分別接種于不同濃度NAA的生根介質(zhì)中，每瓶裝15個叢生芽苗，并進行誘導(dǎo)。以1/2 MS作為基質(zhì)，6-BA和NAA作為兩因子進行正交試驗。6-BA 濃度設(shè)計為0.3、0.5和0.7 mg/L。NAA濃度為0.1、0.2和0.3 mg/L。

培養(yǎng)14 d后，可見微量潔白的愈傷組織，當(dāng)苗高4～5 cm 時，可見發(fā)達(dá)的主根和大量須根，一個月后統(tǒng)計其生根率。

1.7 培養(yǎng)條件優(yōu)化

在每升培養(yǎng)基中加入30 g蔗糖和2 g植物凝膠，將培養(yǎng)物置于組培室中，溫度為（25±1）℃，每天連續(xù)光照12 h，光照強度為1 500～2 100 lx。酸性或堿性過強均會對植株的生長造成較大的影響，而紅掌的pH在5.6～5.8時較好。

組織培養(yǎng)期間，每3～5 d檢查一次培養(yǎng)室，統(tǒng)計結(jié)果，并去除受污染的瓶苗。保持溫度和光照。組培室每周用紫外燈照射一次，約30 min，地板每周用75%乙醇噴灑一次，降低培養(yǎng)環(huán)境的污染性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時間對葉片接種效果的影響

由表1 可知，隨著消毒時間變長，葉片接種成活率先升高后下降，當(dāng)用NaCIO 溶液浸泡8 min 時，接種成活率最高。當(dāng)消毒時間小于8 min 時，會造成葉片殺菌不完全，導(dǎo)致污染率上升。當(dāng)消毒時間大于8 min 時，死亡率大幅提升。因此，消毒時間選8 min最為適宜。

表1 不同消毒時間對葉片接種效果的影響

2.2 不同NaCIO溶液濃度對葉片接種效果的影響

由表2可知，隨著NaCIO 溶液濃度的上升，成活率和污染率降低，死亡率上升。該結(jié)果表明，提高NaCIO 溶液濃度可以抑制污染，同時也會導(dǎo)致細(xì)胞組織死亡。因此，NaCIO 溶液濃度選用0.5%為宜。

表2 不同NaCIO溶液濃度對葉片接種效果的影響

2.3 不同激素濃度配比對紅掌外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響

控制2，4-D 濃度不變，對比6-BA 濃度變化，其影響如表3 所示。6-BA 的濃度對愈傷組織的直徑有更大的影響，其范圍在0.2～1.8 cm。在6-BA 濃度為0.2～0.5 mg/L 時，隨著6-BA 濃度的增加，愈傷組織的直徑變大。當(dāng)6-BA濃度超過0.5 mg/L后，直徑略有下降，推測6-BA為0.5 mg/L時最適合愈傷組織生長。

表3 不同激素濃度配比對紅掌外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響

控制6-BA 濃度不變，2，4-D 濃度對愈傷組織狀態(tài)的影響較大。2，4-D 濃度為0.1 mg/L 時，無愈傷組織或愈傷組織較小，愈傷組織誘導(dǎo)率低，質(zhì)地較軟，易碎，導(dǎo)致?；ㄐЧ幻黠@。2，4-D 濃度為0.5 mg/L 時，愈傷組織質(zhì)地堅硬且誘導(dǎo)成功率高，愈傷出現(xiàn)時間短。2，4-D 濃度超過0.5 mg/L后，會出現(xiàn)僵果和畸形果，外植體愈傷化，形態(tài)結(jié)構(gòu)消失。

葉片在培養(yǎng)基（7）中培養(yǎng)10 d后，開始出現(xiàn)膨大現(xiàn)象，60 d即可誘導(dǎo)出愈傷組織，且誘導(dǎo)成功率高達(dá)98%。此時在其他培養(yǎng)基中葉片多膨大，邊緣出現(xiàn)愈傷組織，對其繼續(xù)培養(yǎng)，部分會出現(xiàn)干死或污染情況，誘導(dǎo)成功率為80%。從形態(tài)、質(zhì)地和顏色等多方面綜合考慮，以0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D 為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最佳配比。

