可利霉素對堪薩斯分枝桿菌的體內(nèi)外抗菌活性研究

摘要：目的 評價新一代大環(huán)內(nèi)酯類藥物可利霉素（carrimycin， CAM）對堪薩斯分枝桿菌（Mycobacterium kansasii，MK）的體內(nèi)外抗菌活性，旨在為治療堪薩斯分枝桿菌引起的感染提供更多選擇。方法 選取MK標準株（ATCC12478）和3株臨床分離株作為研究菌株，通過微孔板顯色法（microplate alamar blue assay， MABA）測定CAM、螺旋霉素（spiramycin， SPM）、阿奇霉素（azithromycin，AZM）和利福平（rifampicin，RIF）的最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration， MIC）；棋盤法測定CAM與AZM和RIF等8種臨床常用治療藥物的體外作用；評估CAM、SPM、AZM在J774A.1細胞中的抗菌活性；建立BALB/c小鼠感染堪薩斯分枝桿菌的模型，并通過CFU計數(shù)評估空白對照組、CAM治療組、AZM治療組和SPM治療組小鼠臟器活菌數(shù)，蘇木精-伊紅染色法（HE染色）評價CAM治療組小鼠肺組織病變程度。結(jié)果 CAM、SPM、AZM和RIF在MK標準株（ATCC12478）和3株臨床分離株中測定的MIC值分別為4～8 mg/L、gt;64 mg/L、4～8 mg/L和0.125～0.25 mg/L。8種臨床常用治療藥物和CAM在體外未出現(xiàn)拮抗作用（fractional inhibitory concentration index， FICIlt;4），CAM和異煙肼、利福平等藥物具有部分協(xié)同作用。在巨噬細胞J774A.1感染MK實驗中，和對照組相比2 mg/L CAM、SPM和AZM處理48 h均能使J774A.1細胞內(nèi)MK降低 0.3～0.4 lgCFU（Plt;0.001）。 在感染中等劑量MK的BALB/c小鼠模型中給與100 mg/kg藥物進行治療，與空白對照組相比CAM、AZM和SPM治療2周小鼠肺組織中活菌數(shù)分別降低了0.73、0.69和0.22 lgCFU（Plt;0.001），治療4周小鼠肺組織中活菌數(shù)分別降低了0.74、1.02 和0.41 lgCFU（Plt;0.001）。在感染高劑量MK的BALB/c小鼠模型中，與空白對照組相比100 mg/kg CAM治療4周小鼠肺組織中活菌數(shù)降低了0.98 lgCFU（Plt;0.001），HE染色結(jié)果顯示CAM治療顯著降低了小鼠肺組織中炎癥細胞數(shù)量（P=0.001）。結(jié)論 CAM對MK具有較好的體內(nèi)外抗菌活性，可以顯著降低肺組織活菌數(shù)，減輕肺組織炎癥程度，值得進一步開展臨床研究。

關(guān)鍵詞：堪薩斯分枝桿菌；非結(jié)核分枝桿菌；可利霉素；阿奇霉素；螺旋霉素

中圖分類號：R978 文獻標志碼：A

Study on the antibacterial activity of carrimycin against Mycobacterium Kansasii in vitro and in vivo

Wang Zimo1， Li Xiaodong1， Zhang Weiyan1， Fu Lei1， Chen Xi1， Chen Xiaoyou2， and Lu Yu1

（1 Beijing Key Laboratory of Drug Resistance Tuberculosis Research， Beijing Chest Hospital， Capital Medical University， Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute， Beijing 101149; 2 Beijing Ditan Hospital， Capital Medical University， Beijing 100015）

