蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)與相關(guān)疾病研究進(jìn)展

葛璟燕,檀 維,洪大偉,張 蓓

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,浙江 杭州 310014)

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ),其合成過(guò)程須經(jīng)過(guò)多肽鏈的正確折疊,形成三維構(gòu)象,從而具備生理活性。蛋白質(zhì)的正確折疊對(duì)其在生物體內(nèi)發(fā)揮作用至關(guān)重要[1]。其中,蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊過(guò)程中,兩個(gè)半胱氨酸殘基間形成的二硫鍵是獲得蛋白質(zhì)正確構(gòu)象的重要步驟之一。在真核細(xì)胞中,近三分之一蛋白的結(jié)構(gòu)中,至少含有一個(gè)二硫鍵[2]。在這個(gè)過(guò)程中,蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(Protein disulfide isomerase,PDI)發(fā)揮了不可忽視的作用。PDI作為一種氧化還原酶,負(fù)責(zé)蛋白折疊過(guò)程中二硫鍵的裂解、形成和重排[3-4]。此外,PDI也通過(guò)催化天然蛋白二硫鍵的異構(gòu)化,調(diào)節(jié)相應(yīng)的蛋白質(zhì)折疊,發(fā)揮蛋白伴侶的功能并維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[5]。研究表明在多種疾病中PDI表現(xiàn)出過(guò)表達(dá)或失活狀態(tài)。筆者將從PDI家族的結(jié)構(gòu)、種類(lèi)、活性檢測(cè)方法和相關(guān)疾病等方面進(jìn)行綜述,以期為PDI及其病理研究提供新思路。

1 PDI結(jié)構(gòu)

到目前為止,已發(fā)現(xiàn)了21個(gè)PDI家族成員,由于其他PDI家族成員的結(jié)構(gòu)和機(jī)制特征與典型的PDI(PH4B,PDIA1)類(lèi)似,故以PDI為例簡(jiǎn)單闡述其家族的結(jié)構(gòu)[6-8]。PDI結(jié)構(gòu)域如圖1所示,其含有4個(gè)Trx結(jié)構(gòu)域(a,b,b′,a′)、一個(gè)鏈接子X(jué)和C末端延伸區(qū),其中C末端包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號(hào)肽序列KDEL。這4個(gè)域使得PDI呈現(xiàn)U型結(jié)構(gòu),U型轉(zhuǎn)折裂縫含有疏水表面,使酶能夠特異性地結(jié)合展開(kāi)的底物,識(shí)別結(jié)合折疊的蛋白[9-10]。a和a′結(jié)構(gòu)域均含一個(gè)由CXXC序列(X是任意一天然氨基酸)組成的活性催化位點(diǎn),獨(dú)特的4個(gè)半胱氨酸側(cè)鏈巰基參與底物二硫鍵的交換反應(yīng)。a結(jié)構(gòu)域起催化作用,a′結(jié)構(gòu)域起非催化作用,影響著PDI催化的活性[9]。CXXC序列中的兩個(gè)半胱氨酸殘基的側(cè)鏈既可以是自由巰基,也可以形成一對(duì)二硫鍵,與新合成的蛋白質(zhì)的巰基發(fā)生反應(yīng),并且氧化還原能力受中間兩個(gè)氨基酸的影響。任意一個(gè)半胱氨酸活性位點(diǎn)的缺失可導(dǎo)致酶催化能力減弱一半[11],兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)受到抑制則會(huì)導(dǎo)致酶催化功能的喪失[12]。

在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,約50% PDI的a和a′結(jié)構(gòu)域活性中心處于還原狀態(tài),另外15% PDI的a′結(jié)構(gòu)活性中心處于氧化態(tài)[13]。N末端的活性半胱氨酸一般裸露在蛋白質(zhì)表面,pKa值為4.5～5.6;而C末端的半胱氨酸在內(nèi)部疏水區(qū),pKa值為12.8[14-15],因此PDI蛋白的活性呈現(xiàn)pH依賴(lài)性。PDI活性中心的氧化-還原狀態(tài)與其發(fā)揮的功能息息相關(guān)。當(dāng)PDI的活性中心處于氧化態(tài)時(shí),底物的二硫鍵得以形成,PDI則形成還原狀態(tài);相反,當(dāng)PDI的活性中心處于還原態(tài)時(shí),底物會(huì)被氧化或異構(gòu)化。當(dāng)PDI活性中心氧化還原狀態(tài)發(fā)生紊亂時(shí),未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白開(kāi)始積累,引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress),細(xì)胞會(huì)通過(guò)未折疊蛋白反應(yīng)UPR(Unfolded protein response)來(lái)維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)強(qiáng)或持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞啟動(dòng)凋亡程序[16-17]。消除紊亂的蛋白則需要建立一個(gè)平衡機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)UPR,以防止因病理蛋白導(dǎo)致的疾病的發(fā)生。

