黃芪甘草湯中總多糖提取工藝優(yōu)化*

毛浩洋，董方昕，金可欣，李思明

（哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076）

中藥復(fù)方用于防治疾病歷史悠久，現(xiàn)代藥理學(xué)表明，中藥復(fù)方作用具有多靶點、毒副作用較小的優(yōu)勢以及重要的研究價值[1]。黃芪甘草湯最早起源于《醫(yī)林改錯》，自宋代就已經(jīng)被記載應(yīng)用，具有大補元氣、緩急止痛、運化水濕的功效[2]。

多糖類化合物在現(xiàn)代藥理學(xué)研究中被證實具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、保肝、抗炎、調(diào)節(jié)血糖、血脂等多重功效[3-5]。從天然中藥中提取的多糖毒性小、活性高，兼有藥物治療作用和營養(yǎng)作用[6,7]。臨床試驗也證實，多糖可以減緩肝纖維化的進程，對腫瘤細胞具有靶向調(diào)節(jié)作用，可作為輔助藥物用于腫瘤和癌癥的化學(xué)治療或放射性治療[8,9]。

中藥中多糖類成分的提取率普遍不高，但因其豐富的藥理作用，一直是人們關(guān)注研究的焦點。本文將對黃芪甘草湯中總多糖提取工藝進行研究，篩選出最佳提取條件，為后續(xù)黃芪甘草湯中的多糖類成分研究奠定基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

中藥材黃芩、甘草，購于哈爾濱三棵樹藥材市場百味堂藥行；無水乙醇（AR ≥99.7% 天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（分析標(biāo)準(zhǔn)品HPLC ≥98% 上海源葉生物科技有限公司）；石油醚、H2SO4，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；苯酚（AR 天津市致遠化學(xué)試劑有限公司）；蒸餾水（哈爾濱市南崗區(qū)實林蒸餾水經(jīng)銷處）

1.2 儀器與設(shè)備

SE-750 型萬能粉碎機（永康市圣象電器有限公司）；BT25S 型電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；HH-2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市榮華儀器制造有限公司）；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器有限公司）；L-550 型臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；FD-550 型冷凍干燥機（上海一恒科技有限公司）；T6型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）

1.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用苯酚-硫酸法[10]測定糖含量。首先配制0.1mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，分別精密吸取葡萄糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6 和0.8mL，再分別加入蒸餾水至1mL，加入6%苯酚1mL、濃H2SO45mL，混勻后在80℃水浴中加熱30min，冷至室溫。在490nm 條件下，測定6 份溶液的吸光度，并以吸光度A 作為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度C 作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)回歸方程計算多糖含量。

多糖含量/%=C×V×D/m

式中 C：樣品溶液多糖濃度，mg·mL-1；V：樣品溶液體積，mL；D：稀釋倍數(shù)；m：樣品的質(zhì)量，mg。

1.4 單因素實驗

黃芪、甘草粉碎后置于石油醚中浸泡12h 進行脫脂，脫脂后將藥材粉末烘干，稱取黃芪5g、甘草1g，加入60mL 蒸餾水，溫度為80℃，提取1h，回流提取3 次，合并3 次提取液，抽濾后進行旋蒸濃縮至30mL，濃縮液中加入4 倍量無水乙醇，4℃靜置24h。離心收集沉淀，冷凍干燥24h 后得到多糖樣品。根據(jù)表1 進行單因素實驗，考察各因素對多糖得率的影響，平行實驗3 次，取平均值。

表1 單因素實驗表Tab.1 Single factor experiment

1.5 正交實驗

以黃芪甘草湯中總多糖得率為評價指標(biāo)，根據(jù)單因素實驗結(jié)果，篩選出對多糖得率影響較大的因素進行L9（34）正交實驗。

1.6 方法學(xué)考察

1.6.1 精密度實驗 精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液1mL，在490nm 處重復(fù)測定吸光度6 次，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 值。

1.6.2 穩(wěn)定性實驗 精密量取同一供試品溶液1mL，在490nm 處每隔30min 測1 次吸光度值，共測6 次，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 值。

1.6.3 重復(fù)性實驗 制備相同的供試品溶液6 份，測定6 組供試品溶液在490nm 處的吸光度值，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 值。

1.6.4 加樣回收實驗 配制0.1mg·mL-1供試品溶液。精密吸取0.5mL 供試液6 份，置于6 個試管中，分別加入0.5mL 葡萄糖對照品溶液，測定6 組溶液的吸光度，計算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值。

加樣回收率=測定量/（樣品加入量+對照品加入量）×100%

1.7 驗證實驗

根據(jù)正交實驗篩選出的最佳提取工藝條件，分別稱取3 份黃芪甘草湯藥材粉末，在此條件下，重復(fù)3 次實驗，驗證該工藝的可行性。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 提取溫度對黃芪甘草湯中多糖得率的影響

由圖1 可見，黃芪甘草湯中多糖得率受提取溫度的影響較大，伴隨水浴溫度的升高，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)溫度為80℃時，多糖得率最高，80～90℃之間，多糖得率呈下降趨勢，高溫可能會破壞多糖的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致多糖分解，從而影響得率。因此，將溫度作為考慮因素，選擇70、80、90℃3 個水平進行正交實驗。

圖1 提取溫度對黃芪甘草湯中多糖得率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharide in Huangqi Gancao Tang