Abstract Objective To evaluate the activity of carrimycin （CAM） against M. kansasii （MK） in vitro and in vivo and provide more options for clinical treatment in pulmonary disease due to MK. Methods The standard strain （ATCC12478） and 3 clinical isolates of MK were used in experiments. The microplate alamar blue assay （MABA） was used to determine the minimal inhibitory concentrations （MICs） of CAM， spiramycin （SPM）， azithromycin （AZM） and rifampicin （RIF）. The checkerboard assay was used to evaluate the interaction between CAM and 8 clinically used drugs including AZM and RIF. The antibacterial activity of CAM， AZM and SPM in J774A.1 cells was evaluated and the model of BALB/c mice infected with MK was established. CFU counting was used to determine the bacillary load of organs in the black control group， CAM treatment group， AZM treatment group， and SPM treatment group. HE staining was used to assess the degree of lung injury. Results The MIC values of CAM， SPM， AZM and RIF in MK standar strains （ATCC12478） and three clincal isolates were 4～8 mg/L， gt;64 mg/L， 4～8 mg/L and 0.125～

0.25 mg/L， respectively. No antagonism between CAM and drugs used in this study were observed （fractional inhibitory concentration index， FICIlt;4）. CAM was partially synergized with isoniazid and rifampicin. The concentration of

2 mg/L CAM， SPM and AZM could reduce lgCFU from 0.3 to 0.4 in the macrophage infection model compared with the control group （Plt;0.001）. In the BALB/c mouse model infected with middle dosage MK， compared with the control group， continuous administration of 100 mg/kg CAM， AZM and SPM could reduce the bacillary load to 0.73， 0.69 and 0.22 lgCFU （Plt;0.001） in the lungs after 2 weeks of treatment and 0.74， 1.02 and 0.41 lgCFU （Plt;0.001） after 4 weeks of treatment， respectively. In the BALB/c mouse model infected with high-dose MK， continuous administration of

100 mg/kg CAM for 4 weeks could reduce the bacillary load 0.98 lgCFU （Plt;0.001） in the lungs compared with the control group. CAM treatment could significantly reduce inflammatory cells compared with the control group （P=0.001）. Conclusion CAM has potent activity against MK in vitro and in vivo." CAM not only reduced the bacillary load in organs， but also mitigated lung damage. Therefore， CAM deserves further clinical trials.

Key words Mycobacterium kansasii; Non-tuberculous Mycobacteria; Carrimycin; Azithromycin; Spiramycin

非結(jié)核分枝桿菌（non-tuberculous Mycobacteria， NTM）病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)不斷增加，有些發(fā)達國家甚至超過了結(jié)核病，成為影響全球健康的公共衛(wèi)生問題[1]。NTM種類繁多，廣泛存在于環(huán)境中，尤其是土壤和水源[2-3]，其中只有少數(shù)菌株具有致病性，堪薩斯分枝桿菌（M. kansasii，MK）是臨床中最常見的致病菌株之一，主要引起肺部病變和全身播散性病變[4]。1953年Buhler和Pollack首次發(fā)現(xiàn)了MK，見光產(chǎn)色的特性讓它容易與其他細菌鑒別[5]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，如今人們根據(jù)rpoB、hsp65、ITS和tuf基因片段已將其細分為7個亞型，不同亞型的臨床特征和耐藥情況有所區(qū)別，I型是最常見、研究最多的亞型[6-7] 。近些年來，MK感染的流行率不斷增加[8-9]，雖然治療成功率高達89.9%[10]，但是堪薩斯分枝桿菌肺病患者8年內(nèi)全因死亡率高達59.2%[11-12]，面臨著治療周期長、耐藥發(fā)生率高[13]、治療藥物少等多重困境，開發(fā)新型藥物迫在眉睫。

根據(jù)《非結(jié)核分枝桿菌病診斷與治療指南（2020年版）》，MK感染的治療方案分為利福平（rifampicin， RIF）敏感和耐藥兩套方案，這兩套方案都包含了大環(huán)內(nèi)酯類藥物中的克拉霉素（clarithromycin， CLR）或阿奇霉素（azithromycin， AZM），由此可見，CLR或AZM在MK感染的治療中發(fā)揮著重要作用。與CLR相比，AZM因為耐受性好、服藥次數(shù)少以及藥效相似在臨床中更為推薦。MK對大環(huán)內(nèi)酯類藥物較為敏感[14]，