b和b′結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)參與底物的識(shí)別結(jié)合,序列相似度(16.5%)比a和a′結(jié)構(gòu)域(33.6%)小,bb′非催化結(jié)構(gòu)域與aa′催化域相比表現(xiàn)出更多的結(jié)構(gòu)多樣性,且不含CGHC序列,因此沒(méi)有氧化還原活性[6]。

Denisov等[18]利用核磁共振滴定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)未折疊核糖核酸酶、胡蜂蜂毒肽及生長(zhǎng)抑素與b′結(jié)構(gòu)域的疏水表面結(jié)合。相較于b和其他結(jié)構(gòu)域,b′結(jié)構(gòu)域展現(xiàn)出更大的序列多樣性,其主導(dǎo)底物結(jié)合的特異性。另外,X鏈接子也起到一定的調(diào)節(jié)作用。X鏈接子大約由20個(gè)氨基酸組成,位于a′與b′結(jié)構(gòu)域之間。通過(guò)b′X晶體結(jié)構(gòu)的測(cè)定及模擬,發(fā)現(xiàn)X鏈接子可穩(wěn)定底物與b′結(jié)構(gòu)域的N端部分(7個(gè)氨基酸)垂直進(jìn)入b′結(jié)合域β5折疊股,而C端部分折回并靠近b′結(jié)合域α1和α2螺旋疏水表面。當(dāng)去除X鏈接子時(shí),b′結(jié)合域的穩(wěn)定性下降[19]。X鏈接子仿佛起到橋梁的作用,使各部分緊密相連,更好地發(fā)揮彼此的功能。

2 PDI家族的作用

PDI家族成員有21個(gè),具體如表1所示。PDI家族成員的共性很多,其主要功能是催化新生肽鏈的氧化折疊,發(fā)揮蛋白氧化還原、異構(gòu)和分子伴侶等的作用,然而PDI家族成員的生物功能不盡相同,尤其酶活性、催化底物都有很大的差別。目前針對(duì)PDI家族的體外研究較多,由于體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜,參與的底物豐富,并且與底物形成的復(fù)合物壽命較短,使得針對(duì)PDI家族的體內(nèi)研究較少,其功能仍有待開(kāi)發(fā)。PDI家族成員之間的功能有一定重疊,當(dāng)缺少某一種時(shí),其他的成員相應(yīng)回補(bǔ)挽救,因此對(duì)單一成員的研究有一定難度。下面將簡(jiǎn)單介紹以下3種了解較透徹的PDI成員。

表1 人類(lèi)PDI家族蛋白概覽

2.1 PDI(PDIA1,PH4B)

PDI在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的含量最高,含有KDEL序列,主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中駐留,可達(dá)到毫摩爾每升的水平,其通過(guò)催化蛋白底物的氧化折疊改變底物狀態(tài)而發(fā)揮不同生理作用[10]。研究發(fā)現(xiàn):當(dāng)PDI活性位點(diǎn)被抑制,細(xì)胞PDI基因被敲除后,會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化[20],而非活性位點(diǎn)的突變也會(huì)影響其活性[21]。同時(shí)PDI家族的其他成員不能完全代替并挽救PDI的生物功能。PDI的底物具有多樣性:CHO細(xì)胞被病毒感染,兩種病毒膜糖蛋白可與PDI形成瞬時(shí)的合二硫代物[22];在成纖維細(xì)胞中,PDI與其底物前膠原I和前膠原Ⅲ之間存在密切聯(lián)系[23];在分泌二聚體蛋白甲狀腺球蛋白的甲狀腺細(xì)胞中,甲狀腺球蛋白的瞬時(shí)折疊中間體可與PDI形成二硫鍵[24]。PDI催化蛋白折疊過(guò)程中二硫鍵的氧化還原,其構(gòu)象處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程,從而維護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)[25]。

