犬源乳酸桿菌的分離鑒定及篩選

關鍵詞： 犬；乳酸菌；分離鑒定；篩選

中圖分類號： S829.21 文獻標志碼： A 文章編號： 1004–390X （2024） 06?0066?09

乳酸菌是一類能在可利用的碳水化合物發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量乳酸的細菌，乳酸菌發(fā)酵除了產(chǎn)生乳酸外，還能產(chǎn)生其他有機酸。乳酸菌按發(fā)酵類型可分為3 大類：同型乳酸發(fā)酵、異型乳酸發(fā)酵和兼性異型乳酸發(fā)酵[1]。同型乳酸發(fā)酵是指葡萄糖經(jīng)過糖酵解途徑發(fā)酵，只生成乳酸作為代謝產(chǎn)物[2]；異型乳酸發(fā)酵通過戊糖磷酸途徑發(fā)酵，除了主要產(chǎn)生乳酸外，還產(chǎn)生乙醇、乙酸、二氧化碳等多種產(chǎn)物[3]；兼性異型乳酸發(fā)酵則同時進行同型乳酸發(fā)酵和異型乳酸發(fā)酵，其進行程度和比例取決于菌種性質(zhì)和外界培養(yǎng)條件[4]。乳酸菌廣泛存在于自然界中[5-6]，它們可以定植在人和動物的黏膜表面，如口腔黏膜、呼吸道黏膜、消化道黏膜和泌尿生殖道黏膜[7-9]。消化道中的乳酸菌含量和種類最豐富，且不同消化道部位的乳酸菌種類和數(shù)量有較大差異，胃中的乳酸菌較腸道少，由于胃酸的作用，大多數(shù)乳酸菌都定植于結腸[6]。

犬不僅能充當人的伴侶，還能協(xié)助人類工作，如毒品檢查、追捕嫌疑人、搜救、為盲者引路、為聾者助聽、提供動物輔助治療等[9-10]。益生菌具有無毒、無害、安全無副作用的特點，對宿主健康有一定的促進作用，現(xiàn)已成功進入寵物市場[11]。然而，有關犬的臨床益生菌研究較少，種類稀缺，且質(zhì)量和效果參差不齊[12]。寵物醫(yī)院使用的益生菌，如普羅培爾、媽咪愛、整腸生等，主要為人用益生菌，近幾年推出的寵兒香和腸胃寶則是犬貓通用益生菌，市場上幾乎沒有使用犬源益生菌菌株生產(chǎn)的微生態(tài)制劑[12-13]。中國養(yǎng)犬基數(shù)龐大，擁有廣闊的市場，目前，乳酸菌在犬腹瀉的預防與控制、提高犬的免疫力等方面取得了良好的效果和反饋[12， 14]，未來還有更廣闊的應用前景。因此，本研究以健康昆明犬糞便為研究對象，進行乳酸桿菌的分離鑒定和篩選，以期獲得優(yōu)質(zhì)犬源性乳酸桿菌，為研制適合犬的益生菌制劑提供物質(zhì)基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

20份糞便樣本采自昆明市某警犬訓練基地。隨機采集體質(zhì)量為25～35kg、體況良好且已完成免疫和驅(qū)蟲的20只成年昆明犬的糞便樣本，使用冰塊低溫保存后運回實驗室。

1.1.2 主要試劑

2×TransTaq? High Fidelity （HiFi） PCR Super-Mix II 購自北京全式金生物科技有限公司；柱式DNA 膠回收試劑盒購自生工生物工程（上海） 有限公司；pMD? 18-T 克隆載體試劑盒和大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞購自寶生物工程（大連） 有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒和細菌基因組DNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京） 有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理

從健康昆明犬直腸無菌采集糞便樣品約1 g置于離心管中，加入無菌生理鹽水9 mL，漩渦振蕩5 min，使糞便與生理鹽水混勻備用。

1.2.2 乳酸桿菌分離

取混勻的糞便浸液1 mL 進行10?6梯度稀釋，然后取稀釋后的糞便浸液100μL均勻涂布于MRS 瓊脂培養(yǎng)基，在37 ℃ 厭氧條件下培養(yǎng)36～48 h。