但當患者出現(xiàn)血小板減少、心律失常、肝腎功能異常等情況時應(yīng)用具有局限性。

可利霉素（carrimycin，CAM）是我國自主研發(fā)的新一代大環(huán)內(nèi)酯類藥物，對流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌等多種細菌都有較好的抗菌活性[15]。根據(jù)其公布的臨床試驗結(jié)果（ChiCTR2200066125，ChiCTR2100054540，ChiCTR2100050363等），在細菌性鼻竇炎和急性氣管支氣管炎的治療中，CAM治療組和對照藥物AZM治療組兩組間的臨床治愈率和安全性都相當。CAM和AZM都是大環(huán)內(nèi)酯類藥物，兩藥的抗菌機制相似，而CAM與同類藥物不完全交叉耐藥，具有較高的安全性[16]。本研究對CAM在MK中的體內(nèi)外抗菌活性進行評價。

1 儀器與材料

1.1 儀器

萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）、立式壓力蒸汽滅菌器（致微（廈門）儀器有限公司）、生物安全柜（益世科（江蘇）生物科技有限公司）、紅外線加溫?zé)簦ㄖ貞c蜀水儀器廠）、臺式勻漿機（MP生物醫(yī)療公司）、二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（美國Nuaire公司）、多功能酶標儀（帝肯（上海）實驗器材有限公司）、超聲波清洗儀（海爾集團公司）、低溫冰箱（海爾集團公司）、超低溫冰箱（日本Sanyo公司）。

1.2 實驗藥物

可利霉素（批號CA2205002，異戊酰螺旋霉素Ⅲ含量gt;30%，總異戊酰螺旋霉素含量gt;60%）由上海同聯(lián)制藥有限公司提供；阿奇霉素（批號120325，純度99.9%）、螺旋霉素（批號113661，純度97.92%）均購自陶素生化；克拉霉素（批號20220325，純度gt;98%）、地塞米松（批號20220619，純度＞98%）、貝達喹啉（批號20210318，純度≥99%）、氯法齊明（批號20210317，純度＞98%）、莫西沙星（批號20190918，純度＞98%）均購自瀚香生物科技有限公司；利福平（批號014M2578V，純度≥97%）、異煙肼（批號MKCL5688，純度≥99%）、乙胺丁醇（批號WXBD0497V， 純度gt;98%）、阿米卡星（批號108M4848V， 純度gt;98%）均購自默克Sigma-Aldrich有限公司；利奈唑胺（批號AKZ624，純度99.82%）購自上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司。

1.3 實驗試劑及材料

24孔板、48孔板、96孔板、50 mL細胞培養(yǎng)瓶、細胞培養(yǎng)皿和10 mL移液管均購自美國康寧公司；1/2培養(yǎng)皿、涂布器、alamarBlue指示劑均購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；7H9液體培養(yǎng)基干粉、7H10固體培養(yǎng)基干粉均購自美國BD公司；MH肉湯Ⅱ（陽離子調(diào)節(jié)）、二甲亞砜、吐溫-80均購自北京索萊寶科技有限公司；Middlebrook OADC增菌液購自青島日水生物技術(shù)有限公司；丙三醇購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；羧甲基纖維素鈉（CMC）購自上海滬試實驗室器材股份有限公司。

1.4 實驗菌株、細胞及動物

菌株：MK標準株（ATCC12478）、臨床分離株（菌株編號1-37、1-42和MK01），由北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所藥物學(xué)研究室保存。細胞：單核鼠源巨噬細胞（J774A.1），購自北京協(xié)和細胞資源中心。動物：SPF級6～8周雌性BALB/c小鼠（17～20 g），購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。本研究通過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院動物倫理委員會審查，符合《實驗動物福利和倫理審查辦法》的原則和相關(guān)規(guī)定。

2 方法

2.1 最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration， MIC）測定

藥物用DMSO溶解成儲備液后于96孔板中進行二倍稀釋，隨后添加菌液（濃度為5×105 CFU/mL），

封口膜封閉后放入37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，

每孔添加32.5 μL指示劑（alamarBlue ： 20% Tween-80

=20：12.5，現(xiàn)配現(xiàn)用），繼續(xù)放入37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，觀察顏色變化，最后一個保持藍色孔中藥物的濃度即為該藥的MIC值。培養(yǎng)基選擇文獻中常用的Middlebrook 7H9+10% OADC（Oleic acid， Albumin， Dextrose， Catalase，油酸清蛋白葡萄糖過氧化氫酶）以及美國臨床實驗室標準化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的CAMHB（Cation-adjusted Mueller-Hinton broth）+5% OADC。