2.2 ERp57(PDIA3)

ERp57是PDI家族中功能被研究得比較透徹的一個(gè)氧化還原性質(zhì)的分子伴侶。ERp57可以清除錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì),抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[26]。ERp57底物結(jié)合的特異性與PDI相似。ERp57可以與凝集素伴侶分子鈣聯(lián)蛋白CNX和鈣網(wǎng)蛋白CRT結(jié)合。用藥物干擾CNX和CRT的結(jié)合位點(diǎn)可有效阻止ERp57和糖蛋白的相互作用[27-28],因此糖蛋白二硫鍵的形成可能與ERp57催化功能相關(guān)。細(xì)胞表面CNX-ERp57復(fù)合物還原胞外二硫鍵是細(xì)胞外基質(zhì)降解的必要條件[29]。ERp57也可作為補(bǔ)體來(lái)調(diào)控凝集素途徑[30]。

Blees等[31]通過(guò)低溫電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)ERp57是主要組織相容性類(lèi)MHC-1肽組裝復(fù)合體的一部分,通過(guò)a和a′區(qū)域的U型結(jié)構(gòu)與伴侶分子Tapasin結(jié)合形成二硫鍵,參與對(duì)腫瘤和病毒的免疫反應(yīng)。MHC-I通路中兩個(gè)重要因子ERp57和Tapasin的相互作用對(duì)抗原提呈腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生顯著影響[32]。血凝素作為一種表面免疫原蛋白,是流感病毒的重要組成部分。ERp57可以還原血凝素,降低二硫鍵綁定的血凝素三聚體的百分比,從而提高H3N2流感病毒血凝素的穩(wěn)定性和免疫原性[33]。對(duì)ERp57的研究有助于開(kāi)發(fā)預(yù)防流感大流行的疫苗。

2.3 ERp44(PDIA10)

ERp44由a-b-b′ 3個(gè)域構(gòu)成V型結(jié)構(gòu),N端含有CRFS序列,然而缺乏C端的活性區(qū)域[34]。ERp44主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體中間室和順式高爾基體區(qū)域,其C末端會(huì)因亞細(xì)胞pH的差異導(dǎo)致ERp44結(jié)構(gòu)的改變,從而影響ERp44與底物的結(jié)合[35-37]。ERp44的底物較廣泛,包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶Ero1α和Ero1β(高度保守的黃素酶,與FAD一起產(chǎn)生二硫鍵并優(yōu)先將其轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶上)、Ⅰ型1,4,5-三磷酸肌醇受體ITPR1等。ERp44在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中被誘導(dǎo),通過(guò)C29位點(diǎn)特異性與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶Erolα結(jié)合,并形成二硫鍵交聯(lián)中間體,通過(guò)該介導(dǎo)作用,使得Ero1α活性降低且滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[38]。ERp44與三磷酸肌醇受體間的相互作用對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)起到重要作用[39]。

ERp44也參與病理的發(fā)生和發(fā)展,可作為結(jié)直腸癌患者復(fù)發(fā)情況的指示蛋白[40]。敲低ERp44的表達(dá)水平,細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白如caspase-3,GRP78水平升高,caspase-12被激活,表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,進(jìn)一步表明ERp44沉默通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[41]。

3 PDI活性的檢測(cè)方法

PDI是一種氧化酶、還原酶及異構(gòu)酶,在過(guò)去的幾十年里,測(cè)定PDI酶活性以及篩選抑制劑的方法相對(duì)成熟。下面將簡(jiǎn)單討論P(yáng)DI酶的3種活性測(cè)定方法,以便用于高通量篩選PDI抑制劑,同時(shí)也將簡(jiǎn)單闡述這些方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

3.1 還原活性測(cè)定

3.1.1 胰島素濁度測(cè)定方法

胰島素由A,B兩條肽鏈通過(guò)二硫鍵交聯(lián)組成[42]。PDI作為一種還原酶可以破壞A,B鏈之間的兩個(gè)二硫鍵,致使B鏈聚集,而A鏈仍可溶。因此一般在供體谷胱甘肽或二硫蘇糖醇存在下,最終以過(guò)氧化氫淬滅反應(yīng),通過(guò)OD650可檢測(cè)B鏈的濁度,從而間接得知PDI還原酶的活性[43]。該檢測(cè)方法雖然簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)且高效,可以用于高通量抑制劑篩選,但濁度的靈敏度較低,谷胱甘肽和二硫蘇糖醇也存在一定的還原能力,檢測(cè)過(guò)程中容易出現(xiàn)假陰性的情況。