2.4 不同激素濃度配比對紅掌叢生芽誘導(dǎo)的影響

控制NAA 濃度不變，對比6-BA 濃度變化，其影響如表4 所示。在6-BA 濃度為0.3～0.5 mg/L時，6-BA含量越高，愈傷組織分化數(shù)量越多，分化程度越高。當(dāng)6-BA 濃度為0.5 mg/L 時，誘導(dǎo)率最高；濃度超過0.5 mg/L 后，叢生芽過多，導(dǎo)致養(yǎng)分不足，整體長勢變差[7]。

表4 不同激素濃度配比對紅掌叢生芽誘導(dǎo)的影響

控制6-BA 濃度不變，NAA 變化時，NAA 在較低的濃度下，叢生芽誘導(dǎo)率較低。當(dāng)NAA 濃度為0.2 mg/L 時，誘導(dǎo)率可達(dá)95%，且芽長勢最好，芽高1.5～2.5 cm，葉片3～5枚，芽點布滿生長空間，屬于合格叢生芽。當(dāng)濃度繼續(xù)升高，叢生芽生根，會導(dǎo)致叢生芽畸形、枯萎壞死或停止生長[8]。

接入培養(yǎng)基40 d后觀察，3組均有小芽生長，其中培養(yǎng)基（5）小芽最多。100 d 后3 組基本萌發(fā)完成，培養(yǎng)基（5）在3組中芽萌發(fā)率最高，長勢最好，顏色最綠，芽最健壯，其余處理出現(xiàn)畸形、長勢不佳、枯萎壞死或誘導(dǎo)率低等現(xiàn)象[9]。綜上所述，0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA為誘導(dǎo)叢生芽的最佳濃度。

2.5 不同激素濃度配比對紅掌叢生芽生根的影響

控制NAA 濃度不變，對比6-BA 濃度變化，其影響如表5所示。當(dāng)6-BA 濃度為0.3 mg/L 時，根系較淺，芽瘦弱易折。當(dāng)6-BA 濃度為0.5 mg/L 時，既能保證生根率，又不會對叢生芽形態(tài)造成影響。在6-BA 濃度為0.7 mg/L 時，芽有變形的趨勢，生長潛力降低。推測是由于基質(zhì)膨脹后附著的芽的內(nèi)部運輸組織的損失，導(dǎo)致大苗發(fā)育不良。因此，6-BA 的最佳濃度為0.5 mg/L。此時最適合叢生芽長出粗壯的根，方便之后對苗的移栽。

表5 不同激素濃度配比對紅掌叢生芽生根的影響

控制6-BA 濃度不變，NAA 對叢生芽生長有較大影響。NAA深度為0.1 mg/L時，叢生芽生根率低。NAA濃度為0.2 mg/L時，叢生芽有氣生根，但氣生根愈傷化，有效苗比率低。NAA濃度為0.3 mg/L時，平均生根數(shù)量最多，平均根長最長。

將叢生芽導(dǎo)入生根培養(yǎng)基30 d 后，對其生長狀況進行觀察，發(fā)現(xiàn)有部分黃綠色的新根出現(xiàn)，此時培養(yǎng)基（6）生根最早，生根數(shù)最多。45 d 后再觀察其生長狀態(tài)，培養(yǎng)基（6）的生根率約為98%，平均根數(shù)為4.6條，平均根長為3.0 cm，根系旺盛，芽生長良好，呈綠色，其次為培養(yǎng)基（2）。因此，0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA是使叢生芽生根的最佳培養(yǎng)基濃度。

當(dāng)組培幼苗生根后，將其從瓶子里拿出，用清水洗凈根系的培養(yǎng)基，種植在草炭、蛭石和珍珠石（體積比為2∶2∶1）的混合基質(zhì)中，然后用塑料膜覆蓋，放在溫室內(nèi)，一天澆水2～3次，以保證基質(zhì)的濕度。在幼苗初期要進行遮陰處理，并定期用百菌清溶液進行保護。15 d 后，幼苗的生長狀況良好，逐步撤去覆蓋的塑料膜，適當(dāng)增加光照強度，直到光強達(dá)到2 500 lx，成活率達(dá)100%。