2.2 棋盤法檢測體外藥效學(xué)相互作用

藥物用DMSO溶解成儲備液后于96孔板中進行二倍稀釋（濃度依次為4×MIC～1/8×MIC），按照棋盤的布局組合，后續(xù)步驟同MIC測定。計算FICI（fractional inhibitory concentration index），F(xiàn)ICI=MICA聯(lián)合/MICA單藥+MICB聯(lián)合/MICB單藥，F(xiàn)ICI≤0.5表示兩藥為協(xié)同作用，0.5lt;FICIlt;1表示兩藥為部分協(xié)同作用，F(xiàn)ICI=1表示兩藥為相加作用，1lt;FICIlt;4表示兩藥為無關(guān)作用，F(xiàn)ICI≥4表示兩藥為拮抗作用。培養(yǎng)基為CAMHB + 5%OADC。

2.3 MTT法檢測細胞毒性

藥物用DMSO溶解成儲備液后于96孔板中進行3倍稀釋，隨后加入J774A.1細胞懸液，放置于

37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每孔添加10 μL MTT溶液后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去孔內(nèi)液體，每孔加入100 μL DMSO溶液，于搖床中孵育5 min，測量各孔在490 nm處的A值。含藥孔細胞活性=（A含藥孔-A陰性孔）/（A陽性孔-A陰性孔）×100%。

2.4 巨噬細胞內(nèi)抗菌活性測定

J774A.1細胞用DMEM完全培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清）稀釋至4×105個/mL后于24孔板中進行鋪板，將含有菌液的DMEM完全培養(yǎng)基與細胞共孵育6 h，（感染復(fù)數(shù)multiplicity of infection， MOI =1），隨后1×PBS清洗3遍，與含藥培養(yǎng)基（對照組添加含有等體積DMSO的培養(yǎng)基）孵育48 h后棄去培養(yǎng)基，添加0.1% SDS裂解細胞，充分裂解后加入 DMEM培養(yǎng)基中和，10倍系列稀釋并接種于7H10固體培養(yǎng)板上，封口膜封閉后放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3周進行菌落計數(shù)。

2.5 體內(nèi)抗菌活性測定

本實驗共涉及114只6～8周雌性BALB/c小鼠，具體分組見表1。小鼠購買后于負壓實驗室內(nèi)適應(yīng)1周開始進行實驗， 所有小鼠給與5 mg/kg地塞米松溶液灌胃1周（0.2 mL/次，每日1次），隨后尾靜脈注射

0.2 mL菌液（中等劑量為1×106 CFU/mL，高劑量為1×107 CFU/mL），操作成功的小鼠進行隨機分組?？瞻讓φ战M小鼠在感染后每日給與0.5% CMC溶液灌胃（0.2 mL/次，每日1次），藥物治療組小鼠自感染次日開始進行治療，每日給與0.5%含藥CMC溶液灌胃（0.2 mL/次，每日1次，CAM、AZM、SPM的給藥劑量均為100 mg/kg）。小鼠在相應(yīng)時間點處死后于75%酒精中浸泡5 min，隨后在無菌條件下進行解剖，取其肺、脾進行稱重，將臟器放入勻漿管內(nèi)，于MP勻漿機中以6.0 m/s的轉(zhuǎn)速勻漿40 s。勻漿液進行10倍系列稀釋后取200 μL稀釋液接種于7H10 固體培養(yǎng)板中， 37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3周后進行菌落計數(shù)。

2.6 蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining， HE）

4%多聚甲醛固定小鼠肺組織后進行修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片，取合格的樣片進行鏡檢，根據(jù)《大鼠和小鼠病理變化術(shù)語及診斷標準的國際規(guī)范（INHAND）》進行病理評分，使用Eclipse Ci-L拍照顯微鏡選取組織的目的區(qū)域進行400倍成像后用Image-Pro Plus 6.0分析軟件進行分析，炎癥細胞密度=炎癥細胞數(shù)/組織面積。