2.1.2 料液比對黃芪甘草湯中多糖得率的影響

由圖2 可見，當(dāng)料液比小于1∶20（g:mL）時，隨料液比的增大，黃芪甘草湯中多糖的得率明顯升高；料液比為1∶20（g∶mL）時，多糖得率最高；料液比超過1∶20（g∶mL）后，多糖得率反而降低。當(dāng)溶劑較少時，多糖在溶劑中溶出逐漸趨于飽和，增加溶劑使多糖更容易溶出，但溶劑過多時其他水溶性物質(zhì)也會隨之溶出，影響多糖得率。因此，選擇1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL）3 個水平進行正交實驗。

圖2 料液比對黃芪甘草湯中多糖得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the yield of polysaccharide in Huangqi Gancao Tang

2.1.3 提取時間對黃芪甘草湯中多糖得率的影響

由圖3 可見，多糖得率隨提取時間的增加并沒有明顯改變，提取時間為1h 時的多糖得率最高，隨后降低，在2h 時有略微升高，隨后逐漸降低。藥材中多糖含量是一定的，在提取時間1h 內(nèi)多糖可能全部溶出，總體而言，提取時間對多糖得率影響較小，所以不作為考慮因素，因此，在正交實驗中選擇最佳提取時間為1h。

圖3 提取時間對黃芪甘草湯中多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of polysaccharide in Huangqi Gancao Tang

2.1.4 提取次數(shù)對黃芪甘草湯中多糖得率的影響

由圖4 可見，提取次數(shù)對黃芪甘草湯中多糖得率影響較小，雖然多糖得率隨著提取次數(shù)的增加逐漸升高，但總體比較穩(wěn)定，變化不明顯，當(dāng)提取3 次時，多糖得率趨于穩(wěn)定，所以提取次數(shù)不作為考慮因素。綜合實際而言，當(dāng)提取次數(shù)為3 次時，更加節(jié)能省時，因此，選擇最佳提取次數(shù)為3 次。

圖4 提取次數(shù)對黃芪甘草湯中多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction times on the yield of polysaccharide in Huangqi Gancao Tang

2.1.5 脫脂時間對黃芪甘草湯中多糖得率的影響

由圖5 可見，隨著脫脂時間的增加，多糖得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)脫脂時間為6h 時，多糖得率最高，脫脂時間超過6h 后，多糖得率稍有下降。這是因為，長時間有機溶劑脫脂可能會破壞藥材細胞壁結(jié)構(gòu)，造成多糖流失。因此，對脫脂時間的篩選是必要的，故選擇4、6、8h 脫脂時間進行正交實驗。

圖5 脫脂時間對黃芪甘草湯中多糖得率的影響Fig.5 Effect of degreasing time on the yield of polysaccharide in Huangqi Gancao Tang

2.2 正交實驗結(jié)果

根據(jù)單因素考察結(jié)果，進行正交實驗設(shè)計，見表2，正交實驗結(jié)果見表3，正交實驗結(jié)果方差分析見表4。

表3 正交實驗結(jié)果Tab.3 Orthogonal experimental results

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

由表3 可見，RA＞RC＞RB，R 值的大小與多糖得率呈正相關(guān)，因此，多糖得率影響因素的大小順序為：提取溫度＞脫脂時間＞料液比。提取溫度：K2＞K1＞K3，料液比：K2＞K3＞K1，脫脂時間：K2＞K3＞K1，K 值越大表示該水平對多糖得率的影響越大，因此，最優(yōu)提取組合為A2B2C2，即提取溫度為80℃、料液比為1∶20（g∶mL）、脫脂時間為6h、提取時間為1h、提取次數(shù)3 次。

由表4 可見，提取溫度和料液比能夠顯著影響黃芪甘草湯中多糖得率（P＜0.05），而脫脂時間對于黃芪甘草湯中多糖得率無顯著影響（P＞0.05）。

2.3 方法學(xué)考察結(jié)果

2.3.1 精密度實驗 實驗中測得吸光度分別為0.760、0.758、0.787、0.753、0.759、0.759，平均吸光度為0.763，計算RSD 值為1.6%，表明儀器精密度較高，測量值較準(zhǔn)確。

2.3.2 穩(wěn)定性實驗 實驗中測得吸光度分別為0.758、0.755、0.755、0.752、0.751、0.757，平均吸光度為0.755，RSD 值為0.4%，表明供試品溶液在3h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性實驗 實驗中測得吸光度分別為0.745、0.744、0.746、0.745、0.745、0.746，平均吸光度為0.746，RSD 值為0.18%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 加樣回收實驗 加樣回收率分別為98.47%、98.69%、101.29%、98.67%、101.53%、102.72%，平均加樣回收率為100.23%，RSD 值為1.9%，表明該實驗含量測定方法正確可靠。

2.4 驗證實驗結(jié)果

在最佳提取工藝（提取溫度80℃、料液比1∶20（g∶mL）、脫脂時間6h、提取時間1h、提取次數(shù)3 次，平行實驗3 次）條件下，3 次提取黃芪甘草湯中多糖的得率分別為9.56%、9.82%、9.75%，多糖平均得率為9.71%，且高于正交實驗各組結(jié)果，表明該提取工藝穩(wěn)定、可行。

3 結(jié)論

本文通過單因素與正交實驗對黃芪甘草湯中總多糖成分進行提取工藝優(yōu)化，得出黃芪甘草湯中總多糖平均得率為9.71%，該實驗為中藥復(fù)方多糖的提取以及后續(xù)黃芪甘草湯水提物中總多糖成分的生物活性和藥理作用研究提供了參考和依據(jù)。