3 結(jié)論與討論

該試驗探究不同因素對紅掌特侖薩葉片誘導(dǎo)叢生芽的影響，如培養(yǎng)基、激素以及消毒時間等，因此必須保持每個試驗體在同一培養(yǎng)環(huán)境下。主導(dǎo)生態(tài)環(huán)境因子對誘導(dǎo)組織的分裂和分化起著非常重要的作用，如光照和溫度等。光照對特倫薩愈傷組織有較好的刺激作用，有利于從愈傷組織中分化出綠色幼苗，在缺少光線的情況下，會產(chǎn)生發(fā)黃的幼苗[4]，在補充光照后會恢復(fù)為綠色。在采光良好的培養(yǎng)室中，自然漫射光可滿足要求。然而，在光線不足的培養(yǎng)室中，需要人工照明。因此，本試驗使用日光作為額外的光源，在組培室中，植物每天在（25±1）℃下培養(yǎng)12 h，光照強度為1 500～2 100 lx。

紅掌組織培養(yǎng)的外植體通常選用葉片、葉柄和莖等，其中葉片和葉柄使用較多。盡管紅掌的離體莖段誘導(dǎo)成活率更高，但紅掌莖段材料較少，且切割后易造成植株損傷。因此，本試驗采用葉片作為外植體，相較于其他器官，其易于提取和處理，新形成的葉片雜菌較少，易于消毒[10]。

愈傷組織誘導(dǎo)是植物組織培養(yǎng)的一個重要技術(shù)，大多數(shù)植株在形成前都處于愈傷組織期。在外植體充分消毒、無細(xì)菌感染的基礎(chǔ)上，使用不同激素配比的培養(yǎng)基，對愈傷組織培養(yǎng)會產(chǎn)生不同的影響。本試驗選擇6-BA 和2，4-D 作為愈傷組織培養(yǎng)的激素。6-BA 通過破壞頂端優(yōu)勢，促進細(xì)胞分裂和誘導(dǎo)新芽形成；2，4-D 具有促進細(xì)胞分裂的作用，使細(xì)胞壁變軟和變松。2 種激素協(xié)同作用于外植體，促進愈傷組織形成與增殖。

本研究表明，0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最佳配比，此時愈傷組織質(zhì)地堅硬，愈傷出現(xiàn)時間短。葉片培養(yǎng)10 d后，開始出現(xiàn)膨大現(xiàn)象，60 d即可誘導(dǎo)出愈傷組織，且誘導(dǎo)成功率高達(dá)98%。0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D 為最佳愈傷組織增殖濃度，此時增殖系數(shù)高，且愈傷組織發(fā)育良好。

內(nèi)源性植物激素的調(diào)節(jié)是成功誘導(dǎo)融合芽的一個重要因素。移植組織中不同的內(nèi)源激素水平會導(dǎo)致最合適的外源生長介質(zhì)的濃度變化。因此，不同類型和濃度的生長劑需要適應(yīng)不同的植物組織培養(yǎng)。

在誘導(dǎo)試驗中，分裂素和生長激素對紅掌花序的分化起著重要作用。比例太低或太高均不利于萌發(fā)，影響植株的生長。研究顯示，生長素NAA 在誘導(dǎo)叢生芽方面比IBA 更有效[7-8]。因此，本研究使用生長素NAA，當(dāng)6-BA 為0.6 mg/L、NAA 為0.2 mg/L時，誘導(dǎo)出的叢生芽最佳，萌發(fā)率最高，長勢最好，顏色最綠，芽最為健壯。當(dāng)6-BA 為0.5 mg/L、NAA為0.3 mg/L 時，叢生芽生根最高，約為98%，平均生根數(shù)4.6條，平均根長3 cm，根系粗壯，芽生長好，顏色綠。

離體苗的快速繁殖及移栽技術(shù)是制約紅掌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個重要因素。而紅掌組織培養(yǎng)技術(shù)受季節(jié)和環(huán)境影響較小，且對基質(zhì)的要求較低，在生產(chǎn)上有較大的應(yīng)用潛力，有利于提升花卉產(chǎn)業(yè)技術(shù)水平[9-10]。本研究探究了紅掌特倫薩品種的叢生芽誘導(dǎo)與生根的技術(shù)，建立了完整的紅掌組織培養(yǎng)體系，為紅掌組織培養(yǎng)研究提供參考，助力紅掌快繁技術(shù)的發(fā)展。