2.7 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS（Statistical Product and Service Solutions）23.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，GraphPad prism 8.0進行繪圖，計量資料表示為（x±s），CFU計數(shù)進行對數(shù)轉(zhuǎn)換后分析。數(shù)據(jù)先行正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗或One-Way ANOVA，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用2個或k個樣本的非參數(shù)檢驗，Plt;0.05則認為有統(tǒng)計學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 CAM、SPM、AZM和RIF對MK的MIC

通過MABA法測定CAM、SPM、AZM和RIF這4種藥物在7H9和CAMHB兩種培養(yǎng)基中對MK標準株（ATCC12478）和3株臨床分離株（1-37、1-42、MK01）的MIC，這兩種培養(yǎng)基測定的MIC值較為一致，相差均在二倍范圍內(nèi)。RIF的MIC值為0.125～0.25 mg/L；CAM和AZM的MIC值相似，均為4～8 mg/L；SPM體外抗菌活性微弱，MICgt;64 mg/L，詳見表2。

3.2 CAM與其他藥物之間的體外藥效學(xué)相互作用

臨床常用治療藥物行MIC測定后選取MIClt;10 mg/L

的藥物與CAM進行兩藥組合。在MK標準株（ATCC 12478）中，CAM與INH、CFZ、RIF、MFX和LZD兩藥組合的相互作用均為部分協(xié)同，F(xiàn)ICI值依次為0.75、0.625、0.75、0.75和0.75；與BDQ和AZM兩藥組合的相互作用均為相加；與AMK兩藥組合相互作用為無關(guān)；未出現(xiàn)與CAM為拮抗作用的藥物。隨機挑選臨床分離株1-42進行驗證，結(jié)果顯示CAM與INH部分協(xié)同，詳見表3。

3.3 CAM在J774A.1細胞內(nèi)抗菌活性

MTT法檢測結(jié)果顯示CAM、AZM和SPM在J774A.1細胞中的IC50 48 h依次為（13.58±0.95） mg/L、

gt;20 mg/L和gt;20 mg/L，為了避免藥物對J774A.1細胞數(shù)量的影響，實驗中藥物濃度設(shè)置為2 mg/L。在標

準株（ATCC12478）中，與對照組相比2 mg/L的CAM、

AZM和SPM處理48 h后能使J774A.1細胞內(nèi)MK分別降低0.33（P=0.001），0.32（P=0.004）和0.34（P=0.001）lgCFU/mL，3種藥物處理效果相似（Pgt;0.05）。隨機挑選臨床株1-37進行試驗，結(jié)果和標準株類似（圖1）。

3.4 CAM在BALB/c小鼠體內(nèi)抗菌活性

3.4.1 CAM在感染中等劑量MK的BALB/c小鼠中的抗菌活性評價

當BALB/c小鼠感染中等劑量（2×105 CFU/只）MK時，實驗期間空白對照組小鼠肺、脾組織活菌數(shù)均未出現(xiàn)下降趨勢，可用于評估藥效。藥物治療2周時，CAM和AZM治療效果相近（P肺=0.748，P脾=0.210），與空白對照組相比小鼠肺組織中活菌量分別下降了0.73和0.69 lgCFU（均Plt;0.001），脾組織中活菌量分別下降了1.08和1.30 lgCFU（均P≤ 0.001），SPM治療組未顯示出療效（P肺=0.135，P脾= 0.201）。藥物治療4周時，CAM和AZM治療效果仍然相近（P肺=0.067，P脾=0.051），與未給藥組相比小鼠肺組織中活菌量分別下降了0.74和1.02 lgCFU（均Plt;0.001），脾組織中活菌量分別下降了0.49和0.90 lgCFU（PCAM=0.010，PAZMlt;0.001），SPM治療降低了肺組織中活菌量（P肺=0.013，P脾=0.504）。由于給藥后各組小鼠的臟器重量存在顯著差異，因此又校正了臟器重量比較組織活菌數(shù)，結(jié)果與未校正前基本一致，詳見圖2和表4。