1.2.3 分離菌株的純培養(yǎng)、保存和形態(tài)學觀察

觀察菌落的形態(tài)、顏色和邊緣特征，挑選菌落形態(tài)一致的單菌落在MRS 平板上劃線培養(yǎng)，在37 ℃ 厭氧條件下培養(yǎng)36～48 h；挑取純培養(yǎng)的單菌落接種到MRS 肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃ 厭氧條件下培養(yǎng)24 h；將培養(yǎng)的菌液與甘油按照體積比7∶3 添加至無菌凍存管中混勻，置于?20 ℃保存。觀察純培養(yǎng)菌株菌落的大小、顏色和邊緣特征，將其進行革蘭氏染色鏡檢，觀察染色情況和細菌形態(tài)。

1.2.4 過氧化氫酶接觸試驗

將染色呈紫色且沒有芽孢的菌株繼續(xù)進行過氧化氫酶接觸試驗。吸取少量3% 過氧化氫溶液到載玻片中央，用灼燒過的接種環(huán)挑取單菌落并在載玻片中央進行涂抹，觀察是否有氣泡。

1.2.5 16S rDNA分子生物學鑒定

將分離的疑似乳酸桿菌接種于MRS 肉湯培養(yǎng)基進行活化培養(yǎng)，根據(jù)細菌基因組DNA 提取試劑盒操作說明書提取疑似乳酸桿菌的基因組DNA，使用細菌16S rDNA 擴增通用引物擴增疑似菌株的16S rDNA 序列，引物序列為16S rDNAF：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，16S rDNA-R：GTTACCTTGTTACGACTT。先通過1.5% 瓊脂糖凝膠對PCR 產(chǎn)物進行分離純化和分子克隆，再按質(zhì)粒提取試劑盒的操作說明提取質(zhì)粒，送至生工生物技術有限公司進行測序。使用Megalign 軟件進行同源性比較分析，參考序列見表1。

1.2.6 糖發(fā)酵生化鑒定

參照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》（GB 4789.35—2016） 的標準，使用纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖和七葉苷對分離菌株進行鑒定，挑取純培養(yǎng)菌落接種于糖發(fā)酵管中，在37 ℃ 厭氧條件下培養(yǎng)36～48 h，觀察培養(yǎng)基的變化情況。

1.2.7 乳酸桿菌篩選

（1） 耐酸試驗通過模擬動物低pH 胃酸環(huán)境，篩選具有較強抗性的菌株。分別配制pH=2 和pH=3 的MRS肉湯，按體積的2% 接種已提前活化的乳酸桿菌，分別在0 和6 h 吸取培養(yǎng)物 200 μL，測定其在600nm 處的OD值。每個菌株設置2個重復，計算6h后OD值之差，并進行數(shù)據(jù)分析。

（2） 耐膽鹽試驗

為檢測分離菌株對膽鹽的耐受能力[15]，將篩選出對胃酸環(huán)境具有較強抗性的菌株接種至pH=3、膽鹽質(zhì)量分數(shù)分別為0.3%、0.4% 和0.5%的MRS 液體培養(yǎng)基；按體積的2% 接種MRS 肉湯，分別在0 和6 h 吸取培養(yǎng)物 200 μL，測定其在600nm 處的OD值。每個菌株設置2個重復，計算培養(yǎng)6 h 后OD 值之差，并進行數(shù)據(jù)分析。

（3） 體外抑菌試驗

采用單層瓊脂擴散法和混合培養(yǎng)法[16]對耐酸、耐膽鹽試驗中具有較好耐受性的乳酸桿菌進行進一步的篩選。

單層瓊脂擴散法：按照MH 瓊脂培養(yǎng)基的配制方法準備培養(yǎng)基，冷卻至40 ℃，在培養(yǎng)基中分別加入適量的大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌菌液，充分混勻后傾倒至無菌培養(yǎng)皿中，在37 ℃培養(yǎng)30min 以固定致病菌。在平板上打3個直徑8mm、深6mm 的孔，將供試菌培養(yǎng)物接種至滿孔，于37 ℃培養(yǎng)18h，之后用游標卡尺測量抑菌圈直徑。