3.1.2 熒光檢測(cè)方法

熒光檢測(cè)方法利用兩個(gè)相同發(fā)色基團(tuán)(氨基苯、伊紅)連接在氧化型谷胱甘肽的兩邊,PDI的加入使得中間二硫鍵斷開(kāi),熒光基團(tuán)的淬滅效應(yīng)降低,熒光增強(qiáng)[44]。根據(jù)熒光的強(qiáng)度計(jì)算PDI的活性。該方法簡(jiǎn)單且靈敏度比胰島素濁度法高,適用于血小板等復(fù)雜樣本中PDI活性的測(cè)定。

3.2 氧化活性測(cè)定

PDI最初是因其具有催化還原RNase復(fù)性的能力而被分離出來(lái)的。RNase通過(guò)催化磷酸二酯鍵的水解來(lái)消化RNA,不活躍的還原性RNase被PDI氧化而復(fù)性。具有活性的RNase隨后催化循環(huán)單磷酸胞苷(cCMP)水解生成CMP,導(dǎo)致296 nm處的吸光度增加。因此cCMP的水解速率間接反映了PDI的氧化酶活性。然而該方法的影響因素較多,如反應(yīng)的pH、鹽濃度、cCMP和復(fù)性的程度等。同時(shí),很多抑制劑也會(huì)在測(cè)量波長(zhǎng)下有吸收,導(dǎo)致該方法的局限性較大[45]。

3.3 異構(gòu)酶活性測(cè)定

PDI可以催化被完全氧化并形成雜亂的二硫鍵失活狀態(tài)的RNase中分子間和分子內(nèi)二硫鍵的交換異構(gòu),從而導(dǎo)致新的二硫鍵的形成,使RNase酶活性恢復(fù)。利用RNA作為底物,RNase活性的測(cè)定間接反映了PDI的異構(gòu)酶活性。然而該方法依賴(lài)含無(wú)序二硫鍵的RNase的制備,批次之間的重復(fù)率不高[46]。

4 PDI相關(guān)疾病

目前針對(duì)PDI及其家族的研究雖然越來(lái)越多,了解得也越來(lái)越透徹,但其低表達(dá)或過(guò)表達(dá)都可能會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生,下面重點(diǎn)簡(jiǎn)述與PDI相關(guān)的幾種疾病。

4.1 PDI與癌癥

近期,通過(guò)芯片技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)在腦癌[47]、淋巴癌[48]、肺癌[49]和卵巢癌[50]等不同的癌癥組織中PDI至少上調(diào)兩倍。PDI也在乳腺癌的細(xì)胞間隙液中高表達(dá),可作為乳腺癌前期檢測(cè)的生物標(biāo)志物。高表達(dá)的PDI也與癌癥的轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān),針對(duì)ER折疊因子,特別是PDI家族成員,可能改善轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療效果[51]。目前,針對(duì)PDI抑制劑的開(kāi)發(fā)也逐漸增多。比如Neamati課題組通過(guò)將PACMA31與熒光物質(zhì)BODIPY結(jié)合,發(fā)現(xiàn)PACMA31是PDI的共價(jià)結(jié)合抑制劑,抑制PDI的Cys397或Cys400活性位點(diǎn),同時(shí)在不同的卵巢癌細(xì)胞系中表現(xiàn)出較好的抑制效果[50]。

4.2 PDI與神經(jīng)退行性疾病

神經(jīng)退行性疾病,比如阿爾茨海默病、帕金森、亨廷頓病和肌萎縮側(cè)索硬化癥等,表現(xiàn)為認(rèn)識(shí)和記憶力下降,主要因蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊引起[52]。而PDI家族的主要功能就是輔助蛋白質(zhì)折疊,因此也受到了關(guān)注。阿爾茨海默病(AD)的特點(diǎn)之一是產(chǎn)生過(guò)多的一氧化氮,使得PDI的活性半胱氨酸S-亞硝基化(SNO-PDI),從而抑制其活性,導(dǎo)致多聚泛素的堆積,并激活未折疊蛋白應(yīng)答[53-55]。最近研究表明:SNO-PDI不僅喪失了識(shí)別靶蛋白的能力,而且也喪失了抑制AD患者腦內(nèi)異常沉積的Tau蛋白相分離(相分離描述的是一種細(xì)胞內(nèi)不同組分相互碰撞形成液滴的現(xiàn)象)的能力。無(wú)論是野生型PDI還是活性位點(diǎn)中半胱氨酸突變后的PDI均能顯著抑制細(xì)胞中Tau蛋白的病理磷酸化和異常聚集,降低Tau蛋白導(dǎo)致的毒性,這對(duì)SNO-PDI和Tau蛋白在神經(jīng)疾病中的作用機(jī)制有了更進(jìn)一步的闡釋,并為治療疾病提供了思路[5]。