3.4.2 CAM在感染高劑量MK的BALB/c小鼠中的抗菌活性

當BALB/c小鼠感染高劑量（2×106CFU/只）MK時，實驗期間小鼠肺、脾組織活菌數(shù)均呈現(xiàn)上升趨勢，該模型可以用于評估藥效，詳見圖3。CAM治療4周時，與空白對照組相比肺、脾組織中活菌量分別下降了0.98和0.28 lgCFU（均P≤0.001）。 CAM治療明顯改善了臟器指數(shù)，空白對照組和CAM治療組小鼠的肺指數(shù)依次為0.88%±0.06%和0.70%±0.04%（P=0.001），脾指數(shù)依次為1.78%±0.22%和0.72%±0.10%（Plt;0.001），校正臟器重量后比較組織活菌數(shù)，CAM并未改變脾組織中的活菌密度（P= 0.077）。

HE染色結(jié)果顯示兩組的主要病理變化均為肺泡壁增厚，伴有少量以粒細胞為主的炎性細胞浸潤。從肺泡壁增厚、炎性細胞浸潤、出血、嗜酸性黏液分泌和壞死5個角度進行病理評分，兩組小鼠在炎性細胞浸潤方面有較大差異，空白對照組和CAM治療組的炎癥細胞密度依次為（527.98±249.83）和（163.63±64.80） n/mm2（P=0.001）。

4 討論與結(jié)論

MK是臨床中常見的慢生長型分枝桿菌，在亞洲、美國、歐洲等多個國家和地區(qū)流行，雖然MK感染的治療方案有待改進，但是多年來投入的研究過少，不能滿足日益增長的臨床需求。從頭合成藥物耗時耗力，藥物再利用是尋求新型治療藥物較為快捷的方式，本研究探索了新一代大環(huán)內(nèi)酯類藥物CAM對MK的體內(nèi)外抗菌活性，由于CAM在體內(nèi)主要代謝產(chǎn)物為螺旋霉素（spiramycin， SPM），SPM也是一種已上市的抗生素，所以同時研究了SPM的抗菌活性。

目前關(guān)于MK的藥效學(xué)評價主要集中于體外研究，如藥敏試驗，中空纖維模型等[17-18]，有研究建立C57BL/6，CB6F1，B6D2F1和CD1小鼠感染MK的模型研究免疫反應(yīng)[19-20]，然而用于藥效學(xué)評價的小鼠模型非常少。本實驗室在建立NTM小鼠模型的過程中嘗試了多種方法，BALB/c小鼠直接通過氣溶膠或尾靜脈感染NTM，體內(nèi)臟器菌量很快被清除，因此需要感染前1周給與地塞米松進行免疫抑制，這也在一定程度上模擬了免疫力低下的患者。小鼠進行免疫抑制后，曾嘗試過氣溶膠感染以模擬人體感染MK途徑，然而這種情況下即使小鼠于感染后每日進行地塞米松灌胃，體內(nèi)臟器菌量仍維持在較低水平，為防止地塞米松對藥物藥效的干擾，未采用這種方式進行藥效學(xué)評價。隨后又選擇了尾靜脈感染，這種感染方式下小鼠臟器菌量能在較長時間內(nèi)維持。MK主要引起肺部病變，所以選擇了肺組織作為評價藥效的主要臟器，鑒于尾靜脈感染能夠造成全身多器官感染，故又增加了脾組織評價藥效。

研究發(fā)現(xiàn)CAM和AZM的體內(nèi)活性明顯優(yōu)于體外，臨床常用藥物在MK中測定的MIC值多小于

1 mg/L[21-22]，而CAM和AZM在MK中測定的MIC值可高達4～8 mg/L。但在J774A.1細胞中，即使藥物處理濃度遠低于MIC值，依然顯示出了一定的抗菌活性，BALB/c小鼠體內(nèi)也具有較好的抗菌活性，兩藥的藥動學(xué)特征能夠在一定程度上解釋這種現(xiàn)象。以常用治療藥物RIF為例，它在體內(nèi)的組織濃度和血藥濃度相似，然而AZM的組織濃度可高于最大血漿濃度的50倍，細胞內(nèi)濃度可高于細胞外濃度的200倍[23]。大鼠單次給與80 mg/kg CAM灌胃24 h后，肺、脾組織與血漿中藥物濃度的比值可高達247和690[24]。CAM脂溶性強，能夠高度蓄積在組織中，這一特性有利于對NTM這種胞內(nèi)菌的清除。