混合培養(yǎng)法：分別在大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌試驗組的5mL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中加入待測的乳酸桿菌培養(yǎng)物1 mL，按照總體積的2% 添加大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌；陽性對照組為5 mL營養(yǎng)肉湯中添加未培養(yǎng)過的乳酸桿菌MRS肉湯1 mL，并按總體積的2% 添加致病菌；陰性對照組為5 mL 營養(yǎng)肉湯中添加未培養(yǎng)過的乳酸桿菌MRS 肉湯1 mL。各處理于37 ℃ 培養(yǎng)24 h，測量各組的OD值；提取各管菌液基因組DNA，使用qPCR 檢測方法檢測絕對表達量，引物信息見表2。

2 結果與分析

2.1 乳酸桿菌的分離鑒定

2.1.1 分離菌株的形態(tài)特征

從20份昆明犬糞便中分離得到18株菌株（表3），且不同菌株的菌落形態(tài)差異較大，主要有6 種不同形態(tài)的菌落（圖1），革蘭氏染色結果顯示均為革蘭氏陽性桿菌（圖2），無芽孢，催化酶試驗均為陰性，初步鑒定所分離的菌株均為乳酸桿菌。

2.1.2 16S rDNA分子生物學鑒定

16S rDNA 擴增結果（圖3） 顯示：擴增片段大小與預期目的片段在1 526～1 540 bp 范圍內(nèi)一致。16S rDNA 核苷酸同源性比對結果（圖4～5） 顯示：1、2、3、6、9、10、11、12、14、16 號分離菌株與羅伊氏乳桿菌的核苷酸同源性最高，為97.6%～99.7%；4、5、7 號分離菌株與嗜酸乳桿菌的核苷酸同源性最高，為96.4%～99.8%；18 號分離菌株與唾液乳桿菌的核苷酸同源性最高，為96.6%～98.3%；13、15 號分離菌株與動物乳桿菌的核苷酸同源性最高，為98.9%～99.9%；8 號菌株與約氏乳桿菌的核苷酸同源性最高，為97.6%～99.8%；17 號菌株與鼠乳桿菌的核苷酸同源性最高，為98.2%～99.3%。

2.1.3糖發(fā)酵生化鑒定

由表4 可知：1、2、3、6、9、10、11、12、14、16號菌株的生化特性符合羅伊氏乳桿菌的特征；4、5、7 號分離菌株的生化特性與嗜酸乳桿菌相符；13、15 號菌株的生化特性與動物乳桿菌相符；8 號菌株的生化特性與約氏乳桿菌相符；17 號菌株的生化特性與鼠乳桿菌相符；18號菌株的生化特性與唾液乳桿菌相符。生化鑒定結果與16S rDNA 測序結果一致，表明分離得到了10 株羅伊氏乳桿菌、3株嗜酸乳桿菌、2株動物乳桿菌、1株約氏乳桿菌、1株唾液乳桿菌和1 株鼠乳桿菌，并對18 株分離株進行重新編號（表4）。

2.2 乳酸桿菌篩選

2.2.1 耐酸試驗結果

由表5可知：菌株LR2、LR6、LR10、LA1、LA2、LA3、LS、LJ、LM 和LAN1 的OD 值增長明顯，能夠有效適應胃酸環(huán)境，保持存活，故選擇這10 株菌株進行后續(xù)研究。

2.2.2 耐膽鹽試驗結果

由表6可知：隨著膽鹽質(zhì)量分數(shù)的增加，OD 值總體呈減小趨勢，乳酸桿菌的耐受能力逐漸減弱。菌株LR2、LA2、LS、LJ、LM 和LAN1在3個質(zhì)量分數(shù)的膽鹽MRS 中均表現(xiàn)出較好的抵抗能力（OD 值較其他菌株大），因此，選擇這6 株菌株進行后續(xù)研究。

2.2.3 體外抑菌能力

單層瓊脂擴散法的試驗結果（表7） 顯示：相較于其他菌株，LM 菌株對大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌具有更強的抑制效果，平均抑菌圈直徑分別為13.08 和13.16 mm；混合培養(yǎng)法的試驗結果（表8） 表明：LM 菌株對大腸桿菌（OD值為0.0633）和鼠傷寒沙門氏菌（OD 值為0.063 7） 也表現(xiàn)出較強的抑制能力。