Stockwell課題組在68 000多個(gè)小分子庫(kù)中發(fā)現(xiàn)該16F16小分子可特異性抑制PDI和ERp57的活性,從而減弱其調(diào)控的聚谷酰胺誘導(dǎo)亨廷頓病細(xì)胞模型凋亡的作用[56]。后來(lái)又篩選出了具有神經(jīng)保護(hù)作用的一葉秋堿Securinine生物堿,確定了其在亨廷頓病細(xì)胞模型中具有保護(hù)作用[57]。該研究為尋找新的PDI抑制劑提供了方法和思路。

4.3 PDI與艾滋病

PDI不僅在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中起作用,也在細(xì)胞表面催化二硫鍵的形成。該功能有助于一些病毒和細(xì)菌的侵入,比如HIV病毒[58]、新城疫病毒[59]等。PDI通過(guò)催化糖蛋白gp120中二硫鍵的還原切割實(shí)現(xiàn)HIV-1與細(xì)胞的融合[60-61]。在HIV-1主要受體CD4附近有10～14個(gè)PDI簇,它們與PDI和HIV-1包膜糖蛋白gp120有單獨(dú)的結(jié)合位點(diǎn)。HIV-1的gp120與CD4結(jié)合,隨后PDI催化還原gp120中的二硫鍵,導(dǎo)致gp120的主要構(gòu)象發(fā)生變化,增強(qiáng)gp120與共同受體CCR5和CXCR4的作用。隨后,一種非共價(jià)結(jié)合gp120的病毒糖蛋白gp41重新排列并與細(xì)胞膜作用,導(dǎo)致病毒包膜與細(xì)胞膜融合,使得病毒侵入細(xì)胞[62]。因此,PDI也被認(rèn)為是一種治療HIV的潛在藥物靶點(diǎn)。

Osada課題組利用高通量的胰島素聚集濁度分析方法,從10 000種天然產(chǎn)物中篩選到可抑制PDI催化gp120還原的juniferdin先導(dǎo)化合物,從而阻止病毒粒子的進(jìn)入[58]。據(jù)報(bào)道,有一種宿主細(xì)胞蛋白SERINC5可通過(guò)改變病毒粒子上的gp120構(gòu)象或物理掩蔽特定的HIV-1病毒粒子表位來(lái)抑制HIV-1的感染性[63]。SERINC5抑制HIV-1感染的確切機(jī)制雖然尚不清楚,但可針對(duì)病毒粒子設(shè)計(jì)新的抗病毒策略。

4.4 PDI與血栓

血栓形成過(guò)程中PDI扮演著重要的角色[64]。自20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)PDI在血小板功能中起作用以來(lái),科學(xué)家致力于探究血小板PDI參與動(dòng)脈血栓形成的分子機(jī)制[65]。抑制細(xì)胞外PDI活性可以減少激光引起的血栓形成過(guò)程中血小板的聚集和纖維蛋白的沉積[66]。胞外PDI可能是預(yù)防和治療血管疾病的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。單寧酸作為一種PDI結(jié)合植物多酚能夠在體外抑制PDI還原酶活性,減少血小板表面硫醇的生成,抑制PDI活性、血小板活化和血栓形成[67]。通過(guò)下腔靜脈部分狹窄小鼠模型可知,PDI抑制劑PACMA31可抑制血小板沉積和纖維蛋白形成,并且抑制方式取決于骨髓細(xì)胞的組織因子。不過(guò)最近證明PDI家族的跨膜成員TMX1可以抑制血小板功能和血栓形成,這表明PDI在血栓形成中也可能具有相反的功能[68]。

5 結(jié)論與展望

綜上所述,PDI的結(jié)構(gòu)功能與疾病之間存在著密切的關(guān)系。目前,PDI抑制劑的開(kāi)發(fā)雖然取得了一定的進(jìn)展,但抑制劑只能抑制PDI的單個(gè)活性位點(diǎn),且PDI在不同亞細(xì)胞器中還有一些未知的功能,其在疾病發(fā)生和發(fā)展中的作用機(jī)制也尚未明確。未來(lái)本課題組將通過(guò)PROTAC技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)PDI的完全降解,并嘗試對(duì)其致病下游蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行闡述。相信隨著研究技術(shù)的不斷創(chuàng)新,PDI在疾病過(guò)程中的作用機(jī)制將被逐一解釋,相關(guān)疾病的預(yù)防和治療也將成為可能。