MK感染至少需要3種藥物聯(lián)合治療1年以上，因此需要考慮藥物間的相互作用以及藥物的安全性。棋盤法結(jié)果顯示在實驗菌株中CAM和INH、RIF、具有部分協(xié)同作用，與本實驗中所用藥物無拮抗作用，因此CAM具有聯(lián)合用藥的可能。目前并未有和CAM具有協(xié)同或拮抗作用的藥物報道，這可能是由于CAM多用于細菌性鼻竇炎和急性氣管支氣管炎的治療，單藥治療即可。CAM具有較高的安全性，本實驗中連續(xù)28 d給予小鼠100 mg/kg CAM，小鼠體重在正常范圍內(nèi)，毛發(fā)具有光澤，精神活躍，未出現(xiàn)異常情況。由于空白對照組小鼠各臟器發(fā)生嚴重的炎癥反應(yīng)，臟器指數(shù)顯著高于給藥組，所以對照組體重和給藥組體重出現(xiàn)了顯著差異。CAM對人的安全劑量為800 mg/次，遠低于每日200 mg的服藥劑量，不良反應(yīng)的發(fā)生率極低，上市至今未有嚴重不良反應(yīng)的報道，這為長期用藥奠定了基礎(chǔ)[15]。

NTM好發(fā)于有支氣管擴張，囊性纖維化，慢性阻塞性肺疾病等肺部基礎(chǔ)疾病或免疫力低下的人群，患者常飽受多種疾病的困擾，治療非常復(fù)雜。CAM的多種藥理活性使其能夠應(yīng)用于復(fù)雜的臨床治療中，是其獨特的優(yōu)勢。首先CAM是廣譜抗菌藥，對多種常見細菌都有較好的抗菌活性[15]。其次，CAM具有較好的抗炎作用，能夠減輕肺組織損傷。在實驗中發(fā)現(xiàn)CAM治療可以顯著改善臟器指數(shù)，減少肺組織中炎癥細胞數(shù)量，降低肺組織損傷程度。在脂多糖和盲腸結(jié)扎穿孔法誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型中，CAM通過調(diào)控NF- B通路抑制肝、肺組織中TNF- ，IL-1和IL-6等促炎因子的RNA水平，顯著提高小鼠存活率[25]，在腫瘤合并膿毒癥患者中（ChiCTR2000032339）CAM治療也改善了多項炎癥指標。除此之外，CAM能通過抑制病毒RNA復(fù)制發(fā)揮抗病毒活性[26]，與硒蛋白H結(jié)合改變腫瘤細胞內(nèi)活性氧含量發(fā)揮抗腫瘤作用[27]。

相較于SPM，CAM改造的非常成功，CAM的主要成分為異戊酰螺旋霉素I-Ⅲ，螺旋霉素類衍生物的構(gòu)效關(guān)系研究表明4\"-O-?；梢栽鰪娍咕钚?，異戊酰基側(cè)鏈可以增加與核糖體靶點的相互作用，并且CAM的體內(nèi)生物利用度更高，口服絕對生物利用度可高達91.6%，因此CAM的體內(nèi)外抗菌活性均強于SPM[15]。

本研究還存在以下局限性：①菌株種類有限，臨床分離株均為治療效果較好的RIF敏感菌株，缺乏RIF耐藥的菌株；②動物模型種類有限，僅建立了BALB/c小鼠模型，與人體內(nèi)療效可能存在差異；③研究時間較短，小鼠模型中僅進行4周的治療。

本研究首次報道CAM具有和經(jīng)典治療藥物AZM相似的抗MK活性，認為其具有較好的臨床應(yīng)用前景，值得進一步開展相關(guān)臨床試驗驗證療效。

致謝：感謝上海同聯(lián)制藥有限公司提供研究用藥可利霉素；感謝王彬、李信達老師在實驗過程中的操作指導(dǎo)。

參 考 文 獻

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