3討論

3.1乳酸桿菌的篩選與鑒定

益生菌在維持人類健康方面已經(jīng)有許多應用，已知益生菌在促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收、改善胃腸道微環(huán)境、增強免疫功能、控制血清膽固醇水平、減少腸內(nèi)感染、消除體內(nèi)有毒物質(zhì)等方面具有重要作用[7， 17-19]。對犬、貓等寵物的研究也表明：胃腸道微生物對胃腸道健康起著重要的作用[11， 20]，參與胃腸道內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消化，并可通過肺腸軸、腦腸軸等調(diào)節(jié)機體的生命活動和免疫功能，對維持機體穩(wěn)態(tài)具有重要意義[12-13]。乳酸菌是目前國內(nèi)外最常見的益生菌，也是研究最多的益生菌[19， 21]，但并非所有乳酸菌都是益生菌，即使是相同菌種，由于菌株不同，產(chǎn)生的益生功效可能相差很大[21]。益生菌具有以下特點：在體內(nèi)不易被殺死；數(shù)量多，只有大量攝入并且大量存活在體內(nèi)才能發(fā)揮功效；對正常的菌群結構產(chǎn)生顯著影響，使有益菌繁殖從而抑制有害菌生長；產(chǎn)生其他促進健康的作用，如免疫調(diào)節(jié)等[7， 21]。人或動物通過口服形式攝取益生菌，益生菌必須經(jīng)過胃酸環(huán)境才能抵達腸道，還要經(jīng)受腸道中膽鹽等成分引起的高滲環(huán)境，才能最終在腸道定植[6-7]。因此，對酸和膽鹽的耐受性是篩選益生菌的重要指標。本研究通過細菌分離、16S rDNA測序與生化鑒定，從20份健康昆明犬糞便中分離獲得18 株乳酸桿菌，其中包括10株羅伊氏乳桿菌、3株嗜酸乳桿菌、2株動物乳桿菌、1株約氏乳桿菌、1株唾液乳桿菌和1株鼠乳桿菌。為進一步評估分離菌株在體內(nèi)的生存能力，將18株菌株接種到不同酸堿度（pH 2和pH 3） 以及不同膽鹽質(zhì)量分數(shù)（0.3%、0.4%、0.5%） 的MRS 肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6 h 后測定OD600 值變化，表明分離菌株LR2、LA2、LAN1、LJ、LM 和LS 具有較好的耐受性，能夠有效適應體內(nèi)消化系統(tǒng)環(huán)境。

3.2 乳酸桿菌對病原菌的抑制作用

乳酸菌的表面成分（如表層蛋白、脂磷壁酸、完整肽聚糖等） 以及菌體自身代謝分泌的產(chǎn)物（如有機酸、抗菌肽） 會刺激宿主腸道上皮細胞，引起免疫應答[22-23]。乳酸菌可以通過多種信號傳導途徑調(diào)節(jié)機體免疫[24]。因此，乳酸菌在維持腸道菌群平衡方面具有重要作用，它不僅可以與病原菌競爭黏附于小腸上皮細胞，而且其自身代謝的產(chǎn)物（如乳酸、甲酸、乙酸、丙酸和丁酸[22-23]）也對病原菌的活性具有一定的抑制作用。本研究在體外環(huán)境下，通過單層平板擴散法和混合培養(yǎng)法測試LR2、LA2、LAN1、LJ、LM 和LS 菌株耗竭培養(yǎng)物對大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌增殖的影響，結果表明LM 菌株對鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌均表現(xiàn)出良好的抑制作用。

4 結論

本研究從犬糞便中分離獲得18株犬源乳酸菌，經(jīng)過耐酸和耐膽鹽試驗篩選獲得6 株可耐受胃腸環(huán)境的菌株（LR2、LA2、LAN1、LJ、LM 和LS），進一步抑菌試驗篩選出對大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌具有較強抑制作用的鼠乳桿菌LM 菌株，為犬源性生物制劑的研發(fā)提供了科學依據(jù)。

責任編輯：